纳米抗体技术发现平台

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发布时间：

2023-10-17 14:58:10
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泰克生物科技（天津）有限公司
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泰克生物着力于为客户提供高质量，且具性价比的抗体药物前期发现技术服务。我们在药物抗体发现方面拥有10年的项目开发经验和心得，积累了充足的抗体定制和重组蛋白生产经验。基于噬菌体展示技术（Phage Display Technology）平台的服务，泰克生物能够为客户提供一系列包括但不限于兔源、鼠源、羊源、驼源及牛源等不同物种的单克隆抗体制备服务，及其配套的完整可追溯性文件体系。

噬菌体展示技术（即：纳米抗体技术）是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，通常为M13噬菌体的P3蛋白，使外源基因随外壳蛋白的表达而展示到噬菌体表面的生物技术。噬菌体展示的优势在于其展示纳米抗体文库中变异抗体基因的多样性，各个重组噬菌体（常用噬菌体为M13噬菌体）表面展示出不同的抗原结合域，相较于传统杂交瘤方法，噬菌体展示技术在抗体基因展示与筛选层面则具有非常突出的效率优势（如杂交瘤融合效率一般<0.4%，即1000次融合细胞中，大概4个融合子；而噬菌体展示轻松可以获得10⁸-10⁹个正确抗体序列）。

█ 噬菌体展示抗体文库构建服务

泰克生物可为客户提供驼源VHH纳米抗体库，scFv抗体库，Fab抗体文库构建以及筛选服务。其中VHH纳米抗体库，又称为驼源重链抗体文库，抗体分子量大小为15kDa，是驼源动物产生的特有的一种抗体。目前被广泛应用于CarT/Car-NK治疗性的驼源VHH抗体（又被称为纳米抗体）噬菌体展示发现路径如图1所示：

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图1基于噬菌体技术平台的驼源VHH抗体发现服务

泰克生物还可以提供一系列的抗体验证服务，例如：通过GST pull-down或CO-IP策略检测展示的蛋白质与其他分子之间的相互作用或分离特定目标、抗原抗体BLI亲和力测定、细胞功能验证及细胞系体外验证等。

泰克生物提供的纳米抗体库具有丰富的多样性和规模，是筛选所有抗原类型以及选择具有高亲和力的功能性抗体的理想选择。凭借多年的经验，我们开发了多种噬菌体平台，可以为您定制特定的纳米抗体文库。如果您有兴趣开展噬菌体展示抗体项目，或者其他相关服务，例如抗体测序、scFv、Fab和Fc 融合蛋白等，请联系我们！

█ 服务内容和周期

步骤	服务内容	QC标准	周期
Step1:蛋白表达	(1) 密码子优化+基因模板合成+表达载体构建； (2) 质粒抽提+转染（哺乳表达系统）目的蛋白检测（WB，SDS-PAGE）； (3) 蛋白表达放大+蛋白亲和纯化；	交付：表达载体，克隆甘油菌，重组蛋白3-3.5mg，纯度>85%，标准实验报告	4-6周
Step2:动物免疫	(1) 动物免疫4次，加强免疫一针，共计免疫5针； (2) 免疫前采集阴性血清，第4针采血进行ELISA检测血清效价； (3) 若第4针血清抗体效价（蛋白抗原>10⁵；多肽抗原>10⁴）满足要求，则采血前7天再次加强免疫1针，如不满足要求，则继续常规免疫； (4) 效价合格，采血分离单核细胞；	动物：背景清晰（年龄，性别，防疫情况）；免疫：蛋白抗原>10⁵；多肽抗原>10⁴；采血：数量100ml以上； PBMC细胞：>10⁵/vial	8-10周
Step3:模板cDNA制备	(1) PBMC总RNA提取（RNA提取试剂盒） (2) 高保真RT-PCR制备cDNA（反转录试剂盒）	cDNA：反转后>1ug/ul，胶图分布均匀； cDNA模板总量>150ug；	1 天
Step4:噬菌体展示文库构建	(1) 以cDNA为模板，两轮PCR法扩增VHH基因； (2) 噬粒构建与转化： VHH基因拼接噬菌粒载体，电击转化TG1宿主菌，构建抗体库，混合建库电击次数不低于30次（单靶点建库，电击次数不低于15次）； (3) 鉴定：随机挑选24个克隆，PCR鉴定阳性率+插入率 (4) 辅助噬菌体准备：M13噬菌体扩增+纯化； (5) VHH展示文库救援	文库阳性率：>90%；文库插入性率：>90%；库容：>10⁸	1-2周
Step5:文库筛选（3轮筛选）(固相筛选)	(1) 抗原包被（单个蛋白筛选，常规默认是固相筛选法或磁珠分选；细胞筛选方法需要单独核算费用）； (2) 默认3轮筛选：压力筛选，最大限度去除非特异性抗体； (3) 挑取96个克隆扩增噬菌体+IPTG诱导表达+ELISA检测阳性克隆； (4) 挑取全部阳性克隆进行基因测序（>20个，多达96个）；	ELISA阳性标准：P/N>3； VHH筛选标准：CDR氨基酸序列不同	2-3周
Step6:抗体验证（体外验证）	(1) 将获得的抗体序列构建合适的表达载体进行表达+亲和纯化+抗体蛋白定量； (2) Elisa验证抗体与抗原结合，进行下游验证（交付EC50数据）; (3) BLI法验证抗体亲和力； (4) 细胞功能验证：流式验证； (5) 验证细胞系（抗原受体过表达细胞系）；	交付：表达载体，克隆菌株，表达菌株，重组抗体蛋白1mg，纯度90%；快速亲和力测定结果；	4-6周