类器官简介

类器官是一种原代组织来源的成体干细胞体外自组装成的3D器官型结构，可分化为多个器官特异性的细胞类型，并能够表现出细胞与细胞之间、细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态，在体外重现人体真实器官的一些关键功能和结构，并具有稳定的表型和遗传学特征。

作为新兴的生物学模型，类器官具有细胞系和动物模型所不具有的独特优势，其细胞组成和结构更加类似人体组织，可提供一个高度生理相关的系统，是基础研究的模型。同时，类器官模型相对实验动物更加经济，且时效性更高，可以提高研究效率。

类器官模型的应用

类器官模型的优势

·速度快 ·通量高 ·临床相关性强

类器官的构建

建立PSC和AdSc类器官的过程

● 以 iPS/ES 或成体干细胞为起点, 在 3D 环境下, 利用细胞因子将干细胞定向分化后建立的, 具有各种器官主要组织细胞类型及组织特征的微型结构。

● 多能干细胞(PSC)来源的类器官是在PSCs定向分化后建立的, 首先是胚层的形成, 随后是诱导和成熟, 通过加入特定的生长和信号因子来获得所需的器官特定细胞类型。

● 成体干细胞(AdSC)衍生的类器官培养需要分离组织特异性干细胞群, 然后将其嵌入细胞外基质中, 并加入明确的组织特异性生长因子, 实现类器官的增殖。

类器官构建委托技术服务

环特生物简介

医-健-美-食产业斑马鱼技术应用服务商

环特生物，已通过CNAS、CMA、ILAC-MRA、AAALAC资质认证。

环特生物，是专注服务于生物医药和大健康美妆产业的一站式功效与安全评价技术提供商。经多年发展，已形成了以斑马鱼平台为核心，以类器官、哺乳动物、人体和微生物平台为特色，兼具生物医药CRO能力和大健康美妆一站式研发检测的产业平台新格局。

作为斑马鱼技术应用服务商，环特生物深度挖掘、创新斑马鱼技术的应用场景，将斑马鱼模型、基因编辑技术和模型，成功应用于药物、保健食品、化妆品、功能食品的原料筛选、配方研发、生产质控、营销背书、新品备案以及斑马鱼实验室的建设运营，为企业提供全产业链条上的功效和安全评价的技术服务。

类器官构建委托技术服务，请拨电话咨询 0571-83782130，项目经理手机 17364531293（微信同号）。

环特生物，利用斑马鱼模型实验，为客户提供毒性评价、毒理学实验、急毒长毒实验、化妆品,保健食品,药物毒性评价检测、生态水质毒性检测等服务，周期短、费用低、高效专业。

毒性实验-毒理学评价检测

疾病/病理 毒性评价-安全性评价模型

更多的毒理实验-毒性评价检测及内容，请拨电话咨询：0571-83782130，项目经理手机 17364531293

环特生物公司已通过国家CNAS、CMA资质认定和AAALAC国际认证，自有2000m²斑马鱼生物评价实验室。

环特生物在斑马鱼技术研发与应用领域，已牵头起草发布团体标准10项，申请发明专利64余项，自主开发的主要斑马鱼模型150多种，发表SCI及核心期刊论文120余篇，已有7个新药项目成功将环特生物斑马鱼实验数据用于CFDA的临床试验申报，公司已累计完成项目超5000个，建立长期合作客户600多家。

环特生物可定制的斑马鱼实验模型有数百种，主要应用于化妆品,保健食品,药物功效与安全性评价、药理毒理评价、临床前研究实验、药物高通量筛选、化合物筛选、活性成分筛选、分子生物学实验、斑马鱼行为分析等，周期短、费用低、高效专业。

▼斑马鱼模型实验-CRO实验外包-定制服务项目（部分）

▼药物实验类服务项目（CRO外包委托实验）

▼食品/保健食品功效与毒性安全性评价检测项目（部分）

▼化妆品/原料 评价备案检测项目（部分）

更多更详细的斑马鱼模型实验定制服务项目，请拨电话咨询 0571-83782130，项目经理手机 17364531293。

环特生物公司已通过国家CNAS、CMA资质认定和AAALAC国际认证，自有2000m²斑马鱼生物评价实验室。

环特生物在斑马鱼技术研发与应用领域，已牵头起草发布团体标准10项，申请发明专利64余项，自主开发的主要斑马鱼模型150多种，发表SCI及核心期刊论文120余篇，已有7个新药项目成功将环特生物斑马鱼实验数据用于CFDA的临床试验申报，公司已累计完成项目超5000个，建立长期合作客户600多家。

