蛋白降解平台

人类参与生物学功能的蛋白大约有30,000多种，然而可成药的靶点只占据其中很少的一部分。探索不可成药靶点作为药物研发领域一个非常有挑战性但值得尝试的课题，因此备受关注。新兴技术例如靶向蛋白降解技术，将为该领域的发展提供极大助力。

蛋白靶向降解技术借助蛋白酶体和溶酶体这两大天然存在于人体内的细胞器对致病蛋白进行精准降解，目前主流的蛋白降解通路大致分为三类：基于泛素-蛋白酶体系统、基于内体-溶酶体通路和基于自噬-溶酶体通路。蛋白降解通过细胞自身的蛋白酶系统来降解靶点蛋白(POI)，从而调控蛋白水平，而非像传统药物那样通过抑制靶点蛋白的功能来发挥其药物作用。

为加速蛋白降解分子发现的过程，ICE团队针对PROTAC的特性和发挥作用的环节，积极布局对应的研发能力，专注于难成药靶点的药物研发，如：蛋白水平开展蛋白表达和纯化、生物物理学评价，蛋白亲和力、三元复合物的形成等；细胞水平可优化蛋白的降解与表达水平的检测，比如传统WB、数字化WB、通量化ICW和IFA、HiBiT敲入稳转细胞系的构建等技术，也可以利用商品化试剂盒如AlphaLISA，ELISA, HTRF等方法检测总蛋白的表达水平；同时结合细胞信号转导通路的检测、细胞活力与增殖等层次，多方位确定PROTAC分子在细胞中的活性；机制研究上可以通过ADME的方法、蛋白组学、结构生物学等手段，评价PROTAC分子在细胞内发挥作用的机制，也可以通过抑制剂的手段研究蛋白降解通路的特异性等等，形成了完整的蛋白靶向降解剂筛选平台。

以BTK的PROTAC为例，简要地描述ICE在PROTAC分子早期研发布局的常用分析方法。

细胞水平的降解，在优化方法的早期，会利用传统Western Blot实验看趋势，再结合数字化Western Blot（主要使用ProteinSimple的JESS设备）确定降解情况，用于后续筛选。

传统电泳Western Blot实验（ICE数据）

相比传统电泳Western Blot实验而言，JESS则显得更为便捷，制备样本流程简单，

目前ICE团队已用JESS顺利完成多项蛋白降解相关实验。

数字化Western Blot-JESS实验（ICE数据）

对于大量的PROTAC分子细胞活性筛选，也有适合于微孔板的方式，如可开发方法的In-cell western（ICW）和Immunofluorescence assay（IFA），ELISA、Alphalisa等技术。

ICW assay（ICE数据）

IFA assay（ICE数据）

对于通量的筛选，也可使用HiBiT内源敲入的细胞系，快速筛选可降解BTK蛋白的PROTAC分子，同时还可以看到降解的一些动力学过程，也可一并看到PROTAC分子对细胞增殖过程的影响。

HiBiT内源敲入的细胞系（ICE数据）

PROTAC具有分子量较大、氢键较多、溶解性较差、透膜性较差、稳定性较差等特性，需要尽早收集ADME相关数据，比如PROTAC分子在溶液中的溶解度、LogD，LogP，在血浆、肠液、胃液、原代肝细胞、筛选细胞实验培养基中的稳定性等等，透膜性也是另一个重要的参数，比如测试Caco-2，MDCKII, MDCKII-MDR1等细胞系中的Papp，做细胞实验所需细胞系中的透膜能力等等；还有代谢稳定性，在肝微粒体和原代肝细胞中的稳定性等等。结合体外的筛选平台，也可以通过靶点结合和生物标记物分子的检测，快速评价PROTAC透过肿瘤细胞的能力及与靶点的结合能力。对于脱靶效应的检测，也是非常重要，这个也受限于PROTAC的基本原理，当分子与非靶点蛋白有较弱或中等的亲和力时，也有可能带来脱靶降解，常会用到蛋白组学的方法来分析。

液质联用（LC-MS/MS）可以快速结合细胞学化合物处理的条件，简单便捷分析一些参数，比如细胞对化合物的摄取量、非特异结合的量、生物转化的量、化合物溶解性及稳定性等等，这些分析简单的构成了细胞生物利用度，可以从一定程度上解释化合物在酶学和细胞学实验体系中活性的相对差异。爱思益普目前已经可以提供此类试验分析，可及时便捷地为大家提供troubleshooting的试验数据。

目前新的蛋白降解方式不断出现，如分子胶，LYTACs，AUTACs，ATTECs，RIBOTACs，等等。对于膜蛋白而言，ICE有着丰富的稳转细胞系储备，如离子通道、GPCR受体等，希望在膜蛋白的降解领域能给大家更多的支持，为中国蛋白降解领域的药物研发做一些事。