【评价原理】

斑马鱼皮肤结构与功能与人类高度相似，斑马鱼皮肤含有基底层、棘层、颗粒层、透明层和表皮角质细胞层；另外尚有与人皮肤结构相同的固有层、半桥粒、黑色素细胞、血管和皮下脂肪细胞等。斑马鱼皮肤间质结缔组织、胶原及其临近的纤维母细胞及皮肤基因表达亦与人类皮肤相似。

我们评价斑马鱼皮肤肌肉毒性有4个指标：1.皮肤刺激；2.肌肉纹理；3.皮肤凋亡细胞定量；4.皮肤色素变化。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。

皮肤吸收供试品一段时间后，我们通过中性粒转基因荧光斑马鱼，观察皮肤/肌肉刺激性；通过表型拍照，观察肌肉纹理及皮肤色素变化；通过AO染色凋亡细胞，观察皮肤细胞凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼皮肤刺激性典型图片

可以看到，供试品组皮肤/肌肉可见明显中性粒细胞聚集。

图2. 斑马鱼皮肤损伤典型图片

可以看到，供试品组可见明显肌肉纹理不清晰。

图3. 斑马鱼凋亡细胞表型图

可以看到，供试品组尾部可见明显凋亡（绿色荧光亮点）。

图4. 斑马鱼皮肤色素异常表型图

可以看到，供试品组躯干可见明显色素异常（黄色虚线区域）。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，供试品组的斑马鱼皮肤肌肉产生明显的毒性表型（包括肌肉纹理异常和色素异常），在斑马鱼尾部可见明显的凋亡细胞，在躯干部可见明显的中性粒细胞聚集。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有皮肤肌肉毒性。

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▼ 斑马鱼养殖系统设备 / 定制多层独立养殖鱼架

斑马鱼养殖系统，应用于斑马鱼饲养，是一种可自动化监测与控制斑马鱼养殖过程的系统，含有光照调节、水质监测、水质调节、斑马鱼饲养、水体消毒、预防气泡病等功能，可以显示系统温度、pH、电导、溶解氧、氨氮监控，可远程控制系统运行并采集数据。

产品参数（示例）：

【评价原理】

静脉注射给予长春瑞滨造模斑马鱼免疫力低下模型。大剂量长春瑞滨骨髓抑制明显，导致血小板、红细胞及白细胞数目（中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等）减少和贫血，最终导致免疫力低下。人类与斑马鱼在免疫系统的细胞组成上极为相似，而且斑马鱼是目前所有同时具有特异性免疫和非特异性免疫动物个体中体积最小的，适合高通量评价调节免疫功效。斑马鱼静脉注射大剂量长春瑞滨后可造成免疫低下。

采用转基因T细胞红色荧光斑马鱼，可在荧光显微镜在观察到免疫力低下的斑马鱼体内的T细胞荧光强度明显减弱。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用免疫调节剂组。其中正常对照组未注射长春瑞滨，模型对照组与服用免疫调节剂组都注射了等量的长春瑞滨（长春瑞滨通过静脉注射的方式摄入到斑马鱼体内）。服用免疫调节剂组在注射长春瑞滨后摄入异丙肌苷等免疫调节剂。

服用一段时间免疫调节剂后，我们观察斑马鱼T细胞荧光强度变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼T细胞表型图

蓝色箭头所指红色荧光颗粒为T细胞

可以看到，免疫调节剂组T细胞荧光强度与未注射长春瑞滨的正常对照组比较相似，没有出现明显的T细胞减少情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，免疫调节剂组的T细胞荧光强度与正常对照组相似，并未出现模型对照组T细胞减少的情况。

2.本实验证实了异丙肌苷具有增强免疫力的功效。

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【评价原理】

斑马鱼胚胎视力发育迅速，受精后发育4天的幼鱼就已经依赖视觉线索进行捕食和躲避行为。斑马鱼不仅在角膜、晶状体、脉络膜、视网膜以及血管化和神经支配等结构上和人类的眼睛有明显的相似性，而且还有保守的基因表达、细胞构成和组织结构，因此为研究药物眼部毒性提供了一个极好的模型。