【评价原理】

斑马鱼作为一种理想的人类血液毒性模型，是以其造血系统与人类造血系统在进化上高度保守性尾前提的。通过与人类造血类似的信号传导通路，斑马鱼形成了以包括红系、髓系、淋系及巨核系为主的造血系统。斑马鱼可建立多种血液系统毒性模型，主要包括红细胞、白细胞、出凝血障碍性毒性三大类，因此主要与斑马鱼中性粒细胞、巨噬细胞、红细胞和血流量相关。由于斑马鱼具有身体积小、实验周期短等优点，可以用作评估血液毒性的一种便捷模型。

转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼中性粒细胞自身发出荧光，可以直接在荧光显微镜下观察中性粒细胞个数；黑色素等位基因突变斑马鱼通体透明，经过巨噬细胞染色后可以直接在显微镜下观察巨噬细胞数量；利用邻联茴香胺将斑马鱼心脏红细胞染色，在显微镜下可以直接观察红细胞数量（信号强度）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组(供试品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内)。

处理结束后，(1)通过荧光显微镜观察并统计斑马鱼中性粒细胞数量；(2)通过染色斑马鱼巨噬观察巨噬细胞细胞数量；(3)通过邻联茴香胺染色心脏部位红细胞，在显微镜下观察心脏红细胞染色强度。

【结果展示】

图1.斑马鱼中性粒细胞表型图

（绿色小点为中性粒细胞）

可以看到，供试品组中性粒细胞个数较正常对照组明显减少。

图2.斑马鱼巨噬细胞表型图

（红色小点为巨噬细胞）

可以看到，供试品组巨噬细胞数量较正常对照组明显减少。

图3.斑马鱼红细胞抑制表型图

（蓝色虚线框内为分析区域,分析红细胞染色强度）

可以看到，供试品组心脏红细胞染色强度较正常对照组明显降低。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，供试品组的中性粒细胞数量、巨噬细胞数量明显减少，红细胞染色强度明显降低。

2.本实验证实了此供试品诱发血液毒性。

更多项目服务，请拨电话咨询：0571-83782130，项目经理手机 17364531293（微信同号）

环特生物，依托斑马鱼模型实验，可做上百种筛选模型，如动物模型药物筛选、药物高通量筛选、活性成分筛选、化合物筛选、中药新药筛选、毒性筛选、抑制剂筛选、酶活性筛选、多肽药物筛选等服务，周期短、费用低、高效专业。

药物筛选项目

病理药物筛选模型

高通量药物筛选

更多药物筛选模型及内容，请拨电话咨询 0571-83782130，项目经理手机 17364531293

环特生物公司已通过国家CNAS、CMA资质认定和AAALAC国际认证，自有2000m²斑马鱼生物评价实验室。

环特生物在斑马鱼技术研发与应用领域，已牵头起草发布团体标准10项，申请发明专利64余项，自主开发的主要斑马鱼模型150多种，发表SCI及核心期刊论文120余篇，已有7个新药项目成功将环特生物斑马鱼实验数据用于CFDA的临床试验申报，公司已累计完成项目超5000个，建立长期合作客户600多家。

斑马鱼CRISPR基因编辑技术服务，含基因敲入品系制备、基因敲入品系制备、转基因品系制备等。

斑马鱼基因敲入品系制备

服务简介：

1. 基因敲入(Knock in)

非同源依赖的DNA修复技术，在斑马鱼基因组定点插入外源DNA片段（荧光蛋白、PA等）。

2. 基因敲入技术特点

    2.1 定点插入；

    2.2敲入效率较低。

服务流程：

根据客户基因敲入要求进行基因分析；

cas9 mRNA和多个gRNA靶点的设计及合成；

高效gRNA靶点的筛选及效率验证；

敲入载体设计及构建；

斑马鱼胚胎的显微注射和敲入验证；

F0代斑马鱼的可遗传性筛选；

杂合子F1代斑马鱼的基因型鉴定。

环特生物优势：

国际一流的斑马鱼敲入技术以及上百例的成功经验；

特有的高效筛选方法。

案例展示：

斑马鱼基因敲除品系制备

服务简介

1.基因敲除(Gene Knockout)

