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CD20(Cluster of Differentiation 20)是MS4A家族的一员,由297个氨基酸组成的磷蛋白,具有4个跨膜结构域,在B细胞发育中起关键作用。在血液、扁桃体、阑尾、淋巴结和脾脏等多组织表达,正常脑组织和一些免疫细胞上检测不到表达。CD20敲除小鼠与同窝野生型小鼠一样茁壮成长和繁殖,在其出生后第一年未出现任何明显的解剖或形态学异常,或对感染的易感性。CD20没有已知的天然配体,其功能是实现最佳的B细胞免疫应答,特别是针对T细胞非依赖性抗原。CD20表达密度存在B细胞亚群特异性差异,在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和黑色素瘤癌干细胞高表达。尽管CD20的功能尚不完全清楚,但它具有动态的细胞活性,是B细胞恶性肿瘤的理想特异性治疗靶标。CD20抗体的6种作用机制[1]CD20抗体CD20抗体是迄今为止最成功的抗肿瘤治疗方案之一,各大药企进行了各种基因工程研究和人源化改造,试图设计和生成强大的CD20抗体。CD20抗体生产的初步成功,推进了单克隆抗体设计方法不断改进。其中4种类型的CD20抗体,包括利妥昔单抗、Ofatumumab、Obinutuzumab和Ublituximab分别于1997年、2010年和2014年在美国和欧洲获批用于治疗慢性淋巴细胞白血病。CD20单克隆抗体设计的不断改进[2]CD20单克隆抗体批准上市时间表及对应症[3]目前,抗 CD20 单抗已经发展到第三代,每一代抗体药物均有各自特有的临床应用价值。01第一代CD20单克隆抗体第一代CD20抗体以利妥昔为代表,针对B细胞上CD20抗原的利妥昔单抗是一种基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体,是全球第一款CD20单克隆抗体(mAb)上市药物,上市后迅速成为治疗某些B细胞恶性肿瘤特定类型的标准方案,延续至今。美罗华@利妥昔单抗注射液第一代CD20单抗的疗效很好,甚至对于一直以来的治疗方案产生革命性的影响,但由于其是嵌合鼠/人单克隆抗体,因此使用时会存在一定的排异反应,产生负作用影响治疗效果。为提升治疗效果降低副作用,CD20单抗的药物制备技术不断更新换代,衍生出了第二代CD20单抗。02第二代CD20单克隆抗体第二代抗CD20 mAb将CD20人源化或者全人源改造,降低免疫原性,包括Ofatumumab、Veltuzumab和Ocrelizumab。Ofatumumab (OFA)是一种全人源 I 型抗CD20 IgG1k mAb。Ofatumumab与CD20分子的小和大胞外环(ECL)均结合,在杀伤靶细胞方面比利妥昔单抗更有效。OFA(arzerra)已获批用于治疗氣达拉滨和阿仑单抗治疗失败的复发性或难治性CLL(FA-ref),目前正在开发OFA联合其他药物治疗各种B细胞肿瘤。第二代CD20单克隆抗体[4]与一代CD20抗体相比二代CD20抗体免疫原性降低,减少不良反应,但是二代CD20抗体特异性和抗原结合的亲和力有所下降,因此第三代产品应运而生。03第三代CD20单克隆抗体第三代人源化CD 20 mAb具有Fc工程化改造,以增加其与FcyRIIIa受体的结合亲和力,包括 Ocaratuzumab、PR0131921和Obinutuzumab,均在进行不同适应症的临床开发。Ocaratuzumab(AME-133v)是一种 I  型人源化IgG1 mAb。其与CD20的结合亲和力增加13-20倍,与FcyRIIIa受体低亲和力(F/F和F/V)变体的亲和力增加5-7倍。这些可能是克服利妥昔单抗缓解率较低和缓解持续时间较短的机制。Obinutuzumab(GA101)在2013 年已获得美国 FDA 批准上市,主要适用于未经治疗的慢性淋巴细胞白血病患者以及联合苯达莫司汀二线治疗复发性滤泡性淋巴瘤。第三代CD20单抗[4]虽然CD20单抗的药物制备技术经过多次更新换代,二代三代各具优势,但与一代产品利妥昔单抗相比,在适应症和疗效上并未更具优势,因此目前市场上第一代产品利妥昔单抗依然占据绝对地位。发展前景CD20 单抗是世界上第一个上市的单克隆抗体,具有多年的临床治疗数据,对应不同的适应症以及设计优化,该靶点尚具有巨大的市场潜力。此外基于CD20靶点的研究的人源化单克隆抗体、双特异性抗体、CAR-T疗法、抗体偶联药物(ADC)、与小分子药物联合治疗等研究,均取得良好的效果。国内外有多家企业展开针对CD20靶点的单抗,双抗以及联用药物的研究,超110多个研究管线处于临床前期或已进入临床阶段,超23款药物已上市。今年9月,北京神州细胞自主研发的新型抗CD20单抗——“安平希”瑞帕妥单抗获批上市,是国产首款抗CD20单抗上市药物。国内外部分CD20药物临床研发进展数据来源:Cortellis通过众多临床试验及以往多年研究积累,证实了 CD20 靶点是治疗 B 细胞淋巴瘤的重要靶点,以CD20 为靶点研发出的药物在临床治疗 B 细胞淋巴瘤中发挥了关键作用。百奥动物自主研发的CD20系列人源化小鼠及细胞系,是靶向CD20抗体开发相关药物进行药效评价的优质模型。B-hCD20 mice01基本信息02mRNA表达分析RT-PCR分析CD20基因在野生型小鼠和B-hCD20小鼠中的表达情况。鼠CD20 mRNA仅在野生型(+/+)小鼠脾细胞中可检测到。人CD20 mRNA仅在纯合子B-hCD20(H/H)小鼠中检测到,而在野生型(+/+)小鼠中检测不到。03蛋白表达分析  用流式细胞术分析B-hCD20纯合子小鼠CD20的蛋白表达。采集野生型C57BL/6小鼠和纯合子B-hCD20(H/H)小鼠脾细胞,用种属特异性抗CD20抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CD20仅在野生型C57BL/6(+/+)小鼠中检测到;人CD20仅在纯合子B-hCD20(H/H)小鼠中检测到,在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。B-hCD28/hCD20 mice01基本信息02蛋白表达分析流式细胞术分析B-hCD28/hCD20纯合子小鼠CD28的蛋白表达。采集野生型C57BL/6(+/+)小鼠和纯合子B-hCD28/hCD20(H/H;H/H)小鼠脾细胞,用种属特异性抗CD28抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CD28仅在C57BL/6(+/+)小鼠中检测到;人CD28仅在纯合子B-hCD28/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到,在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。流式细胞术分析B-hCD28/hCD20纯合子小鼠CD20特异性表达。采集野生型C57BL/6(+/+)小鼠和纯合B-hCD28/hCD20 (H/H;H/H)小鼠脾细胞,用种属特异性抗CD20抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CD20仅在C57BL/6(+/+)小鼠中检测到;人CD20仅在纯合子B-hCD28/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到,在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。B-hCD3E/hCD20 mice01基本信息02蛋白表达分析流式细胞术分析B-hCD3E/hCD20纯合子小鼠CD3E的蛋白表达。采集野生型C57BL/6(+/+)小鼠和纯合子B-hCD3E/hCD20(H/H;H/H)小鼠脾细胞,用种属特异性抗CD3E抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CD3E仅在C57BL/6(+/+)小鼠中检测到;人CD3E仅在纯合子B-hCD3E/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到,在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。流式细胞术分析B-hCD3E/hCD20纯合子小鼠CD20的蛋白表达。采集野生型C57BL/6(+/+)小鼠和纯合子B-hCD3E/hCD20(H/H;H/H)小鼠脾细胞,用种属特异性抗CD20抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CD20仅在C57BL/6(+/+)小鼠中检测到;人CD20仅在纯合子B-hCD3E/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到,而在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。03免疫分型脾脏白细胞亚群的流式分析。分离野生C57BL/6(+/+)小鼠和B-hCD3E/hCD20 (H/H;H/H)小鼠(雌性,n=3,6周龄)的脾细胞并进行白细胞亚群流式分析。A.代表性单活CD45+细胞的流式分析。B.图A的统计学分析。结果显示:纯合子B-hCD3E/hCD20小鼠的T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的比例与C57BL/6小鼠相似,证明人源化CD3E/CD20不影响脾脏中这些细胞集群总体的发育、分化或分布。数值:平均值 ± SEM脾脏T细胞亚群的流式分析。分离野生型C57BL/6(+/+)小鼠和B-hCD3E/hCD20 (H/H;H/H)小鼠(雌性,n=3,6周龄)的脾细胞并进行T细胞亚群流式分析。A.代表性CD3+ T细胞的流式图分析。B. 图A的统计学分析。结果显示:纯合子B-hCD3E/hCD20小鼠的CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和Treg细胞的比例与C57BL/6小鼠相似,证明人源化CD3E/CD20不影响脾脏中这些T细胞集群总体的发育、分化和分布。数值:平均值 ± SEM人源化CD3E/CD20同样也不影响淋巴结、血液中白细胞亚群和T细胞亚群总体的发育、分化和分布。(数据未展示)B-hCD3EDG/hCD20 mice01基本信息02mRNA表达分析RT-PCR分析CD3DG基因在野生型小鼠和B-hCD3EDG/hCD20小鼠中的表达。小鼠Cd3d和Cd3g mRNA仅在野生型(+/+)小鼠胸腺细胞中检测到。人CD3D和CD3G mRNA仅在纯合B-hCD3EDG/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到,而在野生型(+/+)小鼠中检测不到。03蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD3EDG/hCD20小鼠中CD3E的蛋白表达。采集野生型C57BL/6 (+/+)小鼠和纯合子B-hCD3EDG/hCD20(H/H;H/H)小鼠脾细胞,用种属特异性抗CD3E抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CD3E仅在C57BL/6 (+/+)小鼠中检测到;人CD3E仅在纯合子B-hCD3EDG/hCD20 (H/H;H/H)小鼠中检测到,而在C57BL/6 (+/+)小鼠中检测不到。流式细胞术分析B-hCD3EDG/hCD20纯合子小鼠中CD20的蛋白表达。采集野生型C57BL/6 (+/+)小鼠和纯合子B-hCD3EDG/hCD20 (H/H;H/H)小鼠脾细胞,采用种属特异性抗CD20抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CD20仅在C57BL/6 (+/+)小鼠中可检测到;人CD20仅在纯合子B-hCD3EDG/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到,而在C57BL/6 (+/+)小鼠中检测不到。CD20靶点相关模型列表参考文献:1. Payandeh, Z. et al. The applications of anti-CD20 antibodies to treat various B cells disorders. Biomed Pharmacother 109, 2415-2426 (2019).2.  Lim, S.H. et al. Anti-CD20 monoclonal antibodies: historical and future perspectives. Haematologica 95, 135-143 (2010).3. Marshall, M.J.E., Stopforth, R.J. & Cragg, M.S. Therapeutic Antibodies: What Have We Learnt from Targeting CD20 and Where Are We Going? Front Immunol 8, 1245 (2017).4. Shundong Cangl, N.M., Kemeng Wang2 and Delong Liu2. Novel CD20 monoclonal antibodies for lymphoma therapy. Cang et al. Journal of Hematology & Oncology 5 (2012).

