导读动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种缓慢型临床疾病，是心血管疾病的核心，是引起心肌梗死、中风和周围血管疾病的导火索[1]。脂质代谢异常造成的脂质沉积是动脉粥样硬化最直接的致病因素，受累动脉病变从内膜开始，积聚的脂质外观呈黄色粥样，一般先有脂质和复合糖类的异常沉积，进而纤维组织增生及钙质沉着，并伴随着动脉中层逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、失去弹性以及血管腔狭窄。随着血管逐渐狭窄，病变又会累及不同器官，出现头晕、心痛、胸闷和顽固性高血压、糖尿病等症状，可以说动脉粥样硬化就像一颗“不定时炸弹”。目前我国是全球动脉粥样硬化疾病高发区，60岁以上老年人的发病率高达79.9%；并且近几年偏于年轻化趋势，严重影响人类的生命健康。动脉粥样硬化及动脉斑块简图[2]动脉粥样硬化是多因素共同作用引起的，发病机制较为复杂且尚未完全阐明。目前来看，大小鼠是动脉粥样硬化研究中最常用的物种，尽管有局限性，但其与人类的动脉粥样硬化过程的许多关键特征是相似的，仍然是动脉粥样硬化模型的首选物种。动脉粥样硬化的发展与胆固醇运输颗粒低密度脂蛋白（LDL）密切相关[3]，主要为载脂蛋白E（ApoE）基因和低密度脂蛋白受体（LDLR）基因，可为动脉粥样硬化的治疗和预防提供参考依据。B-Apoe KO小鼠载脂蛋白E（Apolipoprotein E, ApoE）是一种与脂质颗粒相关的载体蛋白，主要由肝脏和外周组织中的巨噬细胞产生，是血浆脂蛋白的核心成分。ApoE将脂蛋白、脂溶性维生素和胆固醇输送到淋巴系统，然后进入血液，防止富含胆固醇的颗粒在血浆中积聚，是预防、治疗动脉粥样硬化血管疾病的主要靶点基因。研究表明，ApoE能够通过多种方式预防动脉粥样硬化[4]：促进循环系统中富含甘油三酯的脂蛋白的有效吸收；维持正常的巨噬细胞脂质稳态；调节免疫功能等。百奥动物BioMice利用基因编辑技术构建了B-Apoe KO小鼠。利用高脂饮食喂养诱导的小鼠胆固醇水平升高程度加大，硬块的形成进一步加剧，类似于人类动脉粥样硬化及动脉粥样硬化性心脏病中的饮食依赖性，可用于心血管疾病及阿尔兹海默症的研究。B-Apoe KO小鼠特殊饮食诱导动脉粥样硬化模型的建立（A-B）小鼠在12周和20周时的动脉粥样硬化斑块。（C-D）主动脉窦在第12周和第20周的油红结果。（E）12周时主动脉弓大体染色。12周时动脉粥样硬化小鼠模型的组织染色和血液生化结果（A）主动脉窦的H&E结果增加。（B-C）免疫组化显示α-SMA和F4/80的表达。（D）血清ALT、AST、TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。数值以平均值±SEM表示。**p<0.01，***p<0.001。B-Ldlr KO大鼠低密度脂蛋白受体（Low density lipoprotein receptor, LDLR）是一种存在于网格蛋白包被的凹坑中的细胞表面受体，介导血浆中主要携带胆固醇的脂蛋白LDL的内吞作用，并且它能够结合APOE蛋白，从而清除血液中的脂蛋白颗粒，调节血浆胆固醇水平[5]。百奥动物BioMice利用基因编辑技术构建了B-Ldlr KO大鼠模型。尤其是当喂食高脂饮食时，这使Ldlr敲除大鼠成为研究动脉粥样硬化的良好模型进而具有重要的临床意义。这种大鼠可用于支持许多领域的研究，包括糖尿病、肥胖研究、过早患冠心病的风险及代谢研究等。B-Ldlr KO大鼠的模型验证及分析纯合Ldlrtm1/Bcgen大鼠在4个月大时表现出显著升高的血清胆固醇水平。PCSK与动脉粥样硬化的关系除了ApoE和LDLR基因外，还有其他与血脂调控相关的类似于PCSK9等靶点用于构建动脉粥样硬化模型，这些模型具有不同的致病机制和病理表型，助力动脉粥样硬化和高脂血症等疾病的研究及治疗药物的开发[6]。PCSK9是近年来在降脂药开发领域研究的一个新兴靶点，主要在肝脏中表达。PCSK9在LDL-C代谢中发挥重要作用。在肝细胞质膜，分泌的PCSK9的催化结构域与LDL-R结合并被内化，进入内体途径。内体的低pH值增强了PCSK9对LDL-R的亲和力，防止受体再循环到细胞表面。而PCSK9与LDL-R结合后再与LDL-C结合形成新的复合体进入溶酶体中一起被降解，最终导致LDL-R 减少，LDL-C的降解随之减少，从而使LDL-C的水平升高[7]。 PCSK9 在 LDL 受体 (LDL-R) 代谢中的作用[7]脂质代谢分析B-hPCSK9 小鼠的脂质代谢分析。分析 B-hPCSK9 小鼠和野生型 C57BL/6 小鼠（n=36，6周）TG、TC、LDL-C和 HDL-C 的血浆浓度。B-hPCSK9小鼠和野生型 C57BL/6 小鼠之间无差异。TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇。药效验证抗人 PCSK9 抗体在 WD 诱导 B-hPCSK9 小鼠的体内有效性。B-hPCSK9 小鼠给予Alirocumab（内部）/Evolocumab（内部）或同型对照抗体（单次给药，s.c.）(n=8，雄鼠)。在第-5、1、3、5和8天采集血液进行分析。与同型对照相比，抗人 PCSK9 抗体给药组小鼠的血清 LDL-C(A) 和 TC(B) 水平降低，表明抗人 PCSK9 抗体可有效控制雄性 B-hPCSK9 小鼠的血脂。数值表示为平均值±SEM。TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇。WD：西方饮食。抗人 PCSK9 抗体上调 B-hPCSK9 小鼠的 LDLR 水平。B-hPCSK9 小鼠给予Alirocumab（内部）/Evolocumab（内部）或同型对照抗体（单次给药，s.c.）(n=6，雄鼠)。在第8天采集肝组织用于 ELISA 分析。与同种型对照相比，抗人 PCSK9 抗体给药组小鼠中 LDLR 水平上调。数值表示为平均值±SEM。LDLR：低密度脂蛋白胆固醇受体。WD：西方饮食。表1. 动脉粥样硬化相关小鼠模型参考文献[1]Besa Emini Veseli，Paola PerrottaEuropean Journal of Pharmacology，Animal models of atherosclerosis，Volume 816, 5 December 2017.[2]Wikipedia/CC BY 3.0[3]Godfrey, S, Getz, Catherine, A, & Reardon. (2012). Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology.[4]Jean Davignon, Jeffrey S.Cohn, et al. Apolipoprotein E and atherosclerosis: insight from animal and human studies.Clinica Chimica Acta.Clinica Chimica Acta.[5]Brown, Michael S, and Joseph L. Goldstein. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science232.4746(1986): 34-47.[6]Gresham, G. A.  (2017). Animal models of atherosclerosis. Biomedical Reports, 6(3), 259-266.[7]Hess, C. N., Low Wang, C. C. & Hiatt, W. R. PCSK9 Inhibitors: Mechanisms of Action, Metabolic Effects, and Clinical Outcomes. Annual review of medicine 69, 133-145

