FLAG标签蛋白纯化试剂盒

1背景信息

Flag-Tag（DYKDDDDK）， 常用于真核蛋白质重组表达标记。 FLAG标签（DYKDDDDK）融合蛋白纯化试剂盒， 主要成分是Anti-Flag亲和纯化凝胶（Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel），由高品质的Flag抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于Flag标签融合蛋白的亲和纯化。

2性能指标

应用范围： 可用于Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-Flag–Protein），N端Flag融合蛋白（Flag–Protein）和C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）的亲和纯化。
载量： 1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联8mg Anti-Flag 抗体，可结合至少1.2mg Flag融合蛋白。
强度：重力柱纯化，可反复使用5次以上。
保存方法： 在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20℃可保存1年。

3试剂盒组成

4注意事项（开箱前必读）

本试剂盒冷藏条件下运输，如果暂时不用，请将纯化柱（空柱）取出，室温保存。亲和凝胶于-20℃保存；试剂盒及其它成分保存于 4℃。
3×Flag peptide溶解方法：该多肽为轻质粉末，开盖前应离心。多肽本身为酸性，建议将40ul 10xPBS溶液加至1mg多肽粉末中，彻底溶解后，加入160ul双蒸水，制成5mg/ml储存液，-20℃保存。使用时用1xPBS稀释至需要的浓度。按需求浓度稀释至工作浓度。
有文献显示，与传统的Glycine-HCl洗脱液相比，本试剂盒提供的pH3.0的Arginine-HCl做为洗脱液，可以减少蛋白质变性，延长抗体亲和纯化柱的使用寿命。客户也可以根据实际情况自行选用配制。

5使用方法（所有步骤尽可能在冰上进行，以避免目标蛋白质降解。）

细胞裂解液制备
悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中，   1000rpm离心5分钟。贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离心管中1000rpm离心5分钟。
预冷的PBS工作液重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。重复一次。
根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液， 反复吹打后冰上放置10-20min，让细胞充分裂解。
用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。冰上放置30min之后，12000rpm，4℃离心10min。取上清，冷冻保存。

装柱及孵育
温和重悬Anti-Flag亲和纯化凝胶，至均匀混合，用剪去末端的枪头吸取适量的凝胶至空纯化柱中。
10ml（10倍柱体积）PBS清洗Anti-Flag亲和纯化柱。
加入含有目标蛋白的真核细胞裂解液， 4℃旋转孵育过夜。
根据蛋白质性质选择洗脱方法，具体可参见第5部分问题和建议5.1。


3xFlag peptide洗脱液竞争洗脱
用1xPBS配制3×Flag peptide洗脱液，终浓度为500μg/ml，也可根据具体情况自行调整工作浓度。
加入2ml 3×Flag peptide洗脱液（10倍柱体积），轻柔混匀，浸泡0.5小时后，收集洗脱液，每次收集1ml。如有必要，再次加入2ml 3×Flag peptide洗脱液（10倍柱体积），重复洗脱一次。
用紫外检测仪测定收集液, 合并收集液。
SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。


酸性洗脱液酸性洗脱
5ml PBS（5倍柱体积）洗柱三次。
预冷的5ml pH 5.0酸性预洗液（5倍柱体积）洗涤纯化柱，除去非特异性结合蛋白。
预冷的10ml pH 3.0的酸性洗脱液（10倍柱体积）进行洗脱， 每次收集1ml, 收集管中预先放入中和液50μl。注意：酸性环境放置太久会缩短亲和纯化柱的使用寿命，应尽量缩短亲和纯化柱与酸性洗脱液的接触时间。
用紫外检测仪测定收集峰, 合并收集峰。
SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。


纯化柱的清洗与再生（洗脱后须立即进行纯化柱的清洗与再生）
10倍柱体积PBS清洗纯化柱。
酸性洗脱液（pH3.0）洗涤纯化柱，每次三倍柱体积。
中和液（pH8.0）洗涤柱子三次，每次三倍柱体积。
检测流穿液pH，如为中性，则进行下一步；如仍为酸性，则重复4.5.2和4.5.3。
用1xPBS（含50%甘油，0.2‰叠氮钠）清洗，再加入适量该保存溶液至填料中，保存在-20℃。

6保存

纯化产物加入50%甘油保存在-80度，用于后续功能性实验。   

7问题与建议

如何选择竞争性洗脱和酸性洗脱？
3×Flag peptide洗脱液与蛋白质上的Flag标签竞争亲和纯化柱上的抗体，使蛋白质与抗体的结合被取代而脱离纯化柱，从而被洗脱下来。这种洗脱的特点有：
洗脱条件温和，一般不会造成蛋白质变性；有利于亲和纯化柱的保存和反复使用。
由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以往往需要较长的时间和较大的洗脱体积。
特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。基本上不会有anti-Flag的抗体被洗脱下来。
酸性洗脱是通过改变环境pH，破坏抗原抗体的结合从而使蛋白质脱离纯化柱被洗脱下来，这种洗脱方式的特点有：
成本低廉。
纯化速度较快。
酸性pH会造成部分蛋白质变性，引起目的蛋白质沉淀，降解或失活。
有时会有少部分Anti-Flag抗体被洗脱，造成非特异性信号。
反复使用酸性洗脱，会造成抗体脱落，也会破坏纯化柱的理化性质，减少纯化柱的反复使用次数。

常见的蛋白质的后续处理方法有哪些？
透析与超滤
透析法是利用半膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜而蛋白留在超滤管内。两者都可以达到换液的目的。使用时需注意选择正确分子量的透析袋和超滤管。
过滤除菌
可采用微孔滤膜滤器操作，让蛋白质溶液通过0.22um滤膜，即可达到除菌的目的。
蛋白质定量鉴定浓度。
SDS-PAGE鉴定纯度。

如何选择细胞/组织裂解液？
本试剂盒提供的细胞裂解液成分如下：

使用前可加入1%PMSF和0.5%原钒酸钠, 或其他蛋白酶抑制剂，避免蛋白质降解。
客户可根据目的蛋白的性质和后继用途，自行配制细胞裂解液及选择是否加入蛋白酶抑制剂。
 

使用中的常见问题及解决方案