我们评价斑马鱼眼毒性有4个指标：1.眼睛大小；2.眼部细胞凋亡；3.眼部血管面积；4.眼部病理切片。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组，供试品组（药物通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间眼保护剂后，我们在解剖显微镜下观察眼睛大小；整体做凋亡细胞特异性染色，观察眼部细胞凋亡；通过荧光显微镜观察眼部血管面积，同时制作成病理切片观察眼部的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼眼睛表型图

箭头指示区域为眼

可以看到，药物组眼睛相较于正常对照组明显减小。

图2. 斑马鱼眼细胞凋亡表型图

黄色虚线区域为眼，绿色小点为凋亡细胞

可以看到，药物组的凋亡细胞较正常对照组明显增多。

图3. 斑马鱼眼部血管面积

黄色虚线标记血管面积

可以看到，药物组眼睛血管面积相较于正常对照组明显增加。

图4. 眼部凋亡细胞病理切片

可以看到，药物组出现较多的凋亡细胞，表现为细胞固缩、染色质边集，视网膜结构异于正常对照组。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，药物组斑马鱼眼睛明显变小，凋亡细胞明显增多，眼部血管面积明显增多，在病理切片中出现较多的凋亡细胞，表现为细胞固缩、染色质边集，视网膜结构异常。

2.本实验证实了药物的眼毒性。

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【评价原理】

斑马鱼与人类的基因相似率高达87%, 与哺乳类动物相比, 斑马鱼的信号传导以及生理结构和功能方面都非常相似。斑马鱼能够对保健品在体内的分布情况、吸收情况、代谢以及排泄等生理动态方面提供准确的信息, 尤其对小分子所引起的内分泌紊乱、再生毒性、行为缺陷、致畸、心血管毒性、肝毒性等毒性反应与人具有高度相似性。因此，使用斑马鱼作为保健品早期的安全性评价是非常可靠的。

用石蜡包埋法制作斑马鱼病理切片，在显微镜下可观察各靶器官毒性情况。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。通过环特生物剂量换算公式，将人每日推荐服用剂量换算为斑马鱼使用浓度进行安全性评价。

服用一段时间供试品后，将斑马鱼固定、脱水、包埋、切片，进行H&E染色，我们观察斑马鱼各组织脏器结构病理变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肝脏病理切片

可以看到，正常对照组肝组织结构规则，肝细胞形态完整，细胞质均匀，细胞核呈规则圆形，位于细胞中央；供试品组肝脏红细胞淤积严重，细胞肿胀现象严重，局部可见炎性浸润，坏死。

【评价结论】

1.经过每组10尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼诱发明显的肝脏毒性,。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有长期毒性风险。

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【评价原理】

缺氧可能导致心血管系统、呼吸系统、神经系统、消化系统等等一系列危害身体的疾病。斑马鱼心血管系统在分子信号通路上与人和哺乳动物的同源性达到85%以上,近年来斑马鱼广泛地被用于心血管疾病研究领域。因此，斑马鱼适用于评价耐缺氧功效。钴离子作用细胞后，可直接取代类血红素中的铁离子，使类血红素不能和氧结合而保持脱氧状态，从而模拟缺氧。

经过行为分析仪检测，缺氧的斑马鱼的总运动距离会明显比正常斑马鱼明显减少；经过凋亡细胞特异性荧光染色（呈绿色），斑马鱼脑部细胞凋亡可以被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用耐缺氧剂组。其中正常对照组未服用氯化钴，模型对照组与服用耐缺氧剂组都摄入了等量的氯化钴（氯化钴通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用耐缺氧剂组在摄入氯化钴之前摄入红景天苷之类的耐缺氧剂。

服用耐缺氧剂一段时间后，我们对斑马鱼进行行为分析，分析其总运动距离；同时对斑马鱼进行凋亡细胞染色，观察脑细胞凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼运动轨迹图

黑线：斑马鱼静止运动轨迹；绿线：中速运动；红线：快速运动

可以看到，服用耐缺氧剂组的总运动距离与未服用氯化钴的正常对照组比较相似，没有明显的运动减少。

图2. 缺氧导致的脑细胞凋亡表型图

计算黄色区域内的凋亡细胞

可以看到，服用耐缺氧剂组的脑部细胞与未服用氯化钴的正常对照组比较相似，没有明显的凋亡细胞。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用耐缺氧剂组的总运动距离和脑部凋亡细胞与正常对照组相似，并未出现模型对照组总运动距离减少和脑部凋亡细胞增多的情况。