嗜酸性胃炎(EG)、嗜酸性十二指肠炎(EoD)和嗜酸性食管炎是一类严重的炎症性疾病，表现为胃、十二指肠和食管外嗜酸性粒细胞水平升高。目前没有针对此种疾病的有效疗法，采用全身性的类固醇激素疗法能够改善疾病症状，但长期使用会带来严重副作用。SIGLEC8因为具有强大的嗜酸性粒细胞促凋亡和肥大细胞抑制活性，并选择性表达在这些关键的炎症效应细胞的作用，被认为是很有前途的抗炎靶点。靶点概述Siglecs（结合唾液酸的免疫球蛋白型凝集素）是主要在造血系统细胞上发现的一类免疫调节受体。迄今为止，已在人类中鉴定出14种SIGLEC，主要在各种白细胞群上表达。[1]根据进化上的保守程度分为进化保守型和非保守型两类SIGLEC。保守型SIGLEC由SIGLEC1、SIGLEC2、SIGLEC4和SIGLEC15组成，它们在哺乳动物中存在直系同源基因；非保守型SIGLEC则由其他成员组成，在哺乳动物物种中并不存在真正的同源基因，被称为CD33相关基因 SIGLEC，其中就包括SIGIEC8。图1. SIGLEC8促进嗜酸性粒细胞凋亡并减少肥大细胞炎症反应&SIGLEC8的潜在聚糖配体[2]SIGLEC8是属于SIGLEC 家族 CD33样亚家族成员，全称为“sialic acid binding Ig like lectin 8”。它仅在人类嗜酸性粒细胞和肥大细胞上高度表达，在嗜碱性粒细胞上表达较弱。在体外，SIGLEC8在嗜酸性粒细胞上与抗体或合成聚糖配体包被的聚合物交联可诱导其快速凋亡，而在肥大细胞上，SIGLEC8 连接可抑制 IgE/FceRI介导的炎症介质释放，而不影响他们的生存[3]。用促进存活的促炎性细胞因子预激活嗜酸性粒细胞（过敏性炎症的一个关键过程）不仅不能抵消 SIGLEC8 触发的细胞死亡，反而会有效增强其对 SIGLEC8连接反应中细胞凋亡的敏感性，这表明SIGLEC8介导的免疫抑制在炎症条件下发挥着特殊作用，被认为是很有前途的抗炎靶点，因此在治疗过敏反应、哮喘等由这些细胞引发的炎症性疾病方面具有重要作用[4]。新药研究进展目前以SIGLEC8为靶点的在研药物共5项，开发机构均是Allakos。其中Antolimab（AK-002）处于临床II期，其余四项处于临床前阶段。Antolimab，是一款靶向SIGLEC8的人源重组非岩藻糖基化单克隆IgG1抗体的药物；能够通过SIGLEC8移植肥大细胞和消耗嗜酸性粒细胞，从而抑制有这两类细胞的错误激活导致的一系列疾病，如嗜酸性胃炎(EG)、嗜酸性十二指肠炎(EoD)和嗜酸性食管炎等慢性炎症疾病。2020年5月Allakos公布Antolimab在治疗EG、EoD和嗜酸性食管炎上已经获得了 FDA的孤儿药认定资格。数据来源于科睿唯安为助力靶向SIGLEC8的新药研发，百奥赛图成功开发了相应靶点人源化小鼠。B-hSIGLEC8 miceB-hSIGLEC8 小鼠中的嗜酸性粒细胞和肥大细胞与抗人 SIGLEC8 抗体结合通过流式细胞术分析 B-hSIGLEC8 小鼠的嗜酸性粒细胞和肥大细胞。从野生型 C57BL/6 小鼠和B-hSIGLEC8小鼠中分离出嗜酸性粒细胞和腹膜灌洗肥大细胞。使用基准抗体 Lirentelimab（内部合成）进行流式细胞术分析以评估人 SIGLEC8 表达。Lirentelimab 在纯合 B-hSIGLEC8 小鼠中仅与 SIGLEC8结合，在野生型小鼠中不与 SIGLEC8结合。小鼠哮喘模型BALF免疫细胞数量从B-hSIGLEC8小鼠(n=6)中分离出BALF免疫细胞。在PBS或lirentelimab（内部合成）处理下，通过流式细胞术分析嗜酸性粒细胞的数量。lirentelimab 治疗后，纯合 B-hSIGLEC8 小鼠中炎症细胞的表达水平低于阳性对照。抗人SIGLEC8抗体的药效B-hSIGLEC8 小鼠哮喘样模型中的 H&E 染色。(A) 在研究结束时收集肺组织。H&E染色结果显示，暴露于PBS气雾剂的B-hSIGLEC8小鼠的肺组织没有表现出任何炎症。暴露于OVA导致 B-hSIGLEC8 小鼠的支气管周围和血管周围炎症显着增加。(B) 在用 lirentelimab（内部合成）治疗的小鼠中观察到嗜酸性粒细胞浸润显着减少。注：治疗模型组中lirentelimab单抗通过气管内雾化给药。本期分享到此结束，如果您对相关小鼠模型有需求，欢迎随时与我们联系。参考文献[1] Ravetch JV, Lanier LL (2000) Immune inhibitory receptors.Science290(5489):84–89.[2] Angata T, Varki A. Discovery, classification, evolution and diversity of Siglecs. Mol Aspects Med. 2023 Apr;90:101117. doi: 10.1016/j.mam.2022.101117.Epub 2022 Aug 18. PMID: 35989204; PMCID: PMC9905256.[3] Hudson SA, Bovin NV, Schnaar RL, Crocker PR, Bochner BS (2009) Eosinophil-selectivebinding and proapoptotic effect in vitro of a synthetic Siglec-8 ligand, polymeric6′-sulfated sialyl Lewis x.J Pharmacol Exp Ther330(2):608–612.[4] Na HJ, Hudson SA, Bochner BS (2012) IL-33 enhances Siglec-8 mediated apoptosis ofhuman eosinophils.Cytokine57(1):169–174.

