皮肤组织中由于存在胶原蛋白、弹性蛋白等多种蛋白成分而具有一定的弹性，皮肤弹性是衡量皮肤健康与否的重要标志，很多针对熟龄肌的化妆品是由于提高了皮肤弹性而具有抗衰老功效。通过斑马鱼技术能有效评价化妆品增加皮肤弹性的功效。

【评价原理】

通过检测皮肤弹性相关基因的相对表达量（皮肤胶原蛋白col1a1a、col1a1b、col1a2基因）来表明样品是否具有增加皮肤弹性作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成若干组，含正常对照组和化妆品组。其中正常对照组未经任何处理，化妆品组添加受试化妆品。

使用化妆品24 hpf后，我们对每组斑马鱼进行收样，使用试剂盒提取RNA后，使用q-PCR检测目的基因的转录水平，通过斑马鱼皮肤胶原蛋白基因相对表达量评价化妆品增加皮肤弹性作用。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 斑马鱼体内col1a1b基因相对表达量

可以看到，化妆品高浓度组的col1a1b相对表达量较正常对照组显著增加。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼和两组平行对照的对比实验，化妆品高浓度组的col1a1b相对表达量较正常对照组显著增加。

2.本实验证实了该化妆品具有增加皮肤弹性的作用。

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【评价原理】

斑马鱼成鱼体长5 cm左右，其胚胎透明，在受精72 h后完成孵化，并在孵出后3个月内性成熟。成年斑马鱼的繁殖周期短(一般7 d左右)，若条件适宜，成年雌性斑马鱼可定期产卵(每次200～300个)。斑马鱼与人类的基因相似率高达87%, 与哺乳类动物相比, 斑马鱼的信号传导以及生理结构和功能方面都非常相似。斑马鱼能够对药物在体内的分布情况、吸收情况、代谢以及排泄等生理动态方面提供准确的信息, 尤其对小分子所引起的内分泌紊乱、再生毒性、行为缺陷、致畸、心血管毒性、肝毒性等毒性反应与人具有高度相似性。因此，使用斑马鱼作为药物早期的安全性评价是非常可靠的。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。供试品通过水溶暴露给药或灌胃等方式处理斑马鱼3个月。

服用一段时间供试品后，将斑马鱼固定、脱水、包埋、切片，进行H&E染色，我们观察斑马鱼各组织脏器结构病理变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼致癌性表型图

可以看到，服用供试品组11.1 µg/mL浓度组组织结构异常，产生癌变。异位的精原细胞簇可见于中央小叶，远离基膜。精子生成明显减少。

【评价结论】

1.经过每组10尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼精巢结构明显异常，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有致癌性。

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【评价原理】

斑马鱼的胃肠道在细胞功能和解剖学方面均与人类相似，由内皮细胞、结缔组织、外纵肌和环状肌组成。胚胎发育至26～126 hpf( hours post fertilization，受精后小时)，斑马鱼胃肠道的管腔形成并不断生长，形成有功能的肠道上皮。在未喂食情况下，斑马鱼胚胎受精约72 hpf，肠道首次出现不稳定的自发收缩。伴随着发育的进行，第120～144 hpf，斑马鱼大部分的卵黄囊被吸收，肠道自发的蠕动及摄食能力增强。

我们评价斑马鱼胃肠道毒性有2个指标：1.胃肠道形态的变化；2.肠蠕动功能抑制。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。摄入供试品之前提前给予食物，摄入供试品一段时间后，我们观察斑马鱼肠道表型。

服用一段时间供试品后，我们观察胃肠道形态及内容物的情况。

【结果展示】

可以看到，斑马鱼给予食物后，食物充盈肠道。服用/注射供试品组食物明显多于正常对照组，表明肠蠕动功能被抑制。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼胃肠道形态与正常对照组比较，发生了明显的变化，且肠道蠕动功能被抑制。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有胃肠道毒性。