2.本实验证实了红景天苷具有明显的耐缺氧功效。

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【评价原理】

近年来，各种各样的美食迫使人们越来越关注胃肠道健康问题。斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，并拥有与人类结构和功能相似的胃肠道组织。斑马鱼胃肠道粘膜屏障系统由较完整的机械屏障、化学屏障和免疫屏障构成，与哺乳动物高度相似，可作为胃肠道粘膜屏障研究的动物模型。三硝基苯磺酸（TNBS）可破坏胃肠粘膜屏障，与肠组织蛋白结合形成抗原，发生变态反应，诱发溃疡性胃肠道损伤。胃肠道病变累及肌层和神经，导致胃肠壁张力减退，胃肠腔扩大。胃肠道病变时出现炎症反应，中性粒细胞募集到损伤部位。杯状细胞主要分泌黏蛋白，形成黏膜屏障以保护上皮细胞，胃肠黏膜损伤时杯状细胞数量减少。通过病理切片可观察胃肠道组织学改变（如溃疡形成等）的情况。

我们评价斑马鱼胃肠道粘膜损伤辅助保护功效有4个指标：1. 观察胃肠腔面积；2. 应用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，观察胃肠道中性粒细胞数量；3. 应用特异性的染料（呈蓝色），观察肠道杯状细胞数目；4. 胃肠道病理切片。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用胃肠道粘膜辅助保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用胃肠道粘膜辅助保护剂组都摄入了等量的TNBS（TNBS通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用胃肠道粘膜辅助保护剂组在TNBS诱导胃肠道粘膜损伤之后摄入常欣卫口服液之类的胃肠道粘膜辅助保护剂。

服用一段时间胃肠道粘膜辅助保护剂后，我们观察斑马鱼胃肠道表型，分析胃肠腔面积，胃肠道中性粒细胞数目和杯状细胞数目，同时制作成病理切片观察胃肠道的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胃肠道表型图（蓝色虚线区域为胃肠腔）

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护组的胃肠腔面积与正常对照组比较相似，没有明显的胃肠腔扩张。

图2. 斑马鱼胃肠道中性粒细胞表型图（黄色虚线区域为肠腔）

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的肠道中性粒细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的增多。

图3. 斑马鱼胃肠道杯状细胞表型图

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

图4. 斑马鱼胃肠道病理切片

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的胃肠粘膜形态与正常对照组比较相似，没有明显的胃肠腔扩张、粘膜糜烂溃疡等症状。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的胃肠腔情况与正常对照组相似，并未出现模型对照组胃肠腔扩张、中性粒细胞数量增加、肠道杯状细胞数目减少、粘膜糜烂溃疡等情况。

2.本实验证实了常欣卫口服液具有明显胃肠道粘膜辅助保护功效。

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【评价原理】

中枢神经损伤常表现为偏瘫、失语、智力障碍或昏迷，甚至死亡。斑马鱼是一种与人类同源性较高的脊椎动物，大脑具有典型脊椎动物脑部形态学特征，髓鞘结构特征和少突胶质细胞分化过程与哺乳动物高度一致。而且斑马鱼生长发育周期短，神经系统简单，有利于开展中枢神经保护剂的研究。霉酚酸吗啉乙酯可以抑制斑马鱼神经元轴突的生长，干扰神经及细胞的迁移和导致发育畸形，使神经元细胞凋亡。

经过特异性荧光染色（凋亡细胞呈绿色），中枢神经损伤的斑马鱼在脑和脊髓部位会布满凋亡细胞，比正常斑马鱼多很多，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用中枢神经保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用中枢神经保护剂组都摄入了等量的霉酚酸吗啉乙酯（霉酚酸吗啉乙酯通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用中枢神经保护剂组在摄入霉酚酸吗啉乙酯的同时摄入还原型谷胱甘肽、养血清脑颗粒和安宫牛黄丸之类的中枢神经保护剂。