特应性皮炎（Atopic dermatitis, AD）是一种慢性皮肤疾病，其主要症状为发痒、红疹和鳞状病变，伴发心血管，精神疾患（抑郁，焦虑，睡眠障碍等）以及其他疾病。为了更好的研究特应性皮炎，研究者在小鼠上开发出多种特应性皮炎的动物模型，包括（1）利用上皮敏感性抗原、半抗原等增强皮肤敏化引起的AD模型；（2）基因工程小鼠AD模型；（3）自发AD小鼠模型等。百奥动物在C57BL/6小鼠和相同背景品系的B-hIL4/hIL4RA双基因人源化小鼠上，利用Oxazolone（OXA）致敏和持续激发，产生皮炎样病损，建立AD疾病模型，用于AD相关药物的药效评价。01AD小鼠模型的构建模型评价内容l 小鼠体重l 背部及耳部表皮厚度测量l 血清中总IgE检测l 病理分析：皮肤炎症等病变，嗜酸性粒细胞等在野生型C57BL/6小鼠中通过OXA诱导的AD模型。（A） 小鼠体重；（B） 耳部厚度；（C） 血清总IgE浓度。实验结果显示OXA诱导组的耳部厚度和血清IgE显著增加。数值以平均值±标准误表示。在野生型C57BL/6小鼠中诱导的 AD模型的耳部皮肤病理学和淋巴细胞浸润分析。（A）小鼠耳组织切片的苏木精-伊红（H&E）染色；（B）耳表皮嗜酸性粒细胞浸润评分。数值以平均值±标准误表示。治疗策略可以选择在免疫接种时开始治疗-预防性策略，也可以在小鼠发病后开始治疗-治疗性策略。02AD小鼠模型药效评价实例AD小鼠模型（C57BL/6）用于Dexamethasone药效评价1）从B图可以看出，OXA造模组的耳部厚度有明显的增加，同时血清中总的IgE（图C）有明显的升高，证明造模成功。2）从耳部厚度和IgE变化情况可以看出，不同浓度的Dexamethasone对AD疾病具有不同程度的缓解作用。3）高剂量组（0.09% Dexamethasone）对耳部皮肤水肿的缓解作用达到了与对照组持平的效果。但与对照组相比，也会导致明显的体重减轻。4）小鼠耳组织切片苏木精-伊红(H&E)染色(图D)；耳表皮嗜酸性粒细胞浸润评分(图E)。数值以平均值±标准误表示。❉ 病理分析组别设置组别只数受试品浓度G15//G25//G35Dexamethasone0.03%G45Dexamethasone0.06%G55Dexamethasone0.09%从病理统计结果发现，除对照组外，其余四组动物背部和耳部皮肤表皮均可见不同程度的基质细胞增生、表皮增厚、角化过度伴角化不全、表皮痂皮、真皮及皮下组织可见混合炎症细胞浸润等特应性皮炎相关的病理性改变，表明G2造模组和G3-G5给药组的模型动物均造模成功。对各组动物的背部皮肤和耳部皮肤嗜酸性粒细胞浸润变化进行了病理学评分和统计，给药组G3-G5背部和耳部皮肤嗜酸粒细胞浸润均低于G2造模组。其中，背部皮肤中，给药组G3-G5嗜酸粒细胞浸润程度未见显著差异。耳部皮肤中，给药组G4、G5组嗜酸粒细胞浸润程度要低于G2和G3组。上述结果表明三组浓度的受试品均对特应性皮炎相关症状有一定改善作用，其中浓度为0.06%和0.09%的Dexamethasone药效较好。AD小鼠模型(B-hIL4/hIL4RA小鼠)用于Dupilumab（内部合成）药效评价Dupilumab减轻OXA诱导的B-hIL4/IL4RA小鼠特应性皮炎。第0天在小鼠的耳部和皮肤上注射0.8%的OXA，然后从第7天到第25天，每周3次注射0.4%的OXA，记录小鼠体重和耳部厚度。小鼠从第6天起每周2次接受PBS或Dupilumab(10，25 mg/kg)治疗，共6次。最后收集耳部、背部皮肤和血液(图A)。Dupilumab对体重没有影响(图C)。Dupilumab给药组小鼠的耳部厚度(图B)和血清IgE (图D)降低。Dupilumab (内部合成)能剂量依赖性治疗OXA诱导的B-hIL4/IL4RA小鼠皮肤损伤。用ELISA法分析OXA诱导的B-hIL4/hIL4RA小鼠AD模型中的蛋白表达。分别于第9、16、23、26天采集建模区耳部和皮肤样本，进行ELISA分析。Dupilumab可以减轻OXA诱导的B-hIL4/hIL4RA小鼠中人IL-4的升高。用Luminex分析OXA诱导的B-hIL4/hIL4RA小鼠AD模型中的蛋白表达。分别于第9、16、23、26天采集建模区耳部和皮肤样本，采用Luminex进行分析。用MSD分析OXA诱导的B-hIL4/hIL4RA小鼠AD模型的蛋白表达。分别于第9、16、23、26天采集建模区耳部和皮肤样本，采用MSD进行分析。用qRT-PCR分析小鼠IL-5和IL-13在OXA诱导的B-hIL4/hIL4RA小鼠AD模型中的表达。分别于第9天和第26天采集耳部样本，提取总RNA。然后逆转录RNA样本，用qRT-PCR检测小鼠IL-5、IL-13水平，用小鼠GAPDH作为管家基因。表1 细胞因子分析汇总03特应性皮炎（AD）模型可提供的临床前检测项目04特应性皮炎（AD）相关人源化小鼠列表

骨质疏松症被定义为一种全身性骨骼疾病，其特征是骨量低，骨组织微结构恶化，从而导致骨脆性增加，易发生骨折[1]。骨质疏松症的基本发病机制是骨形成和骨吸收的失调。据统计，目前全世界大约2亿人患骨质疏松症，跃居各种常见病的第7位。据悉，2015～2019年全球骨质疏松症药物市场相对稳定，伴有小幅增长，2019年全球销售额为97.09亿美元。从TOP20的产品看，以RANKL抑制剂、甲状旁腺激素类似物、双膦酸盐类药物、钙剂与维生素D、选择性雌激素受体调节剂这五大类药物为主[2]。骨质疏松症新药研究进展进军骨质疏松症市场的两个新秀为地舒单抗和罗莫单抗，其中地舒单抗是首个且唯一获批的靶向RANKL单克隆抗体，通过阻断RANK和RANKL的结合来抑制破骨细胞的活性，在抑制成熟破骨细胞功能的同时，还可以抑制破骨前体细胞成熟，减少骨质吸收、促进骨重建，从而延迟和减少骨相关事件发生。值得一提的是，地舒单抗虽然获批较晚，但却是目前骨质疏松症药物市场的佼佼者。而罗莫单抗是一种人源化单克隆抗体（IgG2），可以抑制骨硬化蛋白（SOST）的活性，在加速骨形成的同时减少骨吸收，增加骨密度。除此之外，骨质疏松症治疗新靶点也在不断被挖掘，目前全球还有多款在研治疗骨质疏松症的药物，部分在研新药详情见下表：百奥动物骨质疏松症模型卵巢切除（OVX）小鼠是一种公认的人类绝经后骨质疏松症(PMOP)的体内模型。采用骨矿物质密度(BMD)测量、Micro-CT分析和组织形态学分析对卵巢切除小鼠进行评价[3,4]。百奥动物建立了稳定的卵巢切除术诱导的C57BL/6小鼠骨质疏松症模型，可用于骨质疏松症的临床前研究和药理药效学评价。骨质疏松症模型构建及验证骨质疏松症小鼠模型的构建卵巢切除诱导小鼠体重增加，子宫重量减轻卵巢切除诱导小鼠骨质流失(Micro-CT)C57BL/6小鼠在第0天切除卵巢。手术后6周，取出骨头(C)和子宫(B)进行检测。每周记录体重(A)，实验终点记录子宫重量 (B)。实验结果表明，卵巢切除术导致小鼠体重增加，子宫重量减轻且骨质流失。数值以平均值±标准误表示。卵巢切除诱导骨质疏松症的病理分析卵巢切除6周后进行病理分析。实验结果表明，接受卵巢切除手术的小鼠骨小梁面积减少。数值以平均值±标准误表示。骨质疏松症模型可提供的检测项目骨质疏松症靶点人源化小鼠模型百奥动物针对骨质疏松症相关靶点开发了系列人源化小鼠模型，助力相关药物研发进程。参考资料：[1]. Eastell R, O‘Neill TW , Hofbauer LC et al. Postmenopausal osteoporosis. Nat Rev Dis Primers. 2016, 2:16069.[2]. https://mp.weixin.qq.com/s/E7M_lJc4gjaY3cHjoMG7xA[3]. Wang HC, Zhou KF, Xiao FZ et al. Identification of circRNA-associated ceRNA network in BMSCs of OVX models for postmenopausal osteoporosis. Sci Rep. 2020, 10(1):10896.[4]. Chen K, Qiu PC, Yuan Y et al. Pseurotin A Inhibits Osteoclastogenesis and Prevents Ovariectomized-Induced Bone Loss by Suppressing Reactive Oxygen Species. Theranostics. 2019, 9(6):1634-1650.

