FLAG标签蛋白免疫沉淀试剂盒

武汉戴安生物技术有限公司成立于2015年，位于武汉光谷生物城生物技术研究院，是一家由资深免疫学专家和海外留学人员创建的高科技生物技术企业。公司专注于诊断试剂及其核心原料的研发生产及技术服务工作。公司拥有完善的蛋白质表达体系，抗体制备体系，诊断试剂研发体系，研发人员拥有十余年从业经验，技术积累深厚，设备精良完善，在重组蛋白质表达纯化、天然蛋白质提取、抗体研发和生产方面达到行业顶尖水平，已建立了从诊断试剂抗原抗体原料开发，到诊断试剂制备的研发生产路线，拥有诊断用抗原抗体的研发及放大生产技术平台，生化试剂大包装研发生产平台，核心产品包括SAA，AFP，PCT，铁蛋白等项目的抗体、校准品和生化试剂。公司也为客户提供专业的抗体定制及相关技术服务，包括科研用多克隆抗体和单克隆抗体定制，药物阻断用抗体筛选，中和抗体制备等技术服务。

1.背景信息

Flag-Tag（DYKDDDDK）， 常用于真核蛋白质重组表达标记。 FLAG标签（DYKDDDDK）蛋白免疫沉淀(Immunoprecipitation)试剂盒， 主要成分是Anti-Flag亲和纯化凝胶（Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel），由高品质的Flag兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于Flag标签融合蛋白的纯化及免疫（共）沉淀(Immunoprecipitation, Co-Immunoprecipitation)。

2. 性能指标

应用范围： 可用于Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-Flag–Protein），N端Flag融合蛋白（Flag–Protein）,C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）及中部Flag融合蛋白的纯化及免疫（共）沉淀。

载量： 1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-Flag 兔多克隆抗体，可至少做40次Flag标签融合蛋白的免疫（共）沉淀。

保存方法： 在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20℃可保存1年。

3. 试剂盒组成

注意事项（开箱前必读）

 本试剂盒冷藏条件下运输，如果暂时不用，请将纯化柱（空柱）取出，室温保存；亲和凝胶保存于-20℃；试剂盒及其它成分保存于4℃。

 有文献显示，与传统的Glycine-HCl洗脱液相比，本试剂盒提供的pH3.0的Arginine-HCl做为洗脱液，可以减少蛋白质变性，延长抗体亲和纯化柱的使用寿命。客户也可以根据实际情况自行选用配制。

4. 使用方法（所有步骤尽可能在冰上进行，以避免目标蛋白质降解。）

4.1  细胞裂解液制备

4.1.1    悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中， 1000rpm离心5分钟。贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离心管中1000rpm离心5分钟。

4.1.2    预冷的PBS工作液重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。重复一次。

4.1.3    根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液， 反复吹打后冰上放置10-20min，让细胞充分裂解。

4.1.4    用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。冰上放置30min之后，12000rpm，4℃离心10min。取上清，-80℃冷冻保存。

4.2  装柱及孵育

4.2.1    温和重悬Anti-Flag亲和纯化凝胶，至均匀混合，用剪去末端的枪头吸取适量的凝胶至空纯化柱中。通常50μl凝胶（含25μl琼脂糖颗粒）可沉淀约30μgFlag标签融合蛋白。如果设置对照组，应同时准备对照组凝胶及纯化柱。

4.2.2    将纯化柱安装在收集管上，5000-8000g离心30秒，弃去流穿液，保留沉淀。

4.2.3    1ml PBS重悬凝胶，5000-8000g离心30秒，弃去流穿液，重复五次。

4.2.4    加入适量含有Flag标签融合蛋白（或者阳性对照，阴性对照）的细胞裂解液， 4℃旋转孵育过夜。

4.2.5    根据实验目的，在4.3和4.4中选择合适的方法进行蛋白质洗脱。

4.3  酸性洗脱液酸性洗脱（该步骤使用的收集管请使用自备的灭菌1.5ml离心管，收集管中预先放入中和液50μl）

4.3.1    将纯化柱安装在收集管上，5000-8000g离心30秒，弃去流穿液，保留沉淀。

4.3.2    1ml PBS重悬凝胶，5000-8000g离心30秒，弃去流穿液，重复五次。

4.3.3    预冷的pH 5.0酸性预洗液重悬凝胶，5000-8000g离心30秒，弃去流穿液，重复五次，以除去非特异性结合蛋白。

4.3.4    预冷的pH 3.0的酸性洗脱液重悬凝胶，5000-8000g离心30秒， 用新的灭菌1.5ml离心管收集洗脱液（收集管中预先放入中和液50μl），重复十次，每次收集1ml。

注意：酸性环境会缩短亲和纯化柱的使用寿命，引起目的蛋白质变性，应尽量缩短亲和纯化柱与酸性洗脱液的接触时间。

4.3.5    用紫外检测仪测定收集峰, 合并收集峰。

4.3.6    SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。

4.4  变性洗脱检测目的蛋白

4.4.1    将纯化柱安装在收集管上，5000-8000g离心30秒，弃去流穿液，保留沉淀。

4.4.2    1ml PBS重悬凝胶，5000-8000g离心30秒，弃去流穿液，重复五次。

4.4.3    加入足量 2×蛋白上样缓冲液，移入1.5ml离心管中，煮沸5 min，冷却至室温。

4.4.4    取上清进行SDS-PAGE及Western Blotting检测。

5.   使用中的常见问题