服用中枢神经保护剂一段时间后，我们对斑马鱼整体进行特异性荧光染色，观察中枢神经细胞的凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼中枢神经保护表型图

黄色虚线区域为中枢神经，绿色光点为凋亡细胞

可以看到，服用中枢神经保护剂组的中枢神经情况与正常对照组比较相似，没有明显的细胞凋亡。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用中枢神经保护剂组的中枢神经情况与正常对照组相似，并未出现模型对照组大量凋亡细胞的情况。

2.本实验证实了还原型谷胱甘肽、养血清脑颗粒和安宫牛黄丸具有明显保护中枢神经作用。

【评价原理】

近年来，随着工业化的发展，空气污染越来越严重，雾霾天也越来越多，对人的侵害也越来越严重。二氧化硫、氮氧化物、可吸入颗粒物（PM10）和细颗粒物（PM2.5）是雾霾的主要组成成分。研究表明，进入斑马鱼和大鼠体内的纳米活性炭颗粒能通过肠道的杯状细胞分泌而排泄，这一新颖的纳米排泄途径被命名为肠杯状细胞分泌通路（IGCSP)。用红色荧光微球模拟PM2.5微粒，激活斑马鱼炎症机制，引起其体内吞噬细胞的吞噬作用肠道分泌得以将异物排除。

根据体内荧光微球的数量（呈红色），抗雾霾剂组斑马鱼体内微球数量明显减少。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是模型对照组和抗雾霾剂组。其中模型对照组与服用抗雾霾剂组都给予了等量的荧光微球（荧光微球通过注射方式到斑马鱼体内）。抗雾霾剂组在注射荧光微球的同时摄入冬虫夏草之类的抗雾霾剂。

服用一段时间抗雾霾剂后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼体内荧光微球数量的变化来反映机体清除PM2.5的能力。

【结果展示】

图1. 斑马鱼抗雾霾表型图

红色点为荧光微球

可以看到，服用抗雾霾剂组的荧光微球数量与模型对照组比较明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗雾霾剂组的荧光微球数量与模型对照组比较明显减少。

2.本实验证实了冬虫夏草具有抗雾霾功效。

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【评价原理】

免疫毒性是指化合物对机体免疫系统的损伤作用，包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反应性过度增强，可能包括免疫性产生，过敏反应（超敏反应或变态反应）、自身免疫反应以及不良免疫刺激等。

斑马鱼具有先天免疫系统和获得性免疫系统，与果蝇和线虫模型相比，斑马鱼的免疫系统发育的更完整。研究证实斑马鱼与哺乳动物一样，具有T细胞、B细胞、自然杀伤细胞，其免疫系统对于环境中的免疫毒性物质（包括哺乳动物）非常的敏感。

免疫毒性指标有3个：（1）应用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，观察中性粒细胞数量；（2）应用转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，观察巨噬细胞数量（荧光强度）；（3）注射红色荧光微球，巨噬细胞吞噬微球排出体外，用体内微球的数量反映巨噬细胞吞噬功能。（4）检测T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成二组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，我们对斑马鱼检测中性粒细胞和巨噬细胞计数、巨噬细胞吞噬功能和T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【结果展示】

（1）中性粒细胞数量 

图1. 斑马鱼中性粒细胞表型图

绿色小点为中性粒细胞

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内中性粒细胞数量比正常对照组明显减少。

（2）巨噬细胞数量

图2. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内巨噬细胞数量比正常对照组明显减少。

（3）巨噬细胞吞噬功能

图3. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组的吞噬颗粒的巨噬细胞数量与正常对照组比较有明显减少，说明巨噬细胞吞噬功能下降。

（4）T/B相关基因表达（rag1和rag2）

图4. 斑马鱼rag1和rag2表达

左图为rag1基因相对表达量，右图为rag2基因相对表达量

可以看到，服用供试品组的rag1和rag2相对表达量与正常对照组比较均有减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的中性粒细胞和巨噬细胞数量与正常对照组比较均有减少，其巨噬细胞吞噬功能有所下降，且rag1和rag2相对表达量减少。

2.本实验证实了该供试品具有免疫毒性。

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