导读近日，CDE官网显示苏州泽璟生物制药股份有限公司I类新药「注射用盐酸ZG0895」在国内获批临床，有望成为一个全新的晚期实体瘤治疗新药，并可与肿瘤免疫治疗药物等其它药物联合增强抗肿瘤药效，从而改善患者的生活质量和延长寿命。ZG0895是泽璟制药自主研发的一种新型的高活性、高选择性的Toll样受体8（TLR8）激动剂，在多种体内模型中具有优异的抗肿瘤活性，可以导致肿瘤消退。今年AACR年会上公布的临床前研究数据中显示，ZG0895具有独特的结构，皮下注射后会展现出独特的药代动力学特性，可以降低药物进入循环系统后可能带来的全身性免疫系统持续激活的风险，具备良好的安全性，同时可以剂量依赖性的显著抑制肿瘤生长，相比以往的TLR8激动剂有望具有更好的临床用药安全性。背景概述Toll样受体家族（TLRs）是一类模式识别受体，可以识别PAMPs（病原体相关分子模式，Pathogen-associated molecular pattern），引发人体复杂的级联免疫反应；不但表达于免疫细胞上，还在各种肿瘤细胞中表达，参与肿瘤免疫监视，同时在炎症、免疫细胞调控、和增殖方面也发挥着关键作用。人和小鼠共13种TLRs，其中TLR10为人独有，TLR11/12/13为小鼠独有，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6是位于细胞表面的受体，相反TLR3、TLR7、TLR 8、TLR9位于内涵体中。图1  TRLs受体及其配体[1]相较于其它TLRs成员，TLR8 在多种免疫细胞表达，可以激活髓样树突状细胞来逆转Treg 细胞的免疫抑制功能，从而抑制肿瘤[2]。TLR7和TLR8信号通路共有接头蛋白MyD88，TLR7激活后通过形成复合物MyD88-IRF7促进炎症细胞因子表达[3]。当TLR8与其配体包括GU-rich ssRNA，short dsRNA，寡核苷酸和多种合成的化学激动剂结合时，其空间构象发生改变，形成同源二聚体，通过下游MyD88/IRAKs激活IRF7及NF-κB通路，诱导多种炎性细胞因子、IFNs、趋化因子的产生，抵抗细菌和病毒感染，也参与到多种疾病发生发展过程中[4]；另外TLR8还可以通过激活IRF3/7通路诱导IFN-b表达。图2 TLR8信号通路[4]TLR8药物靶点布局目前，全球尚未有TLR8 激动剂获批上市，但已出现多款在研药物。药物类型上，TLR8激动剂包括小分子化药和抗体偶联药物；适应症方面，在研TLR8激动剂还被开发用于治疗晚期实体瘤和慢性乙型肝炎。在这个领域研究进度比较领先的公司是吉利德，其中GS-9688是一款可口服使用的选择性TLR8小分子激动剂，用于治疗慢性乙型肝炎。另外上海迪诺医药科技有限公司的DN1508052-01是国内首款获批临床的小分子TLR8激动剂，用于治疗标准治疗后疾病进展或无标准治疗的晚期实体肿瘤。表1. 部分药物研究进展数据来源于科睿唯安及公开信息整理TLR8 作为一种已被证实的肿瘤靶点，具有广阔的肿瘤治疗临床应用潜力。BioMice百奥动物开发了一种新型TLR8人源化小鼠模型，助力相关药物的临床前药效评估，为TLR8激动剂的安全性评价提供了有力工具。部分数据展示如下：B-hTLR8 mice基本信息DC细胞中TLR8蛋白表达分析采集野生和纯合B-hTLR8 (H/H)小鼠的脾细胞，用种属特异性抗TLR8抗体进行流式细胞术分析。由于抗小鼠TLR8抗体与人TLR8的交叉反应，在野生小鼠和纯合B-hTLR8中检测到小鼠TLR8。人TLR8仅能在纯合B-hTLR8中检测到，而不能在野生小鼠中检测到。功能检测采集野生型小鼠和纯合B-hTLR8 (H/H)小鼠脾细胞，用TLR8激动剂TLR8-506和GS-9688 (Selgantolimod)刺激，ELISA对小鼠TNFα、IFNγ和IL12p40进行检测。与野生型相比，纯合B-hTLR8小鼠的TNFα、IFNγ和IL12p40分泌增加，这是由于B-hTLR8 mice与人TLR8有选择性的高亲和力结合，并且刺激与GS-9688浓度呈剂量依赖性。脾脏中白细胞亚群分析用流式细胞术分析从雌性C57BL/6和B-hTLR8小鼠(n= 3,6周龄)中分离的脾细胞以评估白细胞亚群。A.具有代表性的FACS图。B. FACS分析结果。纯合B- hTLR8小鼠的T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的百分比与C57BL/6小鼠相似，表明TLR8人源化不会改变这些细胞类型在脾脏的整体发育、分化或分布。药效实验靶向TROP2的抗体偶联TLR8小分子激动剂药物抗肿瘤药效。(A)抗人TROP2抗体偶联TLR8小分子激动剂抑制B-hTLR8小鼠MC38肿瘤生长。小鼠结肠癌B-hTROP2 MC38细胞皮下接种到纯合B-hTLR8小鼠(雌性，9周龄，n=8)。小鼠按体重差异分组，分别用不同剂量的抗体偶联药物治疗。(B)治疗期间体重变化。如图A所示，抗人TROP2抗体偶联TLR8激动剂对B-hTLR8小鼠肿瘤生长的控制有效，表明B-hTLR8小鼠模型是临床前体内研究中评估抗体偶联TLR8激动剂的理想模型。TLR8靶向药物在B-hTLR8胶原诱导的关节炎模型中的体内疗效。96只动物按体重随机分为2组，A组8只，B组88只。第0天，A组皮下注射PBS；B组动物注射CⅡ型乳剂。当B组动物的平均临床评分大于0时，再次分组，将这些动物分为5组，每组8只，分别标记为G2~G6。G1组为为非CIA对照组。G2为载体组（模型组），G3为80mg/kg阳性对照药物组，G4为低剂量TLR8靶向药物组，G5为中剂量TLR8靶向药物，G6为高剂量TLR8靶向药物。(A) 重量变化。与第0天相比，每天动物体重变化的百分比；(B) 给药后第21天的动物临床评分。作为供试品组，观察到G3-G6的平均得分低于载体治疗组（G2）。特别是G3和G6与G2表现出显著差异；(C) H&E染色病理统计评分。镜下G1组未见病变。G2组观察到不同程度的皮下混合性炎症细胞浸润、关节滑膜炎和/或滑膜形成、踝关节和/或指关节软骨和骨组织破坏。G6组显示TLR8靶向药物高剂量对关节炎动物模型相关病变有一定改善作用。表2. TLRs靶点人源化小鼠列表本期分享到此结束，如果您对相关小鼠模型有需求，欢迎随时与我们联系。快点击“阅读原文”获取更多模型信息吧。数据多多，欢迎分享~参考文献[1]Taro Kawai, Shizuo Akira. TLR signaling .Cell Death and Differentiation (2006) 13, 816–825[2]Martínez-Espinoza, Iván, and Antonieta Guerrero-Plata. “The Relevance of TLR8 in Viral Infections.”Pathogens (Basel, Switzerland) vol. 11,2 134. 22 Jan. 2022[3]Wang, J. et al. The Functional Effects of Physical Interactions among Toll-like Receptors 7, 8, and 9. Journal of Biological Chemistry 281, 37427-37434 (2006).[4]Dowling, D.J. Recent Advances in the Discovery and Delivery of TLR7/8 Agonists as Vaccine Adjuvants.  (2018).

“瘙痒是一种能引起强烈搔抓渴望的不快的感觉。“关于瘙痒的定义是300多年前由德国医生塞缪尔·哈芬莱弗(Samuel Hafenreffer)第一次提出的，一直沿用至今。许多炎症性疾病，如特应性皮炎、过敏性鼻炎、支气管哮喘等常常伴随强烈瘙痒。N细胞因子细胞因子是免疫反应中的重要因子；近几年的单细胞测序分析表明，痒觉响应的初级感觉神经元中也有许多亚群表达各类细胞因子受体。近20年来神经免疫领域的研究也证实，细胞因子及其受体是触发慢性痒的重要因素之一。神经元瘙痒受体的激活和下游信号传导[1]白介素-31(interleukin-31,IL-31)与特应性皮炎和瘙痒有关，主要由TH2型T细胞产生。IL-31受体由IL-31RA和OSMRb组成，表达于周围感觉神经、皮肤角质细胞和免疫细胞。相应的，IL-31R与IL-31相互作用，会导致瘙痒、皮肤屏障受损和炎症，以及其他炎性因子的分泌。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)，是一种与IL-7互为远距离旁系同源的，归属于短链四α螺旋束Ⅰ型IL-2家族的多效性细胞因子。研究表明 TSLP可以通过 TRPA1 阳性神经元上的 TSLP 受体直接促进瘙痒，反过来，抓挠会诱导表皮角质细胞进一步表达 TSLP，持续性搔抓行为则会加重痒的感觉，形成“越抓越痒、越痒越抓”的恶性循环（the vicious itch-scratch cycle）。白细胞介素4 (interleukin-4, IL4)主要由T细胞、自然杀伤T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞产生。受体在多种痒觉相关伤害感受神经元中均有表达，且与氯喹、组胺、TSLP反应性神经元重合。当IL4受体被激活，JAK(Janus kinase)信号通路与TRPV1和TRPA1共同作用，引起神经元内钙离子浓度升高，诱发瘙痒行为。为了更好的研究和开发瘙痒相关疾病疗法，百奥动物开发了一系列瘙痒相关靶点人源化小鼠，助力相关药物的临床前药效评估。B-hIL31/hIL31RA/hOSMR micehIL31诱导B-hIL31/hIL31RA/hOSMR小鼠瘙痒及IL-31抗体药效在第0、3、7、10天分别给与纯合B-hIL31/hIL31RA/hOSMR小鼠(雌性，n=3)注射hIL-31，并记录hIL-31注射后3h小鼠的抓痕计数。以注射hIL-31前记录抓痕计数作为基线。如图所示，hIL-31在纯合B-hIL31/hIL31RA/hOSMR小鼠中成功诱导瘙痒。一种靶向IL-31信号的抗体作为阳性对照，在我们的模型中显示出显著的止痒效果(经客户验证)。B-hTSLP/hTSLPR miceOxazolone诱导特应性皮炎样皮损抗人TSLP抗体对Oxazolone诱导特应性皮炎小鼠模型的药效各组小鼠均采用抗hTSLP抗体tezepelumab(内部合成)治疗。(A)各组耳表皮厚度统计分析。第18天开始，耳表皮开始脱皮。因此，从第18天开始，耳表皮厚度逐渐减少，如图所示。(B)治疗期间体重变化。(C)血清总IgE水平。第26天采集血清，ELISA法测定总IgE水平。(n = 8)。B-hTSLP/hTSLPR小鼠特应性皮炎模型耳皮肤H&E染色。(A)H&E染色。(B)耳表皮皮肤厚度。(C)耳表皮皮肤嗜酸性粒细胞浸润评分。(D)耳表皮皮肤总分。与同型对照组相比，地塞米松或tezepelumab（内部合成）治疗组耳厚和耳皮肤嗜酸性粒细胞浸润评分显著降低，表明B-hTSLP/hTSLPR小鼠为体内评价抗人TSLP抗体提供了强有力的临床前模型。B-hIL4/hIL4RA miceOxazolone诱导特应性皮炎样皮损抗人IL4RA抗体对Oxazolone诱导特应性皮炎小鼠模型的药效各组小鼠均使用杜匹单抗（内部合成）治疗。剂量在图例中显示。(A)治疗期间体重变化。(B)各组耳表皮厚度统计分析。第18天开始，耳表皮开始脱皮。因此，从第18天开始，耳部厚度逐渐减小，如图所示。(C)血清总IgE水平。第26天采用ELISA法检测总IgE水平。耳厚和血清总IgE浓度与抗体剂量呈负相关。(n = 5)。B-hIL4/IL4RA小鼠特应性皮炎模型耳皮肤H&E染色。(A)H&E染色。(B)耳表皮皮肤嗜酸性粒细胞浸润评分(n=5)。给药后耳皮肤嗜酸性粒细胞浸润分数显著降低，表明B-hIL4/hIL4RA小鼠为体内评估抗人IL4RA抗体提供了强有力的临床前模型。瘙痒相关人源化小鼠模型参考文献[1] Dong X, Dong X. Peripheral and Central Mechanisms of Itch. Neuron. 2018 May2;98(3):482-494. doi: 10.1016/j.neuron.2018.03.023. PMID: 29723501; PMCID:PMC6022762.