趋化因子(chemokines)是一类由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白,具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力,通过与G蛋白偶联跨膜受体(称为趋化因子受体,选择性地表达在靶细胞表面)相互作用来发挥其生物学效应。根据结构(氨基端(N端)半胱氨酸的排列方式),趋化因子被分为四个主要亚家族:CXC(CXCL1-17)、CC(CCL1-28)、XC(XCL1、XCL2)和CX3C(CX3CL1)四个亚族。 CC趋化因子亚族又称β趋化因子亚家族,其氨基末端有2个相近的半胱氨基结构。CC趋化因子亚族包含27种类型,依次为CCL1-CCL28(其中CCL10与CCL9相同),是一类可引起免疫细胞定向迁移至炎症部位的小分子分泌性蛋白。常见的有嗜酸性粒细胞趋化因子、单核细胞趋化蛋白及其他细胞亚群的趋化因子等。其受体有10个,分别为CCR1-CCR10。CC型趋化因子可趋化淋巴细胞、单核细胞、酸性粒细胞等细胞的游走趋化,在炎症反应、清除抗原、细菌感染等方面起着重要作用。CC趋化因子亚族列表CC趋化因子具有促癌和抗癌双重特性,主要对中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、树突细胞、NK细胞、T和B淋巴细胞等具有强大的趋化活性。比较重要的有:单核细胞趋化蛋白(MCP-1/CCL2)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP/CCL3)、RANTES/CCL5等。01CCL2在肿瘤侵袭转移中的作用  CCL2在肿瘤微环境中由肿瘤细胞和基质细胞表达,在肿瘤原发部位诱导肿瘤细胞增殖,刺激肿瘤细胞向周围细胞外基质迁移和侵袭,随后CCL2促进肿瘤细胞内渗进入循环,可能是通过招募宿主骨髓细胞来促进这一过程。一旦进入血液循环,CCL2可能会引导癌细胞沿着趋化梯度向转移部位扩散。肿瘤细胞被困在小毛细血管中会引发肿瘤细胞外渗,这种外渗进一步受到CCR2+髓系细胞和CCR2+内皮细胞的支持。最后,CCL2通过募集更多的骨髓细胞和内皮细胞促进转移部位的肿瘤生长和肿瘤定植。[1]02CCL3在白血病骨髓微环境中的作用  在白血病BM微环境(蓝色阴影区域)中,CCL3可诱导支持白血病细胞优势增殖的多个过程:(1)正常龛细胞向白血病适应细胞的转化;(2)选择性抑制正常HSPCs;(3)从BM中动员正常HSPCs。缩写:BM,骨髓;HSPC,造血干/祖细胞。[2]03CCL20在癌症中的作用  CCL20-CCR6信号通路通过增强癌细胞的迁移和增殖直接促进癌症进展,通过免疫细胞控制重塑肿瘤微环境间接促进癌症进展。[3]靶向趋化因子及其受体治疗人类肿瘤、自身免疫性疾病和慢性炎症愈发受到重视。然而,到目前为止针对趋化因子和趋化因子受体的药物研发才刚刚起步。已获批的抗体药物有CCR4抗体(Mogamulizumab)和CXCL8(IL-8)抗体ABCream。为了推动靶向趋化因子的药物开发,百奥动物自主研发了一系列趋化因子人源化动物&细胞模型。B-hCCL2 mice蛋白表达分析ELISA法检测纯合B-hCCL2小鼠种属特异性CCL2表达分析。收集野生型小鼠和纯合B-hCCL2小鼠体内抗mCD3ε抗体刺激4h的血清,用种属特异性CCL2 ELISA试剂盒进行ELISA分析。小鼠CCL2仅在野生型小鼠中可检测到。人CCL2仅在纯合B-hCCL2小鼠中可检测到,但在野生型小鼠中未检测到。B-hCCL3 mice蛋白表达分析ELISA法检测纯合B-hCCL3小鼠种属特异性CCL3表达分析。从野生型小鼠和纯合B-hCCL3小鼠中分离骨髓源性巨噬细胞(BMDM),体外用10 ng/mL LPS刺激,用种属特异性CCL3 ELISA试剂盒ELISA分析细胞培养上清液。在野生型小鼠中可检测到小鼠CCL3。人CCL3仅在纯合B-hCCL3小鼠中可检测到,但在野生型小鼠中未检测到。B-hCCL20 mice蛋白表达分析ELISA法检测纯合B-hCCL20小鼠中种属特异性CCL20表达分析。收集野生型小鼠和纯合B-hCCL20小鼠胸腺研磨上清,用种属特异性CCL20 ELISA试剂盒进行ELISA分析。在野生型小鼠中可检测到小鼠CCL20。人CCL20仅在纯合B-hCCL20小鼠中可检测到,但在野生型小鼠中未检测到。B-hCCL22 mice蛋白表达分析ELISA法对野生型小鼠和B-hCCL22小鼠中CCL22表达进行种属特异性分析。收集野生型小鼠和纯合B-hCCL22小鼠胸腺匀浆,用种属特异性CCL22 ELISA试剂盒进行ELISA分析。在野生型小鼠中可检测到小鼠CCL22。人CCL22 仅在纯合B-hCCL22小鼠中可检测到,但在野生型小鼠中未检测到。数值表示为平均值±SEM。ND:未检出。B-hCCR8/hCCL1 mice肿瘤微环境中CCL1的检测ELISA法检测C57BL/6和B-hCCR8/hCCL1荷瘤MC38细胞小鼠肿瘤微环境中CCL1。将小鼠结肠癌MC38细胞皮下植入C57BL/6和B-hCCR8/hCCL1小鼠(n=2或3)。当肿瘤体积约为600mm3时取肿瘤组织,并通过ELISA进行分析。在纯合B-hCCR8/hCCL1小鼠中可检测到人CCL1,含量约为150 pg/mg总蛋白。不同小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的比较不同小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞分析。B-hCCR8/hCCL1小鼠Treg细胞百分比(Th细胞%)与C57BL/6小鼠和B-hCCR8小鼠相比无显著差异。B-hCCL2 MC38蛋白表达分析ELISA法对B-hCCL2 MC38细胞中CCL2的表达进行分析。在B-hCCL2 MC38细胞的上清液中检测到人CCL2,但在野生型MC38细胞中未检测到。在野生型MC38细胞上清液中未检测到小鼠Ccl2。使用B-hCCL2 MC38细胞的2-D07克隆进行体内实验。肿瘤生长曲线和体重变化B-hCCL2 MC38细胞皮下同种移植瘤生长。将B-hCCL2 MC38细胞(5x105)和野生型MC38细胞(5x105)皮下植入C57BL/6N小鼠(雌性,7周龄,n=5)。每周测量两次肿瘤体积和体重。(A)平均肿瘤体积±SEM。(B)体重(平均值±SEM)。体积用mm3表示,公式为:V=0.5×长直径×短直径2。如A图所示,B-hCCL2 MC38细胞能够在体内建立肿瘤,并可用于疗效研究。B-Tg(hCCL1) MC38肿瘤浸润淋巴细胞分析与MC38细胞相比,荷瘤B-Tg(hCCL1)MC38细胞中CD3+ T细胞、CD4+ T细胞和Treg细胞占CD45+细胞的百分比显著增加。数据表示为平均值±SEM,采用单因素方差分析,然后进行Tukey检验,与其他列进行比较(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)肿瘤生长曲线和体重变化B-Tg(hCCL1) MC38细胞皮下同种移植物肿瘤生长。B-Tg(hCCL1) MC38细胞(5x105)和野生型MC38细胞(5x105)皮下植入B-hCCR8小鼠(雌性,8周龄,n=7)。每周测量两次肿瘤体积和体重。(A)平均肿瘤体积±SEM。(B)体重(平均值±SEM)。体积用mm3表示,公式V=0.5×长径×短径2。如A图所示,B-Tg(hCCL1) MC38细胞能够在体内建立肿瘤,并可用于疗效研究。B-Tg(mCcl2) MC38肿瘤生长曲线和体重变化B-Tg(mCcl2) MC38细胞皮下同种移植肿瘤生长。将B-Tg(mCcl2) MC38细胞(5x105)和野生型MC38细胞(5x105)皮下植入C57BL/6小鼠(雌性,6周龄,n=5)。每周测量两次肿瘤体积和体重。(A)平均肿瘤体积±SEM。(B)体重(平均值±SEM)。体积用mm3表示,公式为:V=0.5×长直径×短直径2。如A图所示,B-Tg(mCcl2) MC38细胞能够在体内形成肿瘤,可用于疗效研究。肿瘤中mCcl2的表达分析实验结束时采集肿瘤细胞,ELISA检测小鼠Ccl2表达。如图所示,小鼠Ccl2在肿瘤匀浆中高表达。数据表示为平均值±SEM,采用T检验进行分析并与G1进行比较。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)参考资料1、Lim, Su et al. Oncotarget. 7 (2016).2、Baba T ,  Mukaida N . Role of macrophage inflammatory protein (MIP)-1α/CCL3 in leukemogenesis[J]. Molecular & Cellular Oncology, 2014, 1(1):-.3、Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5186