根据给定GeneID或Gene name，分析基因保守结构域，在保守结构域或客户指定区域设计靶点并制备靶点gRNA，gRNA和Cas9共注射使基因产生移码突变，通过PCR筛选得到稳定遗传品系。

2. 基因敲除技术特点

    2.1 通过将基因敲除斑马鱼品系与野生型相比较，研究者可以揭示特定基因的功能。

    2.2 在基因组水平上将目标基因敲除，遗传背景干净清晰，是研究基因功能的金标准。

服务流程

▲根据客户提供的GeneID或Gene name进行基因分析——▲cas9 mRNA和多个gRNA靶点的设计及合成——▲高效gRNA靶点的筛选及效率验证——▲F0代斑马鱼的可遗传性筛选——▲杂合子F1代斑马鱼的基因型鉴定

环特生物优势

成熟的基因敲除技术快速获得稳定品系；

多靶点共注射F0代验证基因功能。

斑马鱼敲除品系成功案例

1、基因分析

分析目的基因的保守结构域；

2、靶点筛选

设计4个gRNA靶点，PCR检测包含靶点的区域真实序列，显微注射验证靶点效率；

3、大规模注射养殖F0

Cas9 pro+gRNA 共注射，共养殖 F0 约 80 条用于后期Founder筛选；

4、Founder 筛选 

F0代斑马鱼与野生型外交，收集48hpf的F1胚胎抽取基因组，PCR鉴定，测序结果在靶点位置出现双峰的认为产生突变，然后TA clone验证其可能产生的突变方式；

5、F1 代筛选

F1代斑马鱼剪尾筛选，TA clone验证突变方式：

通过对测序图谱的分析获得突变方式为：-5bp，产生移码突变的敲除斑马鱼；

通过对测序图谱的分析获得突变方式为：-4-3bp，产生移码突变的敲除斑马鱼模型。

斑马鱼转基因品系制备

服务简介

1. 转基因

斑马鱼转基因技术包括显微注射、电穿孔技术（电脉冲介导）、精子载体法、GAL4/UAS 转录激活系统、Tol2转座子介导、拟型反转录病毒介导、重组杆状病毒介导等方法。

2. 转基因技术目的

    2.1 通过定点敲除技术进行基因鉴定和功能研究； 

    2.2 利用报告基因对受体等蛋白质进行功能研究；

    2.3 构建各种斑马鱼突变体，通过斑马鱼疾病模型进行人类疾病研究和药物筛选；

    2.4 构建含有特异性启动子的生物感应器，用于环境监测。

3. Tol2转座子介导的转基因技术优点

    3.1 Tol2转座子可携带大片段DNA；

    3.2 Tol2转座子没有位置偏好性，几乎能整合到染色体的任意位置；

    3.3 Tol2转座子的耐受范围很广；

    3.4 Tol2作为天然的具有自主转座活性的脊椎动物转座子，能够在胚胎发育的不同时期进行有效的转移；

    3.5 Tol2转座子介导的转基因技术能够有效克服外源基因在后代传递频率低的技术难题。

服务流程

▲客户提出转基因品系制备需求→▲分析可行性→▲构建载体→▲斑马鱼胚胎注射→▲founder筛选→▲F1代斑马鱼养殖→▲F2代斑马鱼养殖

环特生物优势

1.特有的养殖方法可缩短服务周期；

2.丰富的经验和及时沟通助力科研实验。

参考文献：

[1] 刘丽丽, 王健, 王海胜,等. 斑马鱼转基因平台的建立[J]. 生物技术通报, 2013(010):120-126.

[2] 陶然, 常玉梅, 李世国,等. Tol2转座子的特性及其在转基因鱼类中的应用[J]. 水产学杂志, 2014, 000(001):60-64.