尽管调节T细胞（Treg）对维持机体免疫耐受避免自身免疫疾病很重要，但它们也抑制了肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的抗肿瘤免疫反应。TME中Treg细胞数量增加、Teff/Treg比例降低与许多癌症的不良预后相关。因此，Treg清除、控制Treg细胞活性与浸润是有潜力的肿瘤免疫疗法。图. Treg靶向的抗肿瘤疗法[1]1去除瘤内Treg细胞a)    通过靶向IL-2受体CD25 (IL-2RA)来实现Treg清除，如Dadizumab治疗脑胶质瘤。但这种疗法的治疗窗口较小。因为CD25既是Treg也是Teff细胞活化后上调的分子。靶向CD25的Treg清除也会伴随Teff的清除。罗氏正在开发新型IL-2非阻断CD25抗体（RG6292），在不影响Teff细胞上的IL-2信号的前提下特异性清除Treg。b)    通过靶向CTLA-4来实现Treg清除。BMS正在开发第二代CTLA-4抑制剂BMS-986218，对Yervoy进行Fc改造以增强ADCC作用清除Treg。c)    靶向TME中Treg的其他表面标志物：ICOS、OX40、GITR、LAG-3、CCR4（mogamulizumab，去岩藻糖的CCR4单抗，通过增强ADCC作用清除Treg）、CCR8、TNFR2。d)    通过鉴定TME Treg marker来实现特异性TME中Treg的清除，而不影响其他正常组织中的Treg。如普米斯生物的双抗CCR8 x CTLA-4。2阻止Treg细胞浸润Treg在趋化因子的作用下迁移至TME，如CCL28-CCR10，CCL1-CCR8，CCL22-CCR4（mogamulizumab）的相互作用。通过中和抗体封闭分泌型CCL1或CCL22；阻断CCR4和CCR8可有效阻止Treg细胞迁移。3使瘤内Treg对免疫检查点阻断剂敏感免疫检查点抑制剂PD-(L)1疗法总体上只能使约20%的病人获得较好的响应，原因之一便是TME内存在异常活化的Treg细胞。由于Treg表达抑制型受体TIGIT、LAG3、CTLA-4、PD-1、TIM-3等，使得Treg具有高度免疫抑制活性。通过抑制型受体的联合阻断[2]可有效降低Treg的免疫抑制能力。4靶向T细胞的共刺激信号a)    GITR激活可促进Teff功能、抑制Treg功能；GITR激动剂DTA-1可使瘤内Treg减少50%以上。b)    OX40与配体结合后可增加Teff和记忆T细胞的存活和扩增，同时降低Treg的免疫抑制活性；OX40激活剂OX86在B16F10小鼠黑色素瘤模型中可诱导TME中Treg深度耗竭并增加CD8+ Teff细胞的浸润。c)    ICOS拮抗剂MEDI-570、激动剂JTX-2011（vopratelimab）可在不影响外周Treg频率的情况下降低小鼠瘤内Treg的频率。5靶向Treg分泌的抑制型细胞因子a)   抑制TGF-b：直接结合成熟的TGFb：M7824；作用于GARP：DS1055a去岩藻糖的GARP抗体，可消耗TME中的Treg；作用于整合素αVβ8b)    抑制IL-10c)    IL-35拮抗剂6改变Treg脆性NRP-1的缺失和IFNg的表达可破坏Treg细胞的免疫抑制功能。NRP1+ Treg在多种人类癌症中富集。NRP-1拮抗剂Fc（AAG）-TPP11可选择性抑制TME中NRP1+ Treg的功能和稳定性，而不影响外周Treg[3]。7靶向Treg代谢a)    Teff依赖糖酵解，而瘤内低糖、缺氧、酸性环境抑制Teff的功能。但TME内Treg利用乳酸替代途径来维持其抑制功能。二甲双胍可对Treg代谢重编程至糖酵解，从而减弱Treg的免疫抑制功能。b)    癌细胞加速的糖酵解消耗TME中的葡萄糖并增加乳酸和脂肪酸含量。脂肪酸代谢也促进Treg细胞发育。抑制脂质合成和代谢信号的SREBP可释放TME中的Treg抑制[4]。c)    TME内的IDO和腺苷可促进Treg增殖和抑制功能。IDO抑制剂、CD39/CD73/A2AR抑制剂可抑制Treg活性。为了更好的研究、开发Treg疗法，百奥动物开发了一系列Treg靶点人源化小鼠，助力相关药物的临床前药效评估。B-hCTLA4/hCCR8 mice 品系名称：C57BL/6-Ctla4tm1(CTLA4) Ccr8tm1(CCR8) /Bcgen通用名：B-hCTLA4/hCCR8 mice背景：C57BL/6货号：112251hCTLA-4蛋白的瘤内T细胞表达分析hCTLA-4的流式表达分析。小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植至纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠（雌性，7周龄，n=3）。当肿瘤生长至400-700 mm3时对其进行流式检测。人CTLA-4仅在纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠的T细胞中检测出来。hCCR8蛋白的瘤内T细胞表达分析CCR8的流式表达分析。小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植至纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠（雌性，7周龄，n=3）。当肿瘤生长至400-700 mm3时对其进行流式检测。人CCR8仅在纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠的T细胞中检测出来。B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2 mice 品系名称：C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)Cd274tm1(CD274)Tnfrsf1btm1(TNFRSF1B)/Bcgen通用名：B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2 mice背景：C57BL/6货号：130849抗人PD-1抗体和抗人TNFR2抗体联合治疗抗人PD-1和抗人TNFR2抗体联用可抑制B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠中hPD-L1 MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌hPD-L1 MC38细胞皮下移植至纯合B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠（雌性，6-7周龄，n=5）。当肿瘤体积达到约100 mm3时对小鼠进行分组给药。帕博丽珠单抗（PD-1抗体）和抗人TNFR2抗体的给药剂量和频次如图所示。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。所有抗体均为自制。可以看出，两药联用比单药均有更强的肿瘤抑制作用，证明B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠是验证hPD-1抗体和hTNFR2抗体体内药效的有力临床前模型。B-hIL2RA mice品系名称：C57BL/6-Cd25tm1(CD25)/Bcgen通用名：B-hIL2RA mice背景：C57BL/6货号：110066抗人IL-2RA抗体体内药效抗人IL-2RA抗体可抑制B-hIL2RA小鼠中MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植至纯合B-hIL2RA小鼠（雌性，6-7周龄，n=8）。抗人IL-2RA抗体（211At-7G7/B6 和 M-A251）的给药剂量和频次如图所示。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。可以看出，B-hIL2RA小鼠是验证hIL-2RA抗体体内药效的有力临床前模型。B-hGARP mice品系名称：C57BL/6-Lrrc32tm1(LRRC32)/Bcgen通用名：B-hGARP mice背景：C57BL/6货号：110102抗鼠PD-1抗体和抗人GARP/latent-TGFb1抗体联合治疗抗鼠PD-1抗体和抗人GARP/latent-TGFb1抗体联用可抑制B-hGARP小鼠中MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌MC38细胞（5x105）皮下移植至纯合B-hGARP小鼠（雌性，7周龄，n=6）。当肿瘤体积达到50-70 mm3时对小鼠进行分组给药。抗鼠PD-1抗体和抗人GARP/latent-TGFb1抗体（自制）的给药剂量和频次如图所示。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。可以看出，两药联用比单药均有更强的肿瘤抑制作用，证明B-hGARP小鼠是验证hGARP抗体体内药效的有力临床前模型。B-hPD-1/hCD39 mice品系名称：C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)Entpd1tm3(ENTPD1)/Bcgen通用名：B-hPD-1/hCD39 mice背景：C57BL/6货号：121179抗人CD39抗体和抗人PD-1抗体联合治疗抗人CD39和抗人PD-1抗体联用可抑制B-hPD-1/hCD39小鼠中MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌B-hPD-L1 MC38细胞（5x105）皮下移植至纯合B-hPD-1/hCD39小鼠（雌性，7-8周龄，n=6）。当肿瘤体积达到100-150 mm3时对小鼠进行分组给药-帕博丽珠单抗（PD-1抗体）和抗人CD39抗体（SRF367A）。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。所有抗体均为自制。可以看出，两药联用比单药均有更强的肿瘤抑制作用，证明B-hPD-1/hCD39小鼠是验证hCD39抗体和hPD-1抗体体内药效的有力临床前模型。