上半年,宝船生物与百奥赛图合作研发的TNFR2非阻断型全人抗体药物(代号BC011)的实验数据已在2022年美国癌症研究协会(AACR)年会上公布。 BC011是一款新型TNFR2非阻断治疗抗体,来源于RenMab人源化IgG小鼠。通过在TNFR2人源化的肿瘤同源小鼠模型中进行无差别、高通量的体内有效性筛选,从大量候选抗体中筛选出了BC011。BC011能够促进CD8+T细胞增殖,耗竭Treg细胞,从而增加肿瘤微环境中效应T细胞的比例。 TNFR2靶点概览TNFRSF1B(TNF receptor superfamily member 1b)为TNF受体超家族成员,也称为TNFR2,在某些免疫细胞亚群(如CD4+和CD8+ T细胞)、内皮细胞、小胶质细胞和特异性神经元亚群、少突胶质细胞、心肌细胞和人间充质干细胞上表达。在多种肿瘤细胞中也有高表达,如黑色素瘤、肠癌和卵巢癌等。在肿瘤微环境中,TNFR2在Treg细胞中高表达,具有很好的特异性,是免疫逃逸和肿瘤增殖的潜在驱动力。TNFR2是I型跨膜糖蛋白,由461个氨基酸组成,其中前256个氨基酸形成包含四个富含半胱氨酸基序的胞外结构,31个氨基酸形成跨膜结构域,后174个氨基酸形成具有TRAF2结合位点的胞内结构。图1. TNFR2结构[1]TNFR1(p55,TNFRSF1A)和TNFR2(p75,TNFRSF1B)是同源关系最近的两个蛋白,他们分别激活两个独立的细胞内信号通路进行基因转录。TNFR1几乎在身体的所有细胞上都有表达,包括整个淋巴系统。从功能上讲,TNF主要依赖TNFR1进行凋亡,依赖TNFR2进行与T细胞存活相关的功能--TNFR2信号通过核转录因子NF-κB促进pro-survival基因的转录。图2. TNFR2信号在肿瘤中的作用机制[2]许多实验表明TNFR2抑制剂一方面可以有效阻断TNF跟TNFR2的结合,抑制Treg的增殖和功能,也可以靶向杀伤TNFR2高表达的肿瘤细胞,跟PD-(L)1抑制剂在体内都有非常好的协同效果;然而针对自身免疫病,TNFR2激活剂可进一步活化Treg细胞,抑制Teff细胞,下调免疫细胞的过度活化。因此,TNFR2作为肿瘤和自身免疫病的新一代治疗靶点,为肿瘤和自免疾病治疗提供了一种全新的策略。图3. 激动剂与抑制剂作用示意图[3]TNFR2靶点药物在研进展TNFR2作为肿瘤和自身免疫病治疗的潜力靶点,目前在研项目较少,绝大多数仍处于临床前阶段,速度最快的也仅推进至Ⅰ期临床。BioInvent全面布局了TNFR2抑制剂与TNFR2激动剂,其中TNFR2抑制剂BI-1808已处于临床Ⅰ期,除了单药疗法外,与PD-1抑制剂联用方案是药物重要的开发策略。聚焦国内,维立志博的TNFR2抗体药物LBL-019于9月29日临床试验申请获CDE受理,临床进展居前。此外,百济神州于2021年2月由Boston Immune(BITT)引入TNFR2抗体BITR2101,计划探索与替雷利珠单抗的联用方案。数据来源于科睿唯安相关动物模型对于TNFR2靶向调节剂的开发可谓至关重要,BioMice百奥动物自主研发的TNFR2系列人源化小鼠是评估TNFR2相关抗体药物的优质临床前实验动物模型。B-hTNFR2 mice蛋白表达分析通过流式细胞术对野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠中TNFR2蛋白表达进行分析。用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠,收集脾细胞,并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示:在C57BL/6小鼠B、T和Treg细胞表面检测到mTNFR2,在B-hTNFR2纯合鼠B、T和Treg细胞表面检测到hTNFR2。TNFR2人源化不影响脾脏、淋巴结中白细胞各亚群比例(数据未展示)。TNFR2抗体与B-hTNFR2纯合鼠T细胞结合分析 从B-hTNFR2小鼠(n=3)中分离出脾细胞。通过流式细胞术测试TNFR2抗体与脾细胞的结合。从anti-mCD3ε(0.2或1μg/mL)和anti-mCD28(1μg/mL)体内刺激的B-hTNFR2小鼠分离出脾细胞。如图所示,与同型对照抗体(hIgG)相比,hTNFR2 Ab2与B-hTNFR2纯合鼠的T细胞是结合的。在anti-mCD3ε(0.2μg /mL)刺激条件下,mTNFα增强了hTNFR2 Ab2与B-hTNFR2纯合鼠的T细胞结合,这表明mTNFα/hTNFR2信号通路在B-hTNFR2纯合鼠中是可行的。TNFR2抗体药效验证抗人TNFR2抗体在B-hTNFR2小鼠中的抗肿瘤活性。B-hTNFR2小鼠(雌性,6-7周龄,n=8)皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞(5E5)。当肿瘤体积达到约100 mm3时,对小鼠进行分组,然后使用抗人TNFR2抗体进行治疗。如图A所示,抗人TNFR2抗体能够有效控制B-hTNFR2小鼠的肿瘤生长,且呈剂量依赖性,证实B-hTNFR2小鼠模型是体内TNFR2抗体药理功效研究的有力工具。(hTNFR2 Ab2由客户提供)B-hTNFA/hTNFR2 mice抗人TNFR2抗体的体内有效性抗人TNFR2抗体在B-hTNFA/hTNFR2小鼠中的抗肿瘤活性。B-hTNFA/hTNFR2 小鼠(雌性,7周龄)皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞(5E5)。当肿瘤体积达到约100 mm3时,对小鼠进行分组,然后使用抗人TNFR2抗体进行治疗。如图A所示,抗人TNFR2抗体能够有效控制B-hTNFA/hTNFR2 小鼠的肿瘤生长,证实B-hTNFA/hTNFR2 小鼠模型是体内TNFR2抗体药理功效研究的有力工具。B-hTNFR2/hTNFR1 mice蛋白表达分析通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1 小鼠中TNFR2的蛋白表达。用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1(H/H)小鼠,收集野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1 小鼠的脾细胞,并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠TNFR2仅在野生小鼠中检测到,人TNFR2仅在纯合B-hTNFR2/hTNFR1小鼠中检测到。通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1 小鼠中TNFR1的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1(H/H) 小鼠的脾细胞和血液,并用种属特异性抗TNFR1抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠TNFR1仅在野生小鼠中检测到,人TNFR1仅在纯合B-hTNFR2/hTNFR1小鼠中检测到。B-hCTLA4/hTNFR2 mice蛋白表达分析通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCTLA4/hTNFR2 小鼠中CTLA4的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCTLA4/hTNFR2 小鼠的脾脏,并用种属特异性抗CD152(CTLA4)抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CTLA4仅在野生小鼠中检测到,人CTLA4仅在纯合B-hCTLA4/hTNFR2小鼠中检测到。通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCTLA4/hTNFR2小鼠中TNFR2的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCTLA4/hTNFR2小鼠的脾脏,并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠TNFR2仅在野生小鼠中检测到,人TNFR2仅在纯合B-hCTLA4/hTNFR2小鼠中检测到。B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2 mice抗人PD-1和抗人TNFR2抗体联合治疗抗人PD-1抗体联合抗人TNFR2抗体在B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠中的抗肿瘤活性。B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠(雌性,6-7周龄,n=5)皮下接种hPD-L1 MC38细胞。当肿瘤体积达到约100 mm3时,对小鼠进行分组,然后使用抗人PD-1抗体和人hTNFR2抗体进行治疗。如图A所示,PD-1和hTNFR2抗体联合给药组的抑制作用强于单独给药组,证明B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠为评价hTNFR2抗体和hPD-1抗体联合给药疗效提供了有力的体内临床前模型。B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1 mice抗人TNFR2抗体的体内有效性抗人TNFR2抗体在B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1小鼠中的抗肿瘤活性。B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1 小鼠(雌性,8周龄,n=6)皮下接种鼠结肠癌 MC38 细胞。根据体重差异对小鼠进行分组,此时用客户提供的抗 TNFR2 Ab1 处理。如图 A 所示,抗人 TNFR2 抗体可有效控制 B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1 小鼠的肿瘤生长,且呈剂量依赖性,证明 B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1 小鼠为体内评价抗人 TNFR2 抗体提供了有力的临床前模型。TNFR2靶点相关模型列表参考文献[1] Medler, J.; Kucka, K.;Wajant, H. Tumor Necrosis Factor Receptor 2 (TNFR2): An Emerging Target in Cancer Therapy. Cancers 2022, 14, 2603. https://doi.org/ 10.3390/cancers14112603[2] Hiroyuki Takahash, Gumpei Yoshimatsu, Denise Louise Faustman. The Roles of TNFR2 Signaling in Cancer Cells and the Tumor Microenvironment and the Potency of TNFR2 Targeted Therapy. Cells. 2022;11(12):1952.[3] éva S. Vanamee, Faustman D L . TNFR2: A Novel Target for Cancer Immunotherapy. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2017.09.007