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【评价原理】

利用物理/化学方法损伤斑马鱼肌肉、皮肤，伤口愈合过程中黑色素细胞会募集到伤口部位，伤口愈合相关基因表达量（如皮肤胶原蛋白colla1b基因）会显著增加以促进伤口愈合。由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和伤口愈合促进剂组。其中正常对照组未经过物理/化学损伤，模型对照组与伤口愈合促进组都经过了同程度的损伤。服用伤口愈合促进组在损伤后摄入胶原蛋白等伤口愈合促进剂。

服用一段时间伤口愈合促进剂后，观察伤口色素变化，并用实时荧光定量PCR仪检测伤口愈合相关基因的表达量。

【结果展示】

图1.伤口部位色素募集表型图

黄色虚线内为损伤部位

可以看出，伤口愈合促进剂组的伤口黑色素募集程度与同等程度损伤的模型对照组比较明显减轻。

图2. 斑马鱼体内cola1b基因相对表达量

与模型对照组比较，***p < 0.001 

可以看出，服用伤口愈合促进剂组cola1b相对表达量明显高于模型对照组。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用伤口愈合促进剂组的黑色素募集情况较模型对照组明显减轻，cola1b相对表达量也明显高于模型对照组。

2.本实验证实了胶原蛋白具有促进伤口愈合功效。

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【评价原理】

当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越小，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。彗星实验检测低浓度基因毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，检测尾长、彗星长、尾矩和Olive尾矩。

【结果展示】

图1. 彗星电泳图片

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼细胞核出现拖尾。该供试品改变DNA链的负超螺旋结构、空间构象，使DNA链断裂、形成类核，最终导致细胞死亡（坏死、凋亡或自体吞噬）。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼细胞核出现明显拖尾，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有基因毒性。

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一、促进组织再生功效评价

【评价原理】

机械损伤将产生皮肤组织的结构性破坏，斑马鱼尾鳍具有自我再生功能，通过对尾鳍再生速度的观察可以评价受试物促进组织再生功效。

【实验方案】

将斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组。正常对照组不做处理，模型对照组和供试品组均采用手术方法定量切断尾鳍，从而完成造模处理，供试品组中添加一定浓度的受试化妆品。避光孵育一段时间后，将各组斑马鱼在体视显微镜下拍照并保存图片，用高级图像分析软件对斑马鱼尾鳍面积进行定量分析，以尾鳍面积的增量评价受试化妆品促进组织再生功效。

【结果展示】

斑马鱼尾鳍面积

图1. 斑马鱼尾鳍面积表型图

红色区域为分析区域

可以看到，孵育相同时间后，供试品组斑马鱼尾鳍面积明显大于模型对照组，说明该化妆品具有促进组织再生功效。

【评价结论】

1.经过斑马鱼对比实验，供试品组与模型对照组相比，斑马鱼尾鳍面积明显增加。

2.本实验证实了该化妆品具有促进组织再生功效。

二、促进伤口愈合（抗炎）功效评价

【评价原理】

斑马鱼幼鱼的再生能力非常强大：切断尾鳍后，伤口立即紧缩、上皮细胞覆盖，数小时内便出现炎症反应，伤口处中性粒细胞的数量可以反映炎症反应的程度。转基因中性粒细胞荧光斑马鱼的中性粒细胞可在荧光显微镜下被明显观察，因此可以通过实时观察斑马鱼伤口附近的中性粒细胞数量评价受试物的抗炎功效。

【实验方案】

将斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组。正常对照组不做处理，模型对照组和供试品组均采用手术方法定量切断尾鳍，从而完成造模处理，供试品组中添加一定浓度的受试化妆品。避光孵育一段时间后，将各组斑马鱼在荧光显微镜下拍照并保存图片，用高级图像分析软件对斑马鱼尾鳍损伤部位的中性粒细胞进行计数，以中性粒细胞相比于模型对照组的减少量评价受试化妆品促进组织再生功效。

此外，可通过Q-PCR检测IL-1β、IL-6和IL-10等炎症因子的表达，通过相关炎症因子表达量的降低评价受试化妆品的抗炎功效。

【结果展示】

1、尾鳍损伤部位中性粒细胞（推荐）

图2 斑马鱼尾鳍中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为计算区域，绿色荧光点为中性粒细胞

可以看到，供试品组斑马鱼的中性粒细胞数目比模型对照组明显减少。

2、炎症因子的表达量（提供柱状图）

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，水溶给予供试品组的斑马鱼中性粒细胞数目及炎症因子的相对表达量与模型对照组相比明显减少。