部分Treg靶点相关品系参考文献1.     Shan, Feng et al. “Therapeutic targeting of regulatory T cells in cancer.” Trends in cancer vol. 8,11 (2022): 944-961. doi:10.1016/j.trecan.2022.06.0082.     Tawbi, Hussein A et al. “Relatlimab and Nivolumab versus Nivolumab in Untreated Advanced Melanoma.” The New England journal of medicine vol. 386,1 (2022): 24-34. doi:10.1056/NEJMoa21099703.     Jung, Keunok et al. “A Neuropilin-1 Antagonist Exerts Antitumor Immunity by Inhibiting the Suppressive Function of Intratumoral Regulatory T Cells.” Cancer immunology research vol. 8,1 (2020): 46-56. doi:10.1158/2326-6066.CIR-19-01434.   Lim, Seon Ah et al. “Lipid signalling enforces functional specialization of Treg cells in tumours.” Nature vol. 591,7849 (2021): 306-311. doi:10.1038/s41586-021-03235-6

4-1BB靶点介绍4-1BB，即CD137，TNFRSF9(TNF receptor superfamily member 9)，它于1989年首次被发现，属于TNF受体超家族。它在抗原启动的T细胞上表达，在静止的T细胞上不表达，除此以外，4-1BB还在树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NKs）、活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤T细胞（NKT）和肥大细胞中表达。当4-1BB与其配体4-1BBL结合后，可以产生共刺激信号诱导CD4+和CD8+T细胞的活性，促进T细胞增殖，刺激巨噬细胞产生如如IL-6、TNF-α等多种炎症细胞因子。从而激活机体免疫系统，达到抑制肿瘤发生发展、促进肿瘤细胞清除的功效。有研究报道，当在进行4-1BB抗体药物研发时，还要需要考虑抗体结合位点在人和小鼠之间存在的差异性。其结合作用仅限于富含半胱氨酸结构域（CRD），小鼠4-1BBL主要与CRDII结合，人4-1BBL主要与CRDIII结合。小鼠4-1BB/4-1BBL是二聚体，人4-1BB/4-1BBL为三聚体，且人4-1BB不与小鼠的4-1BBL相互作用。[1]图1. 抗4-1BB疗法的免疫调节作用[2]4-1BB药物开发的现状4-1BB作为癌症免疫疗法中十分有潜力的靶点，针对其进行的药物研发非常火热，全球目前已有至少40款4-1BB激动型抗体进入临床研究阶段。4-1BB单抗药物由 BMS研发的Urelumab（全人源IgG4 mAb）是一个4-1BB强激动性的单抗，在I/II期试验中表现出良好的抗肿瘤活性，但在后续治疗过程中发生了两起由肝毒性引起的致命性不良事件。由Pfizer研发的Utomilumab（人源化IgG2 mAb）是一个4-1BB弱激动性的单抗，虽然有较好的肝脏安全性表现，但作为单药治疗抗肿瘤活性十分有限。因此，此前未能很好的在激动作用和肝毒性之间达到良好的平衡，导致4-1BB单抗产品临床应用空间有限；目前新一代单抗设计通过对Fc功能改造试图保留激动性的同时克服安全性问题，Alligator、Agenus以及国内的礼进生物和天演药业的4-1BB单抗产品表现出良好的初步临床数据。4-1BB重点单抗产品临床进度数据来源：Cortellis4-1BB双抗药物平衡抗体激动作用强弱和其肝毒性，是4-1BB单抗药物开发的难点，因此为了克服疗效和毒性的问题，研究者们开始探索新的开发策略。其中以4-1BB为靶点的双抗、三抗以及四抗成为研发的一个热点领域，国内外多家药企均有布局。4-1BB双特异性抗体通过对肿瘤细胞表面靶点和4-1BB亲和力不同精准定位肿瘤微环境，减少肝毒性等副作用。因此双抗疗效相比单抗可以实现更精准的靶向，从而使得临床前的抗肿瘤活性和安全性都得到了提升。如PD-1/PD-L1就是4-1BB双抗常用的另一候选靶点。去年，BioNTech与Genmab联合研发的PD-L1×4-BB双抗药物GEN1046，是一种全长IgG1亚型的PD-L1×4-1BB双抗，其以临床Ⅰ/Ⅱa期结果发表在著名学术期刊《CANCER DISCOVERY》上的文章中，所使用的PD-L1/4-1BB双靶点人源化鼠由百奥动物提供。文中研究结果表明：GEN1046对于CPI耐药的实体瘤治疗效果良好，安全性高，为免疫联合治疗提供了新的方案。4-1BB重点双抗产品临床进度数据来源：Cortellis通过众多临床试验及以往多年研究积累，4-1BB 靶点被证实是肿瘤免疫治疗十分有潜力的靶点，目前如何最大化激动作用并最小化毒性是未来4-1BB激动剂研发亟需解决的问题。百奥动物自主研发的4-1BB系列人源化小鼠（详情见下表），是靶向4-1BB抗体开发相关药物进行药效评价的优质模型。B-h4-1BB/h4-1BBL mice高剂量Urelumab对B-h4-1BB小鼠和B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠均产生肝毒性用PBS或Urelumab(内部合成)对纯合子B-h4-1BB小鼠和B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠进行治疗 (n=5，雌性，7周龄)。第21天采集血清，检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。与PBS对照相比，使用20mg /kg Urelumab治疗B-h4-1BB小鼠的ALT显著升高，而同样的治疗对B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠没有影响。与PBS对照相比，B-h4-1BB小鼠AST无明显升高，但20ug/mL urelumab治疗可使B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠AST明显升高。在1mg/kg剂量组，B-h4-1BB小鼠和B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠的ALT和AST均无明显变化。表明高剂量urelumab对B-h4-1BB和B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠有肝毒性作用。数值以平均值±SEM表示。高剂量Urelumab 治疗可导致B-h4-1BB小鼠和B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠肝脏淋巴细胞浸润增加肝毒性的病理分析。在B-h4-1BB小鼠(G1-G3)中，当urelumab剂量为1mg/kg时，肝脏未见明显异常变化(G2)。当剂量为20 mg/kg (G3)时，观察到血管周围细胞浸润或肝脏慢性炎症，并伴有轻度病变。在B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠(G4-G6)中，1 mg/kg组(G5) 3/5的小鼠出现病理变化(轻度2/5，轻度1/5)，而在20 mg/kg剂量(G6)时，所有实验动物肝脏均出现中度变化。总体而言，20 mg/kg组(G6)肝脏病变程度和发生率显著高于1 mg/kg组(G5)。以上结果提示，高剂量(20mg /kg)的urelumab比低剂量(1mg /kg)的urelumab更容易发生血管周围细胞浸润或肝脏慢性炎症。B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠对urelumab毒性作用比B-h4-1BB小鼠更敏感。因此B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠是较好的临床前毒性评价模型。B-h4-1BB/h4-1BBL药效验证抗人4-1BB抗体在B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠中的抗肿瘤药效。(A) 纯合子B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠 (雌性，6-8周龄，n=5) 皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞系。结果显示抗人4-1BB抗体能够显著抑制MC38肿瘤细胞的生长。(B)治疗期间体重变化。如图A所示，抗人4-1BB抗体在B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠中有效地控制肿瘤生长，这表明B-h4-1BB/h4-1BBL小鼠可为体内评价抗人4-1BB抗体药效提供有力的临床前研究模型。值表示为平均值±SEM。参考文献[1].https://mp.weixin.qq.com/s/kvwfybpx63XQn26xdijIZwhttps://mp.weixin.qq.com/s/999cX0RaXHLyXxZ8MhIaBw[2]. Chester C, Sanmamed MF, Wang J, Melero I. Immunotherapy targeting 4-1BB:mechanistic rationale, clinical results, and future strategies. Blood. 2018 Jan4;131(1):49-57. doi: 10.1182/blood-2017-06-741041. Epub 2017 Nov 8. PMID:29118009.