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是全球第二大常见的恶性血液肿瘤,始于骨髓中健康的浆细胞恶性增殖。在当前是一种较难治愈的疾病,大多数患者终将复发。据统计,2020年全球有超过17万人被诊断出患有多发性骨髓瘤,60岁以上老人属于该病的高发群体,发病年龄亦有呈年轻化的趋势。随着我国人口老龄化趋势上升,多发性骨髓瘤的防治负担将逐年加剧,成为危害人们身体健康的一大挑战。多发性骨髓瘤从癌前到有明显疾病症状的演变过程,在SMM阶段的早期发现和早期干预以及预防或治疗策略可能是提高这种复杂疾病治愈率的途径。[1]  左图:正常的骨髓 ,右图:多发性骨髓瘤;多发性骨髓瘤中可见大量恶性浆细胞,其特征是在细胞核附近的细胞质内有一个苍白的区域。[2]目前,针对MM的治疗药物有糖皮质激素、细胞毒性药物、免疫抑制剂、蛋白酶抑制剂、单抗和细胞疗法等。其中,免疫治疗已经在许多癌症领域被证明是革命性疗法,但由于MM存在免疫抑制微环境现象,影响了免疫治疗的疗效,导致其对MM的治疗进展较为缓慢。MM细胞与骨髓(BM)微环境之间的相互作用,对MM的发病起着关键作用,可通过诱导或分泌细胞因子促进肿瘤细胞生长、免疫逃逸及耐药,增加Treg细胞的数量,抑制效应T细胞的杀伤等。靶向特定肿瘤抗原或逆转具有免疫抑制作用的骨髓微环境的免疫疗法可以帮助改善MM的标准治疗方案。骨髓MM微环境中的抗骨髓瘤作用[3]细胞重定向BiAb和BiTE同时结合MM细胞上的骨髓瘤特异性抗原和T细胞上的CD3。MM抗原包括BCMA, CD38, CS1/SLAMF7, GPRC5D和FcRH5,如图示。BiAbs或自然杀伤细胞衔接器(NKCEs)也靶向自然杀伤(NK)细胞相关受体抗原(如CD16A, NKG2D, NKp30),激活NK细胞并增强其抗MM活性。双特异性分子,包括双特异性抗体(BsAbs)和双特异性T细胞衔接器(BiTEs),通过同时结合MM细胞和免疫效应细胞上的抗原,使这些细胞靠近从而促进免疫细胞裂解MM细胞。靶向BCMA和GPRC5D的BsAbs已展示出很好的临床疗效,针对FcRH5的早期临床试验结果也非常有前景。这些药物的免疫调节作用不依赖主要组织相容性复合体(MHC) I类的抗原提呈,可在没有共刺激的情况下发生,适用于免疫系统功能失调的MM患者。BCMA01全称B细胞成熟抗原,又名CD269或TNFRSF17,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,仅高表达于浆细胞表面,部分表达于浆细胞样树突状细胞,是MM免疫治疗的理想靶点。针对BCMA靶点开发的肿瘤免疫疗法主要分为3类:嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)、双特异性抗体(BsAb)、抗体药物偶联物(ADC)。GPRC5D02全称G蛋白偶联受体C57家族亚型D,为7次跨膜蛋白,高表达于浆细胞表面,低表达于毛囊区域,其他健康细胞则不表达,为治疗MM的潜在候选靶点。GPRC5D的表达与BCMA不相关,联合靶向这两个靶点的疗法可以发挥互补效应或开发双靶点CAR-T、双抗。FcRH503又称FcRL5、CD307或免疫球蛋白超家族受体易位相关蛋白2 (Immunoglobulin Superfamily Receptor Translocation Associated 2, IRTA2),是一种功能未知的膜蛋白,只表达于B细胞系,包括骨髓瘤细胞。临床前研究的数据表明,FcRH5/CD3双抗可成功激活T细胞,诱导细胞因子产生,并清除恶性浆细胞。根据科睿唯安数据库检索,靶向MM相关靶点药物研究数量众多,部分靶点研究进展情况见下表。强生的Darzalex是在2015年第一批被批准用于MM治疗的免疫疗法,这一时期MM的抗体药研发主要集中在靶向CD38靶点;到2020年GSK研发的首个靶向BCMA药物Blenrep在美获批,2021年BMS的Abecma上市,今年传奇生物的Carvykti上市以及强生的Teclistamab作为全球首个CD3/BCMA双抗获批即将上市,另外还有众多管线处在临床前或临床试验阶段,靶向BCMA赛道的药物研发可谓相当火热。布局靶向MM治疗药物的新靶点,避免同质化竞争,或许也不失为后来者开发该适应症药物以占得先机的上策,当然面临的风险也随之提高。部分药物研究进展整理自科睿唯安数据库及网络百奥动物利用基因编辑技术自主开发了MM相关靶点人源化小鼠及细胞系,助力抗体药物临床前研究。部分数据展示如下:B-hCD38 mice蛋白表达分析采集野生型C57BL/6小鼠和纯合B-hCD38小鼠的脾细胞和血液,用种特异性抗CD38抗体进行流式细胞术分析。小鼠CD38在WT小鼠中检测到。纯合B-hCD38中只检测到人CD38,而WT小鼠检测不到人CD38。药效验证将小鼠T淋巴细胞瘤B-hCD38-luc E.G7-OVA细胞经尾静脉注射到B-hCD38纯合小鼠(雌性,6周龄,n=6)体内。当总通量达到约106 Ig时,将小鼠分组,并用抗人CD38抗体对其进行治疗。(A) 抗人CD38抗体(内部合成)抑制B-hCD38-luc E.G7-OVA小鼠肿瘤生长。(B) 治疗期间体重变化。(C) B-hCD38-luc E.G7-OVA细胞的体内荧光素酶成像图。每周2次测量信号强度和体重,第0、3、7、10天行影像学检查。值表示为平均值±SEM。B-hBCMA micemRNA表达分析RT-PCR分析野生型C57BL/6小鼠和B-hBCMA小鼠BCMA基因特异性表达情况,鼠Bcma mRNA仅在野生型C57BL/6小鼠脾细胞中检测到,人BCMA mRNA仅在纯合B-hBCMA小鼠中检测到。B-hGPRC5D micemRNA和蛋白表达分析(A) RT-PCR分析野生型C57BL/6小鼠和B-hGPRC5D小鼠GPRC5D基因的特异性表达情况,鼠Gprc5d mRNA仅在野生型C57BL/6小鼠睾丸中检测到。人GPRC5D mRNA仅在纯合B-hGPRC5D小鼠中检测到。(B) 取野生型C57BL/6小鼠和纯合B-hGPRC5D小鼠的脾脏,用抗GPRC5D抗体进行western blot分析。由于抗体的交叉反应性,GPRC5D在WT小鼠和纯合B-hGPRC5D小鼠中均可检测到。 相关产品列表 更多数据信息,欢迎联系我们。参考资料[1] https://doi.org/10.1016/j.ctrv.2021.102284[2] https://www.cancer.net/cancer-types/multiple-myeloma/introduction[3] doi: 10.3389/fonc.2022.1032775[4] doi:10.3390/jcm9072166

经历新冠近四年,疫情仍然以星星之火的态势影响着国内外。近两年来,全球研发企业与投资机构的目标几乎都投向了承担着“事前预防”角色的疫苗企业,但此刻亦有许多医药巨头正在悄然行动,在“事后补救”的抗纤维化赛道上积极布局。其中不乏 Boehringer Ingelheim、Genentech、BMS、Roche(Promedior)这些国际大厂,也有 FibroGen、Pliant Therapeutics、Galecto、Blade Therapeutics 等生物技术公司[1]。医药巨头的关注无疑是对领域未来机会的认可。目前,全球仅上市吡非尼酮(抑制TGF-β1的生成和减少血管因子的合成)和尼达尼布(血管生成因子抑制剂)两款药物,但两款药物因其安全性不佳,并且药效有限,仅仅可以延缓病人的纤维化进展,靶点和机理等药理学内容模糊。因此,以 Pfizer 和 Gilead 为代表的跨国制药巨头,已逐渐将新药开发战略重心转移至抗纤维化药物领域中,以满足巨大的市场需求。不是癌症的癌症--纤维化纤维化(Fibrosis)其实是多种类型组织损伤尤其是在慢性炎症性疾病过程中,组织修复反应失调的结局。纤维化几乎发生在所有器官和组织中,例如心、肝、肺、肾、皮肤等,长期以来,人们一直认为纤维化不可逆,但临床前模型和临床试验均表明,它是一个高度动态变化的过程。当组织受到损伤时,多种来源的肌成纤维细胞可通过重塑细胞外环境来启动伤口愈合反应,以恢复组织完整性并促进实质细胞的替换。通常,当组织愈合时,这个促纤维化程序被关闭。然而,持续的损伤和损害会导致这一过程的失调,导致细胞外基质(ECM )蛋白在病理上的过度沉积,并伴随着肌成纤维细胞活性的上调,造成巨噬细胞和免疫细胞浸润的慢性炎症环境。在这种细胞环境中,细胞因子和生长因子被大量释放,包括转化生长因子-β(TGF-β)家族成员和 Wingless/Int-1(Wnt1),它们是纤维化过程的主要效应子。TGF-β 和 Wnt1 结合其干细胞表面受体,并发起下游信号转导,最终分别导致 Smad2/3 和 CBP/β-Catenin 转录调节物的核易位。这导致靶基因表达上调,其功能进一步增强肌成纤维细胞分化和 ECM 蛋白(包括胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白)的产生和分泌。随着过多 ECM 沉积的进行,基体的结构发生变化并变硬。细胞通过细胞表面整合素受体(激活 Hippo 信号转导通路及其主要下游效应子 YAP 和 TAZ)的机械传导感受 ECM 张力。在另一个前向循环中,激活的 YAP 和 TAZ 转位到胞核,促进包括 CTGF 和 PDGF 在内的促生长基因的上调,这些基因通过 PI3K/AKT/mTOR 通路促进肌成纤维细胞的增殖和活化。纤维化损伤过程[2]常见的与纤维化有关的疾病有:特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)、肝硬化、慢性肾病、心肌梗死、心力衰竭以及非酒精性脂肪肝炎(NASH)等。纤维化还影响肿瘤侵袭和转移、慢性移植物排斥和许多进行性肌病的发病机制。