2.本实验证实了该供试品具有促进伤口愈合（抗炎）功效。

三、促进疤痕淡化

【评价原理】

    冰乙酸对皮肤伤口具有一定的损伤作用，斑马鱼皮肤表面被注射冰乙酸后，伤口部位将出现色素的聚集，口修复过程中色素含量逐渐减少。通过观察对伤口部位的色素含量的减少量可以评价受试物对伤口的愈合作用。

【实验方案】

将斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组。正常对照组不做处理，模型对照组和供试品组均采用注射方式在斑马鱼躯干部位定量注射冰乙酸，受试化妆品以一定浓度水溶添加到供试品组中。各实验组在避光条件下孵育一段时间后，在显微镜下拍照保存图片，用高级图像处理软件分析斑马鱼伤口部位色素的不透光总和，计算供试品组相对于模型对照组的色素减少量，从而评价受试化妆品的促进伤口愈合功效。

【结果展示】

图3 斑马鱼躯干色素表型图

可以看到，供试品组斑马鱼躯干部位的色素含量比模型对照组明显减少。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，水溶给予供试品组的斑马鱼躯干部位色素含量与模型对照组相比明显减少。

2.本实验证实了该供试品具有促进疤痕淡化功效。

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【评价原理】

脑缺血脑血管疾病占70%左右，主要是由于脑动脉管腔出现狭窄或闭塞，导致脑部血流供应障碍，引起部分脑部组织缺血缺氧而出现坏死，最终造成神经功能缺损的疾病。普纳替尼进入人体后导致血栓形成与抑制血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成，影响一氧化氮合成，导致血管内皮损伤诱发脑血栓。斑马鱼大脑具有典型脊椎动物脑部形态学特征，而且拥有凝血因子、血小板受体，在摄入大量普纳替尼后也会诱发脑血栓。

经过红细胞特异性染色（呈红色），患有脑缺血的斑马鱼的头部血栓会明显比正常斑马鱼增多，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗血栓药物组。其中正常对照组未加入普纳替尼，模型对照组与服用抗血栓药物组都摄入了等量的普纳替尼（普纳替尼通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用抗血栓药物组在摄入普纳替尼的同时摄入阿司匹林、安宫牛黄丸之类的抗血栓药物。

服用抗血栓药物一段时间后，我们对斑马鱼整体做红细胞特异性染色，观察头部的血栓情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脑血栓表型图

蓝色虚线区域为脑血栓区域

可以看到，服用抗血栓药物组的脑血栓情况与未摄入普纳替尼的正常对照组比较相似，没有明显的脑血栓情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗血栓药物组的脑血栓情况与未摄入普纳替尼的正常对照组相似，并未出现模型对照组明显的脑血栓的情况。

2.本实验证实了阿司匹林、安宫牛黄丸具有脑血栓防治作用。

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【评价原理】

斑马鱼皮肤结构与功能与人类高度相似，斑马鱼皮肤含有基底层、棘层、颗粒层、透明层和表皮角质细胞层；另外尚有与人皮肤结构相同的固有层、半桥粒、黑色素细胞、血管和皮下脂肪细胞等。斑马鱼皮肤间质结缔组织、胶原及其临近的纤维母细胞及皮肤基因表达亦与人类皮肤相似。

我们评价斑马鱼皮肤肌肉毒性有4个指标：1.皮肤刺激；2.肌肉纹理；3.皮肤凋亡细胞定量；4.皮肤色素变化。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。

皮肤吸收供试品一段时间后，我们通过中性粒转基因荧光斑马鱼，观察皮肤/肌肉刺激性；通过表型拍照，观察肌肉纹理及皮肤色素变化；通过AO染色凋亡细胞，观察皮肤细胞凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼皮肤刺激性典型图片