哮喘是一种异质的、高度复杂的呼吸道慢性炎症性疾病，可引起患者咳嗽、喘息、呼吸急促和胸闷等症状，严重时可危机生命。哮喘通常是由各种上皮损伤，如病毒、过敏原、细菌、空气污染物和其他环境刺激物引起的。不同国家哮喘患病率差异较大，有的国家低至1%，有的则高达18%，全世界的哮喘患者约有3.39亿人。哮喘有明显的性别差异，不同年龄男女性的患病率和严重程度不同，据调查，13岁以下的男孩哮喘发病率较高，但成年后，女性的发病率增加，高于男性(图1)。性激素、遗传和表观遗传变异、社会和环境因素以及对哮喘治疗的反应是影响哮喘发病率、流行率和严重程度的重要因素。图1. 发达国家哮喘终生患病率百分比。[1]哮喘的症状主要是由于气道炎症导致的，炎症引起的过程包括粘液产生、气道壁重塑和支气管高反应性。气道壁重塑和气道粘液堵塞导致的持续性气道阻塞是目前临床治疗哮喘未满足的迫切医疗需求之一。哮喘通常在幼年发病(早发型哮喘)，但也有些在成年发病(晚发型哮喘)。晚发型哮喘比早发型哮喘更严重，但与过敏的关系更小。过敏性哮喘往往始于幼年时期，与辅助T细胞2 (Th2)反应有关。当接触过敏原后，过敏原特异性Th2细胞产生2型细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-9、IL-13)，导致气道壁上大量嗜酸性粒细胞积累，粘液分泌增多，过敏原特异性B细胞合成免疫球蛋白E (IgE)增加。而晚发型哮喘分Th2型和非Th2型，非Th2型通常与肥胖、衰老和吸烟有关，Th2型常伴有复发性和慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)，并对阿司匹林敏感，可能与气道嗜酸性粒细胞数量增多有关。图2. 哮喘发病中驱动气道炎症的机制。与哮喘发病相关的2型(绿色)和非2型(黄色)适应性免疫反应。图中显示了2型反应的激活和分化导致IL-4、IL-5、IL-9和IL-13产生增加，以及嗜酸性粒细胞浸润增加，B细胞产生IgE、AHR、FENO和粘液产生增加。非2型炎症在成人比哮喘儿童更常见。非2型炎症导致T细胞产生的IL-17A或IFN-γ增加，或IL-6、TNF和IL-1增加导致中性粒细胞浸润、AHR、FENO和粘液产生增加。[1]随着研究的深入，哮喘表型的分类已发展成哮喘内型，主要是基于哮喘患者痰液中的炎性细胞类型，分为2-高型或-超高型(嗜酸性粒细胞)和2-低型(非嗜酸性粒细胞，中性粒细胞)。2-高内型是由Th2相关的细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13调控的，超2型高哮喘则反映了更严重的疾病形式。2-低内型更加复杂，目前尚未发现生物标志物。2-低型哮喘一般包括所有没有2-高型炎症的哮喘患者。[2, 3]靶点药物进展哮喘发病机制复杂，众多细胞因子（TSLP, IL4, IL5, IL13, IL-33等）参与其中，阻断某一个细胞因子治疗哮喘只能达到部分效果，药物联合使用将是治疗该病的发展趋势。根据科睿唯安数据库检索哮喘有3万+的药物发现数据结果，范围缩小到抗体类药物，也有73个上市/处在临床阶段的药物，其中上市药物15个，III期9个，II期29个，部分数据展示如下。阿斯利康已有多个药物上市，覆盖靶点广，占据明显的主导地位。今年2月，Tezspire (tezepelumab)还在美国获批用于12岁及以上严重哮喘患者的一次性预充型自我给药。Tezspire 是第一个也是唯一一个被批准用于治疗严重哮喘患者的生物制剂，在其批准的标签内没有表型或生物标志物的限制。面对如此多哮喘相关靶点药物研究现状，谁会是下一个闪光者，值得期待！表1. 部分研究进展数据整理自科睿唯安数据库BioMice百奥动物利用基因编辑技术自主开发了一系列哮喘相关靶点人源化小鼠，同时基于靶点人源化小鼠和野生型小鼠构建了哮喘模型可用于药效评估，助力该疾病药物的临床前研究。表2. 哮喘相关靶点人源化小鼠表3. 药理药效服务内容NEW PRODUCT模型示例：B-hTSLP/hTSLPR mice plus胸腺基质淋巴细胞生成素（Thymic stromal lymphopoietin, TSLP）是一种上皮细胞来源的I型细胞因子，属于IL-27细胞因子家族。主要在活化的肺和肠上皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞中表达。TSLPR又称为细胞因子受体样因子2（CRLF2），是TSLP的受体，属于血细胞生成素家族。TSLPR主要在树突细胞和单核细胞中表达。当过敏原、烟雾、病毒、细菌和真菌等诱因刺激肺和肠道上皮细胞和角质形成细胞释放TSLP（正电荷），结合TSLPR（负电荷）形成TSLPR:TSLP二元复合物，与IL-7Rα结合形成三元复合物TSLPR-TSLP-IL-7Rα，磷酸化JAK和STAT5启动促炎信号（图3）。图3. TSLP及其信号复合体信号启动示意图。[4]有证据表明，TSLP是哮喘病理生理学的关键因子，其对各种适应性和先天性免疫细胞和结构细胞的作用，可驱动嗜酸性炎症(过敏性和非过敏性)、非嗜酸性炎症和气道的结构变化。阻断TSLP的临床试验对哮喘患者产生了积极的治疗结果，减少了急性发作和炎症，同时改善了肺功能。[5]利用B-hTSLP/hTSLPR mice plus 构建哮喘小鼠模型抗人TSLP抗体在哮喘小鼠模型中的体内药效流式细胞术分析BALF中的免疫细胞。雄性B-hTSLP/hTSLPR plus小鼠用OVA免疫诱导建立小鼠哮喘模型(n=6)。在致敏阶段给予抗人TSLP抗体(Tezepelumab，内部合成)。实验结束后收集BALF，检测肺组织浸润炎性细胞。结果显示，嗜酸性粒细胞在OVA诱导但未处理组(G2)的比例显著高于非诱导组(G1)，而处理组(G3)与G2组相比，嗜酸性粒细胞比例显著降低。G3组CD45+细胞和嗜酸性粒细胞数量也有下降趋势。结果表明，抗人TSLP抗体能有效降低经OVA诱导的B-hTSLP/hTSLPR plus小鼠嗜酸性粒细胞的数量和比例。哮喘小鼠模型血清中OVA特异性IgE的产生水平。在实验终点收集血清，分析OVA特异性抗体反应的IgE水平。结果显示，接受tezepelumab治疗的小鼠体内IgE水平低于未接受治疗的小鼠。哮喘小鼠模型H&E染色。在实验终点收集肺组织，H&E染色结果显示接受PBS气雾剂的B-hTSLP/hTSLPR plus小鼠肺组织无任何炎症反应。接受OVA的B-hTSLP/hTSLPR plus小鼠支气管周和血管周炎症显著增加。在给予tezepelumab治疗的小鼠中观察到嗜酸性粒细胞浸润显著减少。黑色箭头：炎症细胞；黑色三角形：嗜酸性粒细胞。更多小鼠实验数据信息欢迎联系我们。参考文献[1]. https://doi.org/10.1183/16000617.0067-2021[2]. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.016[3]. doi: 10.1111/all.14027[4]. doi: 10.3389/fimmu.2018.01595[5]. doi: 10.1080/14728222.2020.1783242