除器官损伤外,纤维化还与癌症进展有关,因为纤维化 ECM 可刺激细胞增殖并改变细胞极性,从而促进肿瘤发育和生长。抗纤维化的应用领域广泛且机制具有一定的共性,因此专注于抗纤维化药企的平台技术具有通用性,目前各家企业的重心一般集中于抗肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心血管纤维化以及皮肤、视网膜纤维化等领域,其中,领先企业往往先从IPF以及肝纤维化开始,然后进行延展。由于体外药效无法模拟真实体内纤维化环境,抗纤维化药物筛选只能使用漫长的体内试验来进行,几乎所有的新药筛选捷径,包括人工智能,都无法加快抗纤维化药物的研发进程。因此,临床前动物模型在药物研发过程中显得尤为重要,百奥动物自主研发了相应的肝纤维化和肺纤维化模型,为该领域临床前药效评价提供了稳定有效的工具,助力抗纤维化药物研究。肝纤维化模型四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝纤维化是被广泛接受的研究肝纤维化实验模型。它在许多方面反映了与毒性损伤相关的人类疾病模式,如α-SMA表达、星状细胞活化和关键基质成分(包括胶原蛋白-1、基质金属蛋白酶及其抑制剂TIMPs)已在该模型的发病机制中得到证实。CCl4诱导肝纤维化模型的建立及组织学评价四氯化碳 (CCl4) 诱导的肝纤维化模型。8周龄雄性 C57BL/6 小鼠腹腔注射浓度为0.25、0.5和0.75 mL/kg的CCl4,每周2次。4、6和8周后小鼠的体重、肝重/体重和血液生化数据如上图。使用CCl4 诱导6周的肝纤维化模型。(A) H&E染色的代表性图片显示 CCl4 诱导后肝脏炎症增加。比例尺:50 μm。(B) 免疫组化的代表性图片,显示肝巨噬细胞(kupffer cells)标记物F480。(C-D) 天狼星红染色的代表性图片,显示肝纤维化增加。比例尺:200 μm。(E-F) 免疫组织化学的代表性图片显示肝脏中的成纤维细胞标志物α-SMA水平。比例尺:300 μm。 奥贝胆酸(OCA)在小鼠肝纤维化模型中的药效验证奥贝胆酸(OCA)治疗后肝纤维化减轻。(A) 图为经CCl4 诱导和 OCA 处理3周后,天狼星红染色显示肝纤维化的代表性图片。(B) 图表示天狼星红染色统计数据。数值为平均值±SEM。*p < 0.05。胆管结扎诱导的肝纤维化胆管结扎引起肝外胆道梗阻,从而导致胆管扩张和胆汁淤积。当胆管内压力进一步升高时,肝内胆管扩张破裂,肝内血管被扩张的胆管和外渗的胆汁同时压迫,肝细胞缺血坏死,纤维组织增生,围绕肝小叶向肝细胞周围扩散,最终可导致肝纤维化。胆管结扎诱导肝纤维化模型的建立胆管结扎肝纤维化模型。(A) 图表示血清中ALT、AST、ALP、GGT和TBIL水平。 (B) 图表示BDL后4周肝脏代表性外观。数值为平均值±SEM。*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001。胆管结扎所致肝纤维化模型的组织学评价胆管结扎4周后H&E和天狼星红染色。(A) 图表示H&E染色代表性病理改变。(B) 图天狼星红染色代表性图片显示肝纤维化增加。(C) 图表示胶原纤维阳性信号区比例。数值为平均值±SEM。* p < 0.05。胆管结扎4周后免疫组化染色。 (A-B) 免疫组化染色的代表性图像显示 F4/80 和阳性信号区比例。(C-D) 免疫组化染色代表性图像显示α-SMA水平和阳性信号区比例。硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化模型硫代乙酰胺 (TAA) 是一种广泛用于模拟肝纤维化发病机制中产生损伤的化合物。TAA 通过其代谢产物硫代乙酰胺二氧化硫 (TASO2) 增加活性氧 (ROS) 的形成,引起严重的氧化应激以及脂质过氧化和蛋白质羰基和 DNA 加合物的生成。产生的ROS,引起肝星状细胞 (HSC) 活化,同时诱导造血干细胞转分化为肌纤维母细胞样细胞,导致 EMC 合成和降解失衡及持续纤维化过程。TAA诱导肝纤维化模型的建立及组织学评价TAA 诱导肝纤维化模型4周。(A-B) 血清中 ALT 和 AST 水平。(C) H&E染色的代表性图片。(D-E) 免疫组化染色的代表性图像显示α-SMA水平和阳性信号区比例。(G-F) 天狼星红染色的代表性图像显示肝纤维化增加。TAA 诱导肝纤维化模型6周。(A-B) 血清中 ALT 和 AST 水平。(C) H&E染色的代表性图片。(D-E) 免疫组化染色代表性图像显示α-SMA水平和阳性信号区比例。(F-G) 天狼星红染色的代表性图片,显示肝纤维化增加。肺纤维化模型博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化小鼠模型博来霉素 (BLM) 能够引起与接受化疗患者相似的组织学肺模式,是目前诱导动物肺纤维化应用最广泛的药物之一。BLM 通过裂解DNA、诱导炎症反应和增加上皮凋亡剂量发挥其细胞毒性作用,从而刺激肺损伤并导致纤维化。 肺纤维化小鼠模型的建立及组织学评价博来霉素诱导的肺纤维化。C57BL/6J 小鼠在第0天给予博来霉素,每天记录体重,实验结束时收集肺组织,测定肺内羟脯氨酸 (HYP)。 (A) 博来霉素导致体重减轻。 (B)存活率缩短。 (C) HYP 含量增加。 (D) 病理学检查显示显著肺纤维化。 Pamrevlumab 在肺纤维化模型(B-hCCN2小鼠)中的药效验证Pamrevlumab 对博来霉素诱导的体重减轻的影响。B-hCCN2 小鼠在第0天给予博来霉素,然后每两天注射一次 Pamrevlumab 或溶剂,共7次,每天记录体重。实验结果表明,Pamrevlumab治疗能够改善博来霉素诱导的 B-hCCN2 小鼠体重减轻,并可有效降低博来霉素诱导的死亡率。Pamrevlumab 对博来霉素诱导的肺纤维化的影响。 (A) 博来霉素诱导 HYP 含量增加,Pamrevlumab 治疗降低了肺中 HYP 含量。(B) Masson 染色和H&E染色的代表性图像。(C) 条形图显示了纤维化严重程度的定量平均评分。数值为平均值±SEM,n = 4-8,单因素 ANOVA 和 Dunnett 检验,***P < 0.001,**P < 0.01。Micro-CT在肺部疾病模型的研究应用博来霉素诱导肺纤维化模型—直方图、体积根据不同HU区间进行正常、低通气、不通气区域体积的分割。在第4周,结果显示低通气和不通气区域的比例都很高,然后在第10周和第16周之间明显减少,而在正常通气的区域,则呈现相反的趋势[3]。通过使用Micro-CT对小鼠肺部区域进行扫描重建成像,利用肺部分析算法(Hounsfield单位阈值范围分别为-434至-121HU和-120至121HU)实现对通气不良和非通气不良区域的影像区分,从而实现对肺部区域动态检测,并进行功能和结构的评价。量化的影像数据也能提供纵向研究的信息以减少动物之间的变异性,可以更进一步验证体外数据。百奥动物可以提供的模型及检测指标令人期待的未来突破勃林格殷格翰作为肺纤维化治疗领域的全球市场领导者,在这个存在高度未满足医疗需求的领域成功而大胆迈出的第一步是前文所说的尼达尼布(BI BF1120),而今年2月BI 1015550也已经被美国食品药品监督管理局(FDA)授予突破性治疗认定。勃林格殷格翰未来将启动一项III期临床试验,以进一步研究BI 1015550治疗IPF和进行性肺纤维化(PPF)患者的疗效,并希望能尽快让该药物惠及全球患者[4]。Pliant Therapeutics,Inc.是一家临床阶段的生物制药公司,致力于发现和开发用于治疗纤维化的新型疗法。今年7月,Pliant Therapeutics 也公布了其INTEGRIS-IPF  IIa期试验积极结果,其药品PLN-74809在患有特发性肺纤维化(IPF)患者身上达到主要与次要终点,呈现剂量相关疗效,并具有良好的耐受性。2021年2月,北京泰德制药与美国Graviton Bioscience Corporation 签订治疗纤维化创新药TDI01海外授权合作协议,首付款及研发、销售里程碑付款最高可达 5.175亿美元。近年来,随着企业临床及各方面的不断推进、纤维化的细胞和分子机制不断被阐明,且新冠疫情后人们对于抗纤维化重视加深,叠加肿瘤赛道的逐渐拥挤,抗纤维化治疗领域被开发的价值不断体现。我们也期待早日拥有更多创新药物用于改善病患生活质量。参考来源:[1] https://mp.weixin.qq.com/s/L8QVMXsh_8-Kk1-iKbeQVA[2] Nie X ,  Qian L ,  Sun R , et al. Multi-organ proteomic landscape of COVID-19 autopsies - ScienceDirect[J]. Cell, 2021.[3] Song Shengren,Fu Zhenli,Guan Ruijuan et al. Intracellular hydroxyproline imprinting following resolution of bleomycin-induced pulmonary fibrosis.[J] .Eur Respir J, 2022.[4] https://mp.weixin.qq.com/s/EwbXZN77rPwapjFYdRexVQ

