FLAG标签亲和凝胶

武汉戴安生物技术有限公司成立于2015年，位于武汉光谷生物城生物技术研究院，是一家由资深免疫学专家和海外留学人员创建的高科技生物技术企业。公司专注于诊断试剂及其核心原料的研发生产及技术服务工作。公司拥有完善的蛋白质表达体系，抗体制备体系，诊断试剂研发体系，研发人员拥有十余年从业经验，技术积累深厚，设备精良完善，在重组蛋白质表达纯化、天然蛋白质提取、抗体研发和生产方面达到行业顶尖水平，已建立了从诊断试剂抗原抗体原料开发，到诊断试剂制备的研发生产路线，拥有诊断用抗原抗体的研发及放大生产技术平台，生化试剂大包装研发生产平台，核心产品包括SAA，AFP，PCT，铁蛋白等项目的抗体、校准品和生化试剂。公司也为客户提供专业的抗体定制及相关技术服务，包括科研用多克隆抗体和单克隆抗体定制，药物阻断用抗体筛选，中和抗体制备等技术服务。
现货标签内参抗体均为自主研发，严格质检，质量优良。

一． 背景信息

Flag-Tag（DYKDDDDK）， 常用于真核蛋白质重组表达标记。 FLAG标签（DYKDDDDK）亲和凝胶，由高品质的Flag兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于Flag标签融合蛋白的亲和纯化及免疫（共）沉淀。

二． 性能指标

应用范围： 可用于Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-Flag–Protein），N端Flag融合蛋白（Flag–Protein）和C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）的亲和纯化及免疫（共）沉淀。

载量：    1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-Flag兔多克隆抗体，可纯化或沉淀至少1.2mg Flag融合蛋白。

强度：   重力柱纯化，可反复使用5次以上。

成分：   共价偶联Anti-Flag抗体的Sepharose 4B琼脂糖颗粒,  1ml溶于2ml PBS+50%甘油中。

保存方法： 在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液中，-20℃可保存1年。

三． 使用方法

细胞裂解液制备

1)   悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中，  1000rpm 离心5分钟。贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离心管中1000rpm离心5分钟。

2)   预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。重复一次。

3)   根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液， 反复吹打后冰上放置10-20min，让细胞充分裂解。

4)   用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。冰上放置30min之后，12000rpm，4℃离心10min。取上清，冷冻保存。

应用一. 免疫（共）沉淀法检测FLAG标签蛋白质

1)   重悬Anti-FLAG标签亲和凝胶至均一，转移30ul混合液(约含15ul凝胶)至离心管中，加入5倍凝胶体积PBS，5000rpm x 30sec，弃上清，重复该步骤清洗凝胶三次。

2)   加入适量含有目标蛋白的真核细胞裂解液，室温孵育2hr或者4℃孵育过夜。

3)   加入5倍凝胶体积PBS，用上述离心法清洗凝胶三次； 预冷的5倍凝胶体积pH 5.0酸性预洗液洗涤凝胶, 除去非特异性结合蛋白。离心，弃上清。

4)   加入5x上样缓冲液，煮沸5min，冷却至室温并离心。

5)   取上清进行SDS-PAGE或Western Blotting检测。

应用二. 亲和纯化FLAG标签蛋白质

1)   根据使用目的选用重力柱或离心管，移入适量亲和凝胶，10倍凝胶体积PBS清洗亲和凝胶。

2)   加入适量含有目标蛋白的真核细胞裂解液，室温孵育2hr或者4℃孵育过夜。

3)   5倍凝胶体积PBS洗凝胶三次； 用预冷的5倍凝胶体积pH 5.0酸性预洗液洗涤纯化凝胶, 除去非特异性结合蛋白。根据需要从以下两种洗脱液中选择

a. 预冷的10倍柱体积pH 3.0的酸性洗脱液进行洗脱， 每次收集1ml, 收集管中预先放入中和液50μl。注意：酸性环境会缩短亲和纯化凝胶的使用寿命，应尽量缩短亲和纯化凝胶与酸性洗脱液的接触时间。

b. 加入10倍凝胶体积 3×Flag peptide洗脱液进行洗脱， 每次收集1ml。

4)   用紫外检测仪测定收集峰, 合并收集峰。

5)   SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。       

四． 推荐缓冲液配方

以下配方仅为本公司推荐，客户应根据具体情况进行调整。

细胞裂解液：  150mM NaCl,  50 mM Tris-HCL(PH8.0)，1% Triton X-100，5 mM EDTA

3×Flag peptide洗脱液：     3xFlag peptide干粉，使用前溶于10 ml 1xPBS，工作浓度为100μg/ml

酸性洗脱液：  0.15M Gly-HCl缓冲液，pH3.0

中和液： 1M Tris HCl缓冲液，pH8.0

10xPBS： 1.5M PBS buffer， pH7.5，with 2‰ Azide （使用时须用双蒸水稀释10倍）

酸性预洗液：  0.15M PBS buffer，pH5.0