NK细胞免疫检查点小鼠模型

自然杀伤（NK）细胞源于骨髓造血干细胞，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。属于先天免疫系统的核心细胞，它们在免疫监视中扮演着非常重要的角色，随着对NK细胞的分子特征和功能的进一步探索，开发以NK细胞为基础的靶向免疫治疗可能引发肿瘤免疫治疗的新突破。

图1. NK细胞在癌症中的作用机制^[1]

虽然近年来基于T细胞免疫检查点，如PD-1/PD-L1和CTLA-4在临床抗肿瘤取得了较大的进展，但免疫治疗并不能对所有患者起到良好效果，目前的很多研究也表明T细胞免疫疗法具有一定的局限性。

NK细胞作为重要的天然免疫细胞之一，表达多种激活受体，包括CD16、NKG2D、SLAM家族成员和自然细胞毒性受体NKp30、NKp44和NKp46。NK细胞不需预先致敏就可以杀伤靶细胞，在抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节等方面具有重要作用，是抗癌效果良好的一种免疫细胞。因此目前基于NK细胞的肿瘤免疫疗法逐渐受到关注，如通过单克隆抗体靶向NK细胞免疫检查点治疗。

针对NK细胞免疫检查点机制研究和新药开发的需求，BioMice 百奥动物自主研发了相关的实验动物模型。

NK细胞免疫检查点

NKp46自然细胞毒性激动型受体（NCR）家族中的一员，NCR受体家族的另外两个成员是NKp30和NKp44，与其他两个成员只表达在人NK细胞上不同，NKp46同时表达在人和小鼠的NK细胞上。NKp46主要表达在NK细胞上，也表达在一些亚型T细胞和ILCs上。

NKp46配体和信号机制目前还不清楚，目前在研疗法有10项，有抗体药物和细胞疗法，抗体药物有单抗，双抗及多抗，开发机构有大学和Innate Pharma等企业。据文献报道，NK细胞衔接器可同时靶向肿瘤抗原，NKp46和CD16的多功能抗体。目前的药物都处于早期生物测试研发阶段和临床前阶段。

图2. 多功能NK细胞衔接器^[2]

B-hNKP46 mice

基本信息：

蛋白表达分析：

图3. 流式细胞术分析 B-hNKp46纯合小鼠NKp46的表达

通过流式细胞术分析野生型C57BL/6和B-hNKp46纯合小鼠中NKP46的特异性表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hNKP46小鼠的脾细胞，结果显示：用属种特异性NKP46抗体进行流式细胞术分析。在野生型C57BL/6小鼠细胞表面检测到mNKP46，在B-hNKP46纯合小鼠的NK细胞表面检测到hNKP46。

NKG2家族是NK细胞上的一类重要受体，包括NKG2A，NKG2B，NKG2C，NKG2D，NKG2E，NKG2F，NKG2H等成员。NKG2A是NKG2家族中的抑制性成员，NKG2A主要表达在NK细胞表面和部分T细胞（CD8⁺T细胞、Th2细胞以及NKT细胞）。NKG2A可与CD94形成异源二聚体，与其配体结合后，激活细胞内的抑制性信号通路，抑制NK细胞活性，从而使肿瘤避免被NK细胞杀伤。因此NKG2A抗体可以阻断这一抑制信号，释放NK细胞，起到抗肿瘤的作用。

HLA-E是NKG2A的天然配体。HLA-E广泛在所有组织细胞中表达，但表达水平较低，而其在癌细胞中被上调。研究发现, 多种肿瘤细胞高表达HLA-E, 且肿瘤浸润处的NK和CD8⁺T细胞高表达NKG2A^[3],  使肿瘤细胞逃避NK和CD8⁺T细胞的免疫识别。

图4. 肿瘤细胞表面高表达HLA-E进行免疫逃逸^[4]

B-hNKG2A mice

基本信息：

NK细胞蛋白表达分析：

图5. 流式细胞术分析B-hNKG2A杂合小鼠NKG2A的表达

通过流式细胞术分析野生型C57BL/6和B-hNKG2A杂合小鼠中NKG2A蛋白的表达。收集野生型C57BL/6和B-hNKG2A杂合小鼠的脾细胞，用种属特异性抗NKG2A抗体进行流式细胞术分析。结果显示：在C57BL/6小鼠和B-hNKG2A杂合鼠的NK细胞表面检测到mNKG2A，在B-hNKG2A杂合鼠的NK细胞表面检测到hNKG2A。（其中，用来检测human NKG2A的抗体是内部制备的monalizumab）

除了NKG2A单人源化小鼠，我们还开发了CD94/NKG2A双人源化小鼠，成为验证CD94/NKG2A靶点药物的有力工具。

B-hCD94/hNKG2A mice

基本信息：

体内药效：                                                                    

图6.B-hCD94/hNKG2A小鼠药效验证

抗人NKG2A抗体Monalizumab（来源合作方）联合PD-L1抗体Tecentriq（来源合作方）在B-hCD94/hNKG2A小鼠中的抗肿瘤药效。（A）纯合B-hCD94/hNKG2A小鼠 (雌性，6-7周龄，n=6) 皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞系。当肿瘤体积达到约100 mm3时，将小鼠分组，分组后给与抗人NKG2A和PD-L1抗体进行治疗，结果显示抗人NKG2A和PD-L1抗体能够显著抑制MC38肿瘤细胞的生长。（B） 治疗期间体重变化。如A图所示，抗人NKG2A抗体和PD-L1抗体在B-hCD94/hNKG2A小鼠体内能够有效控制肿瘤生长，表明B-hCD94/hNKG2A小鼠为PD-L1和NKG2A抗体联合治疗的体内评价提供了一个强大的临床前模型。