转化生长因子β(TGFβ)是一种多功能的细胞因子,对细胞增殖、分化、粘附、迁移和凋亡具有多重功能。多种类型细胞均可分泌,最早从人血小板中鉴定。哺乳动物中表达三种类型TGFβ:TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3,每种由不同的基因编码,并通过结合相同的TGFβ受体发挥相应功能。其中TGFβ2和TGFβ3在胚胎发育中发挥重要作用,而TGFβ1则主要参与控制出生后的免疫反应[1]。三种TGFβ起初均表达为非活性蛋白复合物(SLC或LLC)。TGFβ1同型二聚体与潜伏相关肽(Latent Associated Peptide, LAP)(TGFβ1 N 端具有的长 20~30 个氨基酸的序列)形成的复合被称为小潜复合物 (Small Latent Complex, SLC)。在细胞外,SLC 与 潜伏TGFβ1结合蛋白(Latent TGFβ Binding Protein, LTBP)结合形成的复杂复合物被称为大潜复合物(Large Latent Complex, LLC)。TGFβ的活化有以下3种途径:1)SLC在胞外被蛋白酶水解;2)LLC被细胞外基质铆钉,进而由αβ整合素介导释放有活性的TGFβ;3)SLC被细胞表面的GARP铆钉,并由αβ整合素介导释放有活性的TGFβ。接下来,具有活性的TGFβ与TGFβRII二聚体结合,随后进一步与TGFβRI二聚体结合,形成四聚体,激活下游信号通路,调节基因表达。图1. TGFβ信号通路[2,3]稳态条件下,TGFβ1信号不仅调节多种组织细胞的生长、增殖和分化;也指导免疫系统的耐受和炎症抑制,尤其在胃肠道起重要作用。TGFβ1调节功能的多样性赋予了它在肿瘤发生和发展中亦正亦邪的双面性。在癌症发生早期,TGFβ是一个抑癌因子,可发挥细胞周期阻滞作用,阻断细胞从G1期进入S期,达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。然而,随着炎症加剧,一些癌细胞可能会发生突变,使其对TGFβ信号通路不响应,或响应与凋亡脱钩、反变为促进癌细胞转移和定植。同时,肿瘤细胞亦可大量分泌TGFβ1发挥免疫抑制功能,抑制T、B淋巴细胞与NK细胞活化和分化,造成机体免疫功能障碍,使得肿瘤细胞免疫逃逸(图2)。图2. TGFβ的抑癌和促癌信号[2]针对TGFβ信号通路的在研药物主要包括配体抗体、配体陷阱(如bintrafusp alfa)、受配体抗体、小分子激酶抑制剂等,主要聚焦于肿瘤免疫疗法[4]。目前,处于临床阶段的TGFβ1配体抗体药物如下表所示:数据整理自Cortellis数据库为了更好的助力靶向TGFβ1的新药研发,百奥动物自主研发了TGFβ1人源化小鼠B-hTGFB1 mice,用于靶向TGFβ1药物的临床前药效评估。B-hTGFB1 mice 图3. RT-qPCR分析B-hTGFB1小鼠和野生型小鼠的TGFB1 mRNA的表达。B-hTGFB1小鼠中人TGFB1 mRNA表达量与野生型小鼠中的鼠TGFB1 mRNA表达量类似。这表明人TGFB1基因原位替换不影响TGFB1 mRNA的表达。图4. 利用流式细胞仪分析纯合B-hTGFB1小鼠和野生型小鼠的血小板中TGFB1蛋白的种属特异性表达。小鼠的TGFB1仅在野生型小鼠中被检测到,人TGFB1仅在纯合B-hTGFB1小鼠中检测到。脾脏中TGFB1蛋白的表达同样也具有种属特异性(数据未展示)。TGFB1人源化不影响脾脏、淋巴结、血液中白细胞各亚群比例(数据未展示)。图5. 抗体结合实验。从B-hTGFB1小鼠和野生型小鼠取血,用流式细胞术分析血小板人LAP的表达。SRK-181可特异性结合SLC并抑制TGFβ1活化[5]。于是,在SRK-181处理过的纯合B-hTGFB1小鼠和野生型小鼠中均能检测到人LAP的表达;而未处理的鼠中不能检测到人LAP的表达。(hLAP抗体可人鼠交叉识别。)图6. 抗鼠PD-1抗体和抗人TGFβ1抗体联用在B-hTGFB1小鼠中的抗肿瘤作用。(A)mPD-1和hTGFβ1抗体(自制)联用可抑制B-hTGFB1小鼠中MC38肿瘤的生长;(B)治疗期间的体重改变。数值为平均值±SEM。由图可见,抗鼠PD-1抗体和抗人TGFβ1抗体联用可有效控制B-hTGFB1小鼠中的肿瘤生长,说明B-hTGFB1小鼠是TGFβ1抗体药物临床前评估的有力模型。相关产品列表 品系货号B-hTGFB1 mice112245B-hTGFBR2 mice110874B-hGARP mice110102B-hGARP/hTGFB1 mice112241B-hLRRC33 mice110757B-Tgfβ1 cKO mice110164参考资料1. Stockis, J., Dedobbeleer, O. & Lucas, S. Role of GARP in the activation of latent TGF-β1. Molecular bioSystems 13, 1925-1935 (2017).2. Batlle, Eduard, and Joan Massagué. “Transforming Growth Factor-β Signaling in Immunity and Cancer.”  Immunity vol. 50,4 (2019): 924-940. doi:10.1016/j.immuni.2019.03.0243. Kelly, Aoife et al. “Regulation of Innate and Adaptive Immunity by TGFβ.” Advances in immunology vol. 134 (2017): 137-233. doi:10.1016/bs.ai.2017.01.0014. Kim, Byung-Gyu et al. “Novel therapies emerging in oncology to target the TGF-β pathway.” Journal of hematology & oncology vol. 14,1 55. 6 Apr. 2021, doi:10.1186/s13045-021-01053-x5. Martin, Constance J et al. “Selective inhibition of TGFβ1 activation overcomes primary resistance to checkpoint blockade therapy by altering tumor immune landscape.” Science translational medicine vol. 12,536 (2020): eaay8456. doi:10.1126/scitranslmed.aay8456

导读趋化因子是一类分子量小的细胞因子,其主要作用是在稳态和病理条件下募集白细胞亚群,又被称为趋化性细胞因子。根据其主要蛋白质结构的前两个半胱氨酸(C)残基的位置,将趋化因子分为 C 、CC 、CXC 和 CX3C 趋化因子四大亚家族,其主要负责参与调控机体的器官发育、免疫监视、宿主防御和组织更新等生理过程。趋化因子也可以根据其表达和功能分为炎性趋化因子和稳态趋化因子。炎症性细胞因子在炎症部位迅速分泌,从而将效应细胞募集到发炎组织中;而稳态趋化因子在生理条件下组成性表达并在细胞迁移和归巢中发挥作用,因此趋化因子在协调炎症及正常状态下的体内细胞群定位中发挥核心作用。  图1.趋化因子配体与受体[1]趋化因子受体表达于细胞表面,是与G蛋白偶联的7次跨膜蛋白,趋化因子就是与受体结合后传递细胞信号的,故受体根据其结合的趋化因子亚家族来命名,如 XCR、CCR、CXCR、CX3CR 等。这些受体负责调控多条细胞信号通路,如调动肌动蛋白聚合、细胞骨架重排、粘着斑组装和解聚,此外也在细胞存活等生命活动中发挥着重要作用。图2.趋化因子信号通路图[2]此外,趋化因子还参与多种癌症发展过程,如血管生成、转移、癌细胞增殖、干性和侵袭性,是疾病进展的关键决定因素,对治疗反应和患者预后有很大影响。由于它们在癌细胞和免疫浸润细胞中重要的调节功能,使得趋化因子配体及其受体成为非常强大的治疗靶点。趋化因子的靶向治疗目前,国内外已有多家药企开启了针对趋化因子及其受体的药物开发,其中临床已批准的靶向趋化因子的药物包括:2012年上市的抗CCR4抗体(Mogamulizumab)和2007年上市的CXCR4拮抗剂(Maraviroc)等,用于治疗恶性血液瘤。此外,还有更多的针对不同趋化因子受体-配体轴作为癌症治疗策略的多种努力,这些治疗策略目前已表现出巨大的潜力,正处于临床开发中。数据来源于科睿唯安趋化因子及其受体对于维持机体稳态具有重要意义。然而一旦趋化因子活性失控,则会导致慢性炎症和自身免疫性疾病。针对一系列疾病靶点的研究机理,BioMice百奥动物自主开发了CCR家族靶点人源化小鼠,包括CCR1-CCR9,可以为该靶点药物的开发提供有效的临床前药效评价工具,助力靶向药物研究。B-hCCR1 mice基本信息 蛋白表达分析 通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCCR1小鼠中CCR1的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCCR1小鼠的腹腔巨噬细胞,并用种属特异性抗CCR1抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CCR1仅在野生小鼠中检测到,人CCR1仅在纯合B-hCCR1小鼠中检测到。 B-hCCR2 mice基本信息  蛋白表达分析  通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCCR2小鼠中CCR2的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCCR2小鼠的骨髓,并用种属特异性抗CCR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CCR2仅在野生小鼠中检测到,人CCR2仅在纯合B-hCCR2小鼠中检测到。 B-hCCR3 mice基本信息  蛋白表达分析  通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCCR3小鼠中CCR3的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCCR3小鼠的骨髓,并用种属特异性抗CCR3抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CCR3仅在野生小鼠中检测到,人CCR3仅在纯合B-hCCR3小鼠中检测到。 B-hCCR4 mice基本信息 蛋白表达分析   通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCCR4小鼠中CCR4的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCCR4小鼠的脾细胞,并用种属特异性抗CCR4抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CCR4仅在野生小鼠中检测到,人CCR4仅在纯合B-hCCR4小鼠中检测到。 