可以看到，供试品组皮肤/肌肉可见明显中性粒细胞聚集。

图2. 斑马鱼皮肤损伤典型图片

可以看到，供试品组可见明显肌肉纹理不清晰。

图3. 斑马鱼凋亡细胞表型图

可以看到，供试品组尾部可见明显凋亡（绿色荧光亮点）。

图4. 斑马鱼皮肤色素异常表型图

可以看到，供试品组躯干可见明显色素异常（黄色虚线区域）。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，供试品组的斑马鱼皮肤肌肉产生明显的毒性表型（包括肌肉纹理异常和色素异常），在斑马鱼尾部可见明显的凋亡细胞，在躯干部可见明显的中性粒细胞聚集。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有皮肤肌肉毒性。

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【评价原理】

心肌损伤多数是由于炎症、缺血、冠状动脉狭窄等因素引发的心肌损伤，常表现为胸闷、胸痛、气短、四肢乏力、心慌、恶心呕吐等症状。斑马鱼心脏包含心房、心室和静脉窦，心电图谱也与哺乳动物类似。而且斑马鱼生长发育周期短，胚胎透明易观察，心脏在受精后48小时就发育完全，有利于开展心肌损伤保护剂的研究。盐酸异丙肾上腺素可以诱导斑马鱼心率加快，心肌持续收缩，心肌耗氧量持续增加，心脏由代偿性收缩转化为失代偿，最终导致心肌损伤，使心肌细胞凋亡。

经过特异性荧光染色（凋亡细胞呈绿色），心肌损伤的斑马鱼在心脏部位会布满凋亡细胞，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用心肌保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用心肌保护剂组都摄入了等量的盐酸异丙肾上腺素（盐酸异丙肾上腺素通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用心肌损伤保护剂组在摄入盐酸异丙肾上腺素的同时摄入N-乙酰半胱氨酸之类的心肌保护剂。

服用一段时间心肌保护剂后，我们对斑马鱼整体进行特异性荧光染色，观察心肌细胞的凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼心肌保护表型图

黄色虚线区域为心脏，绿色光点为凋亡细胞

可以看到，服用心肌保护剂组的心脏情况与正常对照组比较相似，细胞凋亡明显比模型对照组减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用心肌保护剂组的心脏情况与正常对照组相似，并未出现模型对照组大量凋亡细胞的情况。

2.本实验证实了N-乙酰半胱氨酸具有明显保护心肌作用。

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【评价原理】

缺氧可能导致心血管系统、呼吸系统、神经系统、消化系统等等一系列危害身体的疾病。斑马鱼心血管系统在分子信号通路上与人和哺乳动物的同源性达到85%以上,近年来斑马鱼广泛地被用于心血管疾病研究领域。因此，斑马鱼适用于评价耐缺氧功效。钴离子作用细胞后，可直接取代类血红素中的铁离子，使类血红素不能和氧结合而保持脱氧状态，从而模拟缺氧。

经过行为分析仪检测，缺氧的斑马鱼的总运动距离会明显比正常斑马鱼明显减少；经过凋亡细胞特异性荧光染色（呈绿色），斑马鱼脑部细胞凋亡可以被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用耐缺氧剂组。其中正常对照组未服用氯化钴，模型对照组与服用耐缺氧剂组都摄入了等量的氯化钴（氯化钴通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用耐缺氧剂组在摄入氯化钴之前摄入红景天苷之类的耐缺氧剂。

服用耐缺氧剂一段时间后，我们对斑马鱼进行行为分析，分析其总运动距离；同时对斑马鱼进行凋亡细胞染色，观察脑细胞凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼运动轨迹图

黑线：斑马鱼静止运动轨迹；绿线：中速运动；红线：快速运动

可以看到，服用耐缺氧剂组的总运动距离与未服用氯化钴的正常对照组比较相似，没有明显的运动减少。

图2. 缺氧导致的脑细胞凋亡表型图

计算黄色区域内的凋亡细胞

可以看到，服用耐缺氧剂组的脑部细胞与未服用氯化钴的正常对照组比较相似，没有明显的凋亡细胞。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用耐缺氧剂组的总运动距离和脑部凋亡细胞与正常对照组相似，并未出现模型对照组总运动距离减少和脑部凋亡细胞增多的情况。

2.本实验证实了红景天苷具有明显的耐缺氧功效。

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