NKG2D为活化性受体，在NK细胞活化过程中起着非常重要的作用。人NKG2D主要表达于NK细胞、CD8⁺T细胞、γδT细胞以及一些自体反应的CD4⁺T细胞，发挥着清除损伤、病原体感染等细胞的生理功能，在抗肿瘤免疫应答过程中也发挥着重要作用。NKG2D不与CD94结合，其配体在人类是MICA、MICB和ULBP1，鼠中为Rae-1、H60和MULT1。正常情况下，这些配体表达在细胞表面，与NKG2D结合后可促进其下游的激活通路。这些配体在正常细胞中受到严格调节，而在肿瘤细胞等受损细胞上高表达，与NKG2D结合后直接活化或作为共刺激分子激活效应细胞，发挥免疫监视作用。

图7. NKG2D受体及其配体^[5]

B-hNKG2D mice

基本信息：

NK细胞蛋白表达分析：

图8. 流式细胞术分析B-hNKG2D纯合小鼠NKG2D的表达

通过流式细胞术分析野生型C57BL/6和B-hNKG2D纯合小鼠中NKG2D蛋白的表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hNKG2D小鼠的脾细胞，用种属特异性抗NKG2D抗体进行流式细胞术分析。结果显示，在C57BL/6小鼠NK细胞表面检测到mNKG2D。在B-hNKG2D纯合小鼠的NK细胞表面检测到hNKG2D。

CD16A主要表达在NK细胞、巨噬细胞和单核细胞表面，胞内有两条免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM），和抗原抗体复合物结合后，激活下游信号，从而促进抗体介导的细胞毒性（ADCC）。NK细胞不需要特异性的抗原刺激就可以发挥ADCC作用。在没有共刺激信号的情况下，未致敏的人NK细胞只能通过CD16A触发细胞毒活性^[6]。

CD16A的在研药物主要是针对肿瘤抗原的抗体药物，通过Fc改造提高对CD16A的亲和力或针对CD16A的双特异性抗体。

B-hCD16A mice

基本信息：

NK细胞蛋白表达分析：

图9. 流式细胞术分析B-hCD16A纯合小鼠CD16A的表达

图10. 流式细胞术分析B-hCD16A纯合小鼠PBMC水平

用流式细胞术分析结果显示，人源化小鼠NK细胞hCD16A表达水平与人PBMC相似。

以及我们还开发了CB-17 SCID背景的人源化小鼠。

B-hCD16A（CB-17SCID） mice

基本信息：

NK细胞蛋白表达分析：

图11. 流式细胞术分析B-hFCGR3A(CB-17 SCID)纯合小鼠FCGR3A的表达

用流式细胞术分析野生型CB-17 SCID小鼠和纯合B-hFCGR3A(CB-17 SCID)小鼠中FCGR3A的表达。收集野生型CB-17 SCID小鼠和纯合B-hFCGR3A(CB-17 SCID)小鼠的脾细胞。结果显示，人的FCGR3A只能在纯合B-hFCGR3A小鼠的NK细胞中只能检测到，野生型CB-17 SCID小鼠中未检测到。

展望

NK细胞因为有着不受MHC限制的细胞毒性、可以产生细胞因子和免疫记忆等功能，从而具有独特的抗肿瘤效应，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。T细胞免疫检查点疗法已经在临床肿瘤治疗上，显示出巨大临床转化潜力，相信随着NK细胞免疫检查点这支“潜力股”疗法的加入，未来肿瘤免疫疗法的适用范围可以得到更好的拓展。

参考文献

[1]Feixue Wang, Jennie Ka Ching Lau & Jun Yu. The role of natural killer cell in gastrointestinal cancer: killer or helper.Cell. 2021;40:717–730.

[2]Laurent Gauthier, Ariane Morel, Nadia Anceriz. Multifunctional Natural Killer Cell Engagers Targeting NKp46 Trigger Protective Tumor Immunity. Cell. 2019;177(7):1701-1713.

[3] Algarra I , A García-Lora, Cabrera T , et al. The selection of tumor variants with altered expression of classical and nonclassical MHC class I molecules: implications for tumor immune escape.[J]. Cancer Immunology Immunotherapy, 2004, 53(10):904-910.

[4]Montfoort N V ,  Borst L ,  Korrer M J , et al. NKG2A Blockade Potentiates CD8T Cell Immunity Induced by Cancer Vaccines - ScienceDirect[J]. Cell, 2018.

[5]Mercedes, B . F., Carolina, I . D., Norberto, W . Z.  Leveraging NKG2D Ligands in Immuno-Oncology.Immunol., 29 July 2021

[6] Bryceson,  Y . T.,March, M . E.,Ljunggren, H . G. & Long, E. O. Synergy among receptors on resting NK cells for the activation of natural cytotoxicity and cytokine secretion. Blood 107, 159-166, doi:10.1182/blood-2005-0401351(2006).