人肾上腺素（ADR）

人肾上腺素（ADR） 产品编号：HEA005 Elisa 试剂盒使用说明书 用途 本试剂盒仅供科研使用，定量检测细胞液、体液、组织、血清、血浆等标本中肾上腺素（ADR）的含量。 原理: 采用双抗体夹心法测定人肾上腺素 ADR 水平。用纯化的人肾上腺素 ADR 抗体包被微孔板，制成固相载体，实验时依次在微 孔板中加入样本及标准品，并加入 HRP 标记的 ADR 抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，反复洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，再用硫酸终止反应，转变成黄色。颜色的深浅和样品中的 ADR 含量呈正相关。采 用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度（OD 值），根据标准曲线，计算测试样品中 ADR 浓度。 试剂盒组成 序号 名称 规格 1 酶标包被板 96 孔*1 可拆卸板 2 酶结合物 10ml*1 瓶 3 标准品 1ml*6 瓶 4 缓冲液 6ml*1 瓶 5 显色剂 A 液 6ml*1 瓶 6 显色剂 B 液 6ml*1 瓶 7 终止液 6ml*1 瓶 8 浓缩洗涤液（*100） 50ml*1 瓶 9 封板膜 1 张 10 使用说明书 1 份 备注 1.标准品 1～6 的浓度分别为：0、50、100、250、500、1000pg/ml 2.缓冲液仅适用于细胞液、体液以及组织匀浆样品的检测。 实验材料与试剂配制： 1. 仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，滤纸。 2. 缓冲液使用：加5ul 的缓冲液于50ul 的样品中，如果样品量不够或者不确定，缓冲液和样品的混合比例不要小于1:10即可。 混匀，静置1小时备用（如果标本是血清或者血浆，此步骤忽略）。 3. 洗液的配制：按1:100的比例配制洗液备用。 样品收集、处理及保存 1. 细胞培养上清：适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液，以1000×g离心15分钟，收集上清。 2. 细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104 -106 /ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或 者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。 3. 血清：在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。 4. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20 分钟后，以1000×g离心15分钟，收集上 清。 5. 体液：包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。 6. 组织标本：切取组织标本，称取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000 rmp离心20 分钟，收集上清进行检测。 7. 样品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 8. 保存：如果样品不能立即检测，应将其分装，-70 ℃保存，避免反复冷冻。保存过程中如出现沉淀，应再次离心。血液标 本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解 冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作步骤： 1. 取出试剂盒，室温（20-25℃）放置 30 分钟。 2. 分组：取出 96 孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准 品组（6 个浓度）、空白孔、待测样品组。 注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。 3. 加样：依照标准品的顺序分别加入 50ul 的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入 50ul 的蒸馏水；其余微孔中加入 50ul 的待测样本。 4. 加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入 100ul 的酶标溶液（空白对照孔除外）。 5. 温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于 37℃恒温孵育 1 小时。 6. 洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置 15-30s，充分清洗酶标板 5 次，用吸水纸彻底拍干。 7. 显色：各孔加入显色剂 A 液 50ul 后，再加入显色剂 B 液 50ul。 8. 终止：25-37℃下避光反应 10-15 分钟，加入 50ul 终止液。 9. 读板：在 450nm 波长读取各孔的 OD 值。 注：读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹，读板时间控制在终止反应后的 30 分钟内，以免影响准确性。 数据计算 1. 绘制标准曲线：各标准品 OD 值减去底色即减去空白孔 OD 值，以 6 个标准 品 的 OD 值为纵坐标 y，以标准品的浓度为横坐标 x，绘制曲线图，如图示，并 计 算出回归方程 y=ax+b。 2. 将待测样品的 OD 值代入方程式，计算各组样品浓度，再乘以稀释倍数，即 为 样品的实际 ADR 浓度。 3. 敏感度：1.0 pg/ml 注意事项： 1. 实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。 2. 加样：加样时，要控制加样速度，避免第一孔与最后一孔间的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响 实验的准确性以及重复性。 3. 孵育：严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。 4. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。 5. 建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。 6. 建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商联系， 如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。 安全性 1． 避免人体直接接触显色剂A、B和终止液。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。 2． 实验中不要进食、抽烟或使用化妆品。 3． 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。 保存条件及有效期： 1.试剂盒保存：2-8℃ 2.有效期：6个月