B-hCCR4小鼠的T细胞能与抗人CCR4抗体结合通过流式细胞术(FACS)分析B-hCCR4小鼠的T细胞结合抗人CCR4抗体的能力。收集B-hCCR4 小鼠的脾细胞(雌性,6周龄),使用FACS检测T细胞与抗人CCR4抗体(内部合成)的结合。结果显示:与同型对照相比,B-hCCR4小鼠的T细胞可以很好地结合抗人CCR4抗体。 B-hCCR5 mice基本信息  蛋白表达分析   通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCCR5小鼠中CCR5的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCCR5小鼠的腹腔冲洗液,并用种属特异性抗CCR5抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CCR5仅在野生小鼠中检测到,人CCR5仅在纯合B-hCCR5小鼠中检测到。 B-hCCR6 mice基本信息  蛋白表达分析  通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCCR6小鼠中CCR6的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCCR6小鼠的脾细胞,并用种属特异性抗CCR6抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CCR6仅在野生小鼠中检测到,人CCR6仅在纯合B-hCCR6小鼠中检测到。B-hCCR7 mice基本信息蛋白表达分析   通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCCR7小鼠中CCR7的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCCR7小鼠的脾细胞,并用种属特异性抗CCR7抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CCR7仅在野生小鼠中检测到,人CCR7仅在纯合B-hCCR7小鼠中检测到。 B-hCCR8 mice基本信息  蛋白表达分析 人CCR8在纯合B-hCCR8小鼠肿瘤中CD4+ T细胞和Treg细胞均可检测到,但在脾细胞和血细胞中不能检测到。鼠CCR8在野生型小鼠的肿瘤中可检测到,脾细胞中弱表达,而在血细胞中不表达。血常规检测 收集野生型C57BL/6和B-hCCR8小鼠的外周血进行血常规检测(n=8,雌性,9周龄),结果显示:B-hCCR8小鼠的各指标与野生C57BL/6小鼠无明显差异,表明CCR8的人源化未改变血细胞的组成及形态。血生化检测收集野生型C57BL/6和B-hCCR8小鼠的血清进行血生化检测(n=8,雌性,9周龄),结果显示:B-hCCR8小鼠的各指标与野生C57BL/6小鼠无明显差异,表明CCR8的人源化未影响小鼠的肝、肾功能及脂肪代谢能力。 抗人CCR8抗体药效验证 抗人CCR8抗体在B-hCCR8小鼠接种MC38模型和B-Tg(hCCL1) MC38模型中均有较好的抑瘤效果。TILs分析显示:抗人CCR8抗体给药组(G2、G4)与未给药组(G1、G3)相比,总的Tregs和hCCR8+ Tregs的比例显著性降低。 B-hCCR9 mice基本信息 蛋白表达分析 通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCCR9小鼠中CCR9的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCCR9小鼠的胸腺细胞,并用种属特异性抗CCR9抗体进行流式细胞术分析。结果显示:鼠CCR9仅在野生小鼠中检测到,人CCR9仅在纯合B-hCCR9小鼠中检测到。趋化因子受体及其配体的相互作用非常复杂,尽管面临挑战,但目前还是有大量针对不同趋化因子受体的抑制剂正在临床前研究或临床试验阶段,可以相信未来趋化因子受体抑制剂将在调节TME的组成并优化患者的免疫反应方面发挥重大作用,为肿瘤患者带来更多希望。参考文献[1] Märkl, F., Huynh, D., Endres, S. & Kobold, S. Utilizing chemokines in cancer immunotherapy. Trends in Cancer 8, 670–682 (2022)[2] R&D Systems.lnc.The Chemokine Superfamily: Critical Regulators of Homeostasis & Inflammation,2019

肿瘤动物模型的建立为研究肿瘤发生与转移的机制、筛选和评价抗肿瘤药物的药效提供了有力的工具。啮齿类动物小鼠,因为其具有繁育速度快,成本低,可进行基因修饰等诸多优点,基于其构建的各类肿瘤模型构成了临床前治疗性药物筛选的主要工具。小鼠肿瘤模型大致可分为自发性肿瘤小鼠模型、诱发性肿瘤小鼠模型、基因工程小鼠肿瘤模型、异种移植瘤模型(PDX或CDX)等。重建了人免疫系统的异种移植小鼠肿瘤模型(CDX或PDX)可同时具备人免疫系统和人肿瘤组织,更接近人体真实情况,实现了在动物体内模拟人类免疫系统和肿瘤之间的相互作用。细胞系异种移植模型(Cell line-derived xenograft, CDX)是将体外培养的人源的肿瘤细胞系通过皮下、静脉或者原位的方式接种至重度免疫缺陷小鼠(如B-NDG小鼠)或者是人源化免疫系统小鼠体内而构建的肿瘤模型。基于细胞系的肿瘤模型作为经典的体内实验方法,在肿瘤学研究和抗肿瘤药物研发过程中有着极大的需求。CDX模型具有实验周期短、建模成功率高、重复性高、动物个体成瘤差异较小、实验费用相对低等优点,可以用于开展药物靶点验证、药效学评价、PK/PD研究和多药协同药效评价等,是评估抗肿瘤药物免疫治疗效果的重要临床前动物模型。‍ 图1. 异种移植小鼠肿瘤模型小鼠的CDX成瘤模型CDX皮下模型以重度免疫缺陷小鼠为例,我们已经完成了25种肿瘤细胞系的CDX模型构建,包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等。以下是百奥动物基于B-NDG小鼠建立的部分CDX成瘤模型展示。图2.  B-NDG小鼠CDX模型成瘤数据CDX原位模型关于原位移植肿瘤模型,想要了解更多,请点击上图。CDX淋巴癌转移模型图3. Raji淋巴肿瘤细胞在B-NDG小鼠上能更有效地建立系统和转移肿瘤模型对B-NDG、NOD-scid BALB/C Nude小鼠通过尾静脉注射相同数量 (5× 105)的Raji细胞,在不同的时间点记录并分析小鼠的如下各种指标:(A) 细胞接种后记录小鼠生存情况,绘制Kaplan-Merier生存曲线。(B)细胞接种后每周小鼠体重变化(g),并计算出相对于接种当天的相对体重(C)小鼠外周血中人源细胞百分率变化。接种Raji細胞后,每周通过眼眶静脉丛采取100 以μl全血,提取DNA,通过q-PCR技术检测小鼠外周血中人源细胞比率。(D)接种Raji细胞后小鼠肝脏对比。接种后待小鼠体重下降超过30%后执行安乐死并解剖脏器,进行拍照。(E)接种Raji细胞后小鼠脏器免疫组化染色。一抗为鼠抗人线粒体膜蛋白抗体。结果表明,相对于NOD-scid小鼠B-NDG小鼠更适合建立人源肿瘤模型。利用CDX肿瘤模型进行药物体内药效‍评价B-NDG小鼠CDX淋巴瘤体内药效实验‍图4. 基于B-NDG小鼠的Raji淋巴癌转移模型及药效评价对B-NDG小鼠通过尾静脉注射相同数量(5x105)的Raji-Fluc细胞,并在第3天以及第10天尾静脉注射相同剂量的抗体X,之后在不同的时间点成像观察肿瘤生长状况。(A)不同时间点对小鼠成像观察肿瘤生长情况;(B)不同分组小鼠成像下肿瘤细胞荧光强度曲线。结果表明,早起抗体治疗(Raji细胞移植3天,10天给药)的治疗效果显著,晚期抗体治疗(Raji细胞移植10天给药)的治疗效果明显变差,基本无效。 B-NDG小鼠CDX模型抗人CD47抗体药效验证实验‍图5. B-NDG小鼠抗人CD47抗体的抗肿瘤活性将人淋巴B-lciferase-GFP Raji细胞(B ymphocytes)细胞通过尾静脉注射到B-NDG小鼠体内,利用小动物成像仪进行观察,待肿瘤荧光强度达到1E+06左右时将动物入组至对照组和治疗组(n=6)。(A)荧光成像仪监测小鼠肿瘤荧光,(B)治疗期间的体重变化。结果表明,3种抗体对B-NDG小鼠的肿瘤生长抑制均有效果。B-NDG小鼠是人CD47抗体有效性研究的有力模型。数值表示为平均值±SEM。B-NDG小鼠CDX模型CAR-T药效验证实验‍图6. CAR-T疗法在B-NDG小鼠中的抗肿瘤活性将B-luciferase-GFP Raji细胞(B lymphocytes)通过尾静脉植入B-NDG小鼠。当荧光强度达到约1E+06(n=6)时,将小鼠分组,用CAR-T细胞(1E+07)处理。(A)Raji-Luciferase细胞系经不同CAR-T细胞处理后的信号强度,(B)处理期间的体重变化。结果显示,4种CAR-T细胞在B-NDG小鼠中表现出不同地抑制肿瘤生长活性。结果表明,B-NDG小鼠可以作为CAR-T细胞治疗研究的有力模型。数值表示为平均值±SEM。  B-NDG小鼠CDX模型ADC药效验证实验‍ 图7. ADC药物在几种CDX模型中的体内抗肿瘤疗效研究采用不同抗原表达水平的细胞系验证ADC药物的体内药效水平。如图7所示,在皮下接种了BT474和NCI-H1975的B-NDG小鼠肿瘤模型中,所有受试品ADC对肿瘤生长均表现出明显的抑制作用。在A431肿瘤模型中的抑制作用相对较弱,这与A431细胞上HER2的低表达水平相一致。CDX模型列表BioMice百奥动物一直在追求创新、不断的探索,以期为广大科研工作者提供优质的小鼠模型,助力科学研究以及药物开发!如您有关注的肿瘤相关动物模型,欢迎联系我们,获取更多百奥动物产品信息。‍