2022年3月8日，国家药品监督管理局（NMPA）正式批准依马利尤单抗（Emapalumab）注射液（商品名：伽蜜芬）在国内上市，适用于难治性、复发性或进展性、或对常规疗法不耐受的原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）成人和儿童（新生儿及以上）患者，开启了HLH靶向治疗的新篇章。01噬血细胞综合征噬血细胞综合征（HPS）又称噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH），是一种遗传性或获得性免疫调节功能异常导致的严重炎症反应综合征，由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞异常激活、增殖和分泌大量炎性细胞因子引起，以发热、血细胞减少、肝脾肿大及肝、脾、淋巴结和骨髓组织发现噬血现象为主要临床特征[1]。目前广泛应用的标准诱导治疗方案是HLH-1994或HLH-2004方案，主流还是力推HLH-94方案。HLH-94方案有三个关键药物，地塞米松、VP-16、环孢菌素A，联合使用丙种球蛋白可能有一定的加强效果。遗憾的是，现有的诱导缓解治疗方案并不能充分满足原发性HLH患者的治疗需求，当前HLH治疗仍面临困局，那么破局之道在何方？随着对HLH发病机制的进一步挖掘，全新的HLH治疗靶点——IFN-γ浮出了水面。02IFN-γ及其诱导的HLH发病机制干扰素(IFNs)是具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节特性的多效细胞因子，是免疫反应的中心协调因子。IFN-γ最初是基于其体外抗病毒活性被鉴定出来的。它的受体由两个亚基组成，IFNGR1和IFNGR2。IFNGR1的主要功能是与配体结合，，而IFNGR2通过Janus激酶（JAKs）以及信号转导子和转录激活子（STATs）在信号转导中起主要作用，但在这一过程中，两个受体亚基都是必需的。有趣的是，只有IFNGR1有STAT1的核定位信号。图1: IFNGR的结构和IFN-γ诱导的信号通路[2]IFN-γ在调节先天和适应性免疫反应中发挥着重要作用。在炎症环境中，IFN-γ触发免疫反应的激活，并刺激病原体的消除；它还可以防止免疫系统的过度激活和组织损伤。在肿瘤微环境(TME)中，IFN-γ通过调节T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞（APCs）、肿瘤细胞、血管和淋巴系统来维持促肿瘤和抗肿瘤免疫的平衡[2]。图2: 肿瘤微环境中的IFN-γ应答者HLH的发病机制尚未被完全阐明，但学界目前认为，细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞（NK）的功能受损，是原发性HLH的主要病因。在正常情况下，细胞毒性T细胞和NK细胞通过免疫接触方式，向被病毒感染的靶细胞或癌细胞释放细胞毒性颗粒，颗粒中包含的穿孔素在靶细胞表面造成孔隙，使细胞毒性颗粒内容物（颗粒酶和其他蛋白酶）进入靶细胞内，诱导靶细胞的凋亡。但在HLH患者体内，由于基因突变、免疫缺陷、感染、恶性肿瘤或风湿性疾病等触发因素的影响，细胞毒性颗粒释放受阻，导致细胞毒作用功能受损，出现抗原清除障碍，T细胞与靶细胞结合后，会持续产生IFN-γ等大量促炎性细胞因子，从而持续刺激巨噬细胞和组织细胞过度活化，进一步释放更多的炎性细胞因子，诱发持续性、失控的高炎症反应，即为细胞因子风暴，导致急性全身性炎症反应甚至继发性器官功能障碍（如肝、肾、肺功能障碍），进而引起多器官功能衰竭，最终导致患者死亡[3-4]。图3：HLH发病机制示意图[3]（A：正常的免疫清除功能；B：HLH发病时异常的免疫清除功能）而在HLH的发生发展，尤其是细胞因子风暴的发生过程中，IFN-γ起到了关键作用。有研究显示，HLH患者体内的IFN-γ水平明显升高，且IFN-γ的过度生成与HLH的血液学特征表现有关。针对IFN-γ这个“风暴眼”信号通路，百奥动物自主开发了4个IFN-γ及其受体基因人源化的小鼠模型，包括：B-hIFNGR1 mice、B-hIFNGR2 mice、B-hIFNGR1/hIFNG mice、B-hIFNGR1/hIFNG/hIFNGR2 mice，助力HLH领域创新药物的临床前研究。03B-hIFNGR1 mice验证数据mRNA和蛋白表达分析通过RT-PCR和流式细胞术分析B-hIFNGR1小鼠中IFNGR1的表达。(A)mRNA的表达检测。人IFNGR1的mRNA仅在纯合B-hIFNGR1小鼠的脾细胞中检测到。(B)从野生型小鼠和B-hIFNGR1小鼠中收集腹腔冲洗液来源的巨噬细胞，用种属特异性抗IFNGR1抗体进行流式细胞术分析。人IFNGR1在B-hIFNGR1小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中检测不到。04B-hIFNGR2 mice验证数据mRNA和蛋白表达分析利用RT-PCR和western blot的方法分析野生鼠和纯合B-hIFNGR2小鼠中IFNGR2的mRNA和蛋白的表达。(A) mRNA的表达检测。小鼠Ifngr2 的mRNA仅在野生鼠(+/+)的小肠中检测到。人IFNGR2的mRNA仅在纯合B-hIFNGR2小鼠(H/H)中检测到。(B)蛋白的表达检测。收集野生鼠和纯合B-hIFNGR2小鼠的骨骼肌，用同时结合人和小鼠IFNGR2的抗体进行western blotting分析。结果表明，在纯合B-hIFNGR2小鼠中可以检测到IFNGR2蛋白的表达。05B-hIFNGR1/hIFNG mice验证数据蛋白表达分析B-hIFNGR1/IFNG小鼠IFNG和IFNGR1的表达分析。(A) IFNG表达分析。用抗CD3ε抗体刺激野生型小鼠(+/+)和纯合B-hIFNGR1/hIFNG小鼠(H/H,H/H) 2 h后采集血清，使用ELISA检测IFNG的表达。小鼠IFNG仅在野生鼠中检测到，人IFNG仅在纯合B-hIFNGR1/hIFNG小鼠中检测到。(B) IFNGR1表达分析。采集野生型小鼠和纯合B-hIFNGR1/hIFNG小鼠腹腔冲洗液来源的巨噬细胞，用抗IFNGR1抗体进行流式细胞术分析。人IFNGR1在B-hIFNGR1/hIFNG小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中检测不到。06IFN-γ信号通路相关人源化小鼠模型参考资料：[1] 中国医师协会血液科医师分会, 中华医学会儿科学分会血液学组, 噬血细胞综合征中国专家联盟. 中国噬血细胞综合征诊断与治疗指南（2022年版）[J]. 中华医学杂志, 2022, 102(20): 1492-1499.[2] Gocher AM, Workman CJ, Vignali DAA. Interferon-gamma: teammate or opponent in the tumour microenvironment? Nat Rev Immunol 2022; 22(3):158-172.[3] 张垚, 汤勇民. 儿童噬血综合征的研究进展[J]. 中国小儿血液与肿瘤杂志. 2020; 02: 112-117.[4] Fajgenbaum DC, June CH. Cytokine storm[J]. N Engl J Med. 2020 Dec 3;383(23):2255-2273.