近年来,免疫治疗在抗肿瘤治疗中的作用备受关注,基于免疫治疗的新药开发和标志物探索,成为了当前肿瘤研究的热点,这也对临床前研究动物模型的建立提出了更高的要求。即可以模拟人肿瘤特征又同时存在“人源化”免疫系统的免疫重建小鼠模型,成为了免疫肿瘤研发中的优质模型。百奥动物B-NDG小鼠缺乏成熟的T、B、NK细胞,是目前国际公认的免疫缺陷程度高、适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。将人的免疫细胞、造血干细胞移植到B-NDG及B-NDG衍生小鼠中构建的免疫系统重建小鼠,能够更好的模拟人的免疫系统,进行免疫学研究和免疫药物评价。但在使用重度免疫缺陷小鼠进行PBMC和CD34+ HSC免疫重建时会面临一些常见问题,如PBMC重建后的T细胞会对小鼠自身细胞进行攻击导致严重的xeno-GvHD反应;CD34+ HSC重建后的NK细胞和髓系细胞重建比例不足。我们以B-NDG小鼠为基础分别开发了可延缓xeno-GvHD反应和可促进髓系细胞发育的二代系列小鼠,以满足特定细胞功能研究和相应靶点药物评价的需求。减轻GvHD反应,延长实验窗口期B-NDG MHC I/II DKO mice plus 不表达MHC I/II 类分子B-NDG小鼠、B-NDG B2m KO plus小鼠和B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠进行人PBMC重建后GvHD严重程度的比较 第0天将3个健康供体的人PBMCs (5E6)静脉注射B-NDG小鼠、B-NDG B2m KO plus小鼠和B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠(雌性,5周龄,n=5)中。A.用Kaplan Meier生存曲线分析小鼠存活率。B.体重变化。GvHD临床体征每周评分两次。结果表明:B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠可显著延缓GvHD发生,并降低GvHD严重程度。因此B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠更适合将人PBMC移植到免疫缺陷小鼠模型。B-NDG B2m KO mice plus B-NDG小鼠、B-NDG B2m KO plus进行人PBMC重建后GvHD严重程度的比较将3个健康供体的2E6人PBMC静脉注射B-NDG B2m KO plus小鼠(雌性,11周龄,n=5)和B-NDG小鼠(雌性,10周龄,n=6)中。GvHD临床体征每周评分两次。结果表明:在人PBMC诱导的GvHD模型中,B-NDG B2m KO plus小鼠比B-NDG小鼠生存期明显延长,B-NDG B2m KO plus小鼠可延缓GvHD的发病并减轻其严重程度。促进髓系细胞重建B-NDG MGMT3 mice 人源化IL3, CSF2, CSF1, THPO 基因未经辐照的B-NDG MGMT3小鼠进行人CD34+HSC重建将人CD34+HSC造血干细胞(3E4)静脉注射B-NDG小鼠和B-NDG MGMT3小鼠(出生后24-72h,n=15)。B-NDG小鼠给予1.0 gy辐照,B-NDG MGMT3小鼠不辐照。流式细胞分析两种小鼠进行人CD34+HSC免疫重建后的外周血淋巴细胞。结果表明:未经辐照的B-NDG MGMT3小鼠的CD45+细胞比例从移植后12周开始达到25%,并持续上升,明显高于B-NDG小鼠。B-NDG MGMT3小鼠单核细胞、MDSCs、DCs和Treg的比例高于B-NDG小鼠。(注:A面板第18周数据因流式细胞检测问题无意义。)B-NDG hCSF1/hTHPO mice 未经辐照的B-NDG hCSF1/hTHPO小鼠进行人CD34+HSC重建将人CD34+HSC细胞(0.15 M)静脉注射到纯合B-NDG hCSF1/hTHPO小鼠(雌性,6周龄,n=15)。流式细胞术分析人CD34+HSC免疫重建后小鼠外周血淋巴细胞。结果显示:未经辐照的B-NDG hCSF1/hTHPO小鼠成功重建了T、包括B、NK、髓系细胞、单核细胞和中性粒细胞在内的人多系细胞。免疫缺陷动物产品列表

1978年,科学家首次发现CD24,即分化簇24(Cluster of differentiation 24),也称为热稳定抗原(heat-stable antigen,HSA),一种高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白。CD24没有胞内信号结构域,然而,几种信号转导蛋白与CD24活性相关,其中研究最充分的是Src家族激酶。CD24信号可影响细胞的增殖和生长,也可通过影响细胞间黏附作用进而促进肿瘤的侵袭和转移。纵观吞噬相关检查点抑制剂的发现历史:在过去的20年里,自第一个肿瘤吞噬相关检查点CD47-SIRPα通路被发现以来,其他肿瘤吞噬相关检查点PD1-PD-L1通路、MHC-I-LILRB1通路以及CD24-Siglec-10通路等被逐步发现,在识别吞噬相关检查点方面取得了很大的进展[1]。CD47作为第一个被发现的肿瘤吞噬相关检查点,在多种人类血液肿瘤中存在高表达。目前,CD47的一个主要难点是其在红细胞和血小板有表达,导致血液毒性。然而,研究表明,CD24不在人红细胞表达,不会产生贫血的副作用[2]。作用机制CD24可作为“别吃我”信号分子,与巨噬细胞上的分子Siglec-10相互作用,传递抑制性信号,抑制破坏性炎症反应,减少巨噬细胞吞噬作用,传递“别吃我”信号。CD24可以与现有疗法互补,是未来免疫治疗的潜在靶点。CD24-Siglec-10抑制吞噬作用的示意图[3]研究进展通过查询统计,目前针对CD24靶点进行开发的在研公司或机构有很多,适应症涉及自身免疫疾病、炎症、病毒感染和肿瘤等多个领域。随着针对CD24靶点作用机制的发现,需要更多的临床研究来检验靶点对不同类型的肿瘤的影响。百奥动物自研产品B-hCD24 mice plus,是靶向CD24抗体开发相关药物进行药效评价的优质模型。相信随着对CD24的开发,多个领域的药物研发势必会进入一个加速的时代。数据展示01基本信息02血红细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的红细胞,结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠中可检测到小鼠CD24,但在B-hCD24小鼠中未检测到。在纯合B-hCD24小鼠中未检测到人CD24。03B细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞,结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中均可检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到人CD24。04T细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞,结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液中仅可检测到少量小鼠CD24(A),而在野生型小鼠脾脏中无法检测到小鼠CD24(B)。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B)中均未检测到人CD24。05NK细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞,结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中未检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B) 中未检测到人CD24。06粒细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合子B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞,结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏 (B)中可检测到人CD24。07巨噬细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞,结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到人CD24。08树突状细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞,结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到人CD24。09CD24表达总结野生型小鼠与人的CD24表达谱不同,主要差别在于人红细胞不表达CD24但小鼠的红细胞表达。或可导致药物在野生型小鼠体内筛选时,可能会遇到在人中不会出现的血液毒性,干扰药物安全性、有效性的临床前评估。B-hCD24 mice plus人源化小鼠CD24表达谱与人一致,可有效避免相应风险。髓系细胞检查点相关产品列表参考资料1.Song Y, et al. Targeting macrophages in hematological malignancies: recent advances and future directions. J Hematol Oncol. 2022 Aug 17;15(1):110. doi: 10.1186/s13045-022-01328-x. 2.British Journal of Cancer (2013) 108, 1449–1459 | doi: 10.1038/bjc.2013.1023.Amira A Barkal, Irving L Weissman. CD24 signalling through macrophage Siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 2019 Aug;572(7769):392-396.