超高折扣，亏本迎新。环特双11 “三重礼遇·嘉年华”大型答谢活动！豪礼+钜惠促销+折上折！

近年来，环特生物持续深化和拓展健康产品功效与安全性评价技术，以斑马鱼生物评价、细胞测评，人体试验等测评技术为依托先后在中、美两国布局6家子公司，不断以优质的平台与技术，助力健康美丽产业高质量发展！为庆祝环特人体功效业务全面上线、北京环特和上海环特盛大开业的三大喜事，环特生物特推出“三重礼遇·嘉年华”的大型全国性答谢迎新活动。

【活动时间】：2022年11月7日-11月20日

【活动范围】：化妆品行业

【活动内容】

01、一重促销礼：折扣低至三折起 叠加实验折上折 免赠服务超惊喜

02、二重快筛礼：¥399，让中国原料加速崛起

问：为原料研发筛选插上翅膀，需要多少钱？答：只需399元。应用斑马鱼开展化妆品原料高通量筛选的，价格将至历史最低399元/功效，宣扬中国原料，助力本土品牌崛起。

03、三重联名礼：一纸长约与君签，四大惊喜任你选

活动期内，双方达成长期战略合作框架的，尊享环特斑马鱼实验室联合挂牌、学术论文合作、联合制定标准和项目联合申报等四大超强背书力的创新联名合作。

【活动垂询】

1、老客户可与您所在地的商务经理联系；

2、新客户可致电环特生物客服中心咨询：0571-83782130，项目经理手机17364531293（微信同号）

【活动说明】

1、活动期间，完成签约后须于11月25日前支付约定款项，且于12月10日前寄送所有测试样品，上述活动权益方可生效；

2、名额有限，先到先得。

环特生物化妆品事业部，2022年11月1日。

本活动最终解释权归环特生物及旗下子公司所有。

一、本研究路径中核心技术的优势

1.斑马鱼

（1）遗传保守性与生理相似性

斑马鱼与人类在基因和生理功能上具有高度保守性。超过70%的人类蛋白质在斑马鱼中存在同源物，与疾病相关的蛋白质同源比例高达82%以上。

（2）独特的生物学特性

胚胎透明。便于观察器官发育和病理变化；每周可产卵数百枚，3-4个月达到性成熟，支持大规模实验；体外受精。易于基因操作和显微注射；成本低廉。远低于哺乳动物模型。

（3）技术成熟度高

环特在CRISPR/Cas9基因编辑、单碱基编辑器、Morpholino反义寡核苷酸敲低、Tol2转座子转基因等技术成熟，可快速构建精准罕见病模型。

2.类器官

（1）生理相关性强‌

三维结构自组织形成类似原器官的细胞类型、空间架构和功能，比二维细胞系更真实模拟人体组织生理与病理状态。

（2）‌患者特异性保留

活检组织或iPSC构建，保留个体遗传背景、突变谱和肿瘤异质性，用于个性化药敏测试。

（3）‌跨疾病广谱适用

可构建肿瘤类器官及遗传性疾病的正常类器官，弥补动物模型在人类特异性机制上的不足。

（4）‌高效可扩展

培养周期短、适合高通量药筛和CRISPR基因过表达和敲降，且可冻存建立“活体生物银行”。

二、本研究路径的经典案例

（一）斑马鱼经典案例

1.阐明罕见病的发病机制

（1）神经肌肉疾病:对于超罕见的布罗迪肌病(Brody Myopathy)，由于小鼠模型因呼吸衰竭早期致死,斑马鱼acc突变体(atp2a1基因突变)成为研究该病的主要动物模型,揭示了SERCA1蛋白功能受损的分子机制。

（2）颅面发育障碍：日本九州大学利用斑马鱼模型研究Nager综合征(全球报道不足100例),发现sf3b4基因缺陷通过抑制fgf8基因表达影响神经细胞,导致面部骨骼发育异常,并证实FGF8蛋白注射可减轻病症。

（3）淋巴系统罕见病:以色列魏茨曼科学研究所利用斑马鱼胚胎建立了卡波西样淋巴管瘤病（Kaposiform Lymphangiomato-sis, KLA)模型,发现NRAS基因突变被"卡死"在启动状态导致淋巴细胞无限增殖,并筛选出两种安全性更高的候选药物。

2.高通量药物筛选

（1）大规模筛选

可在短时间内测试数百种化合物。例如,在DMD研究中,通过双折射成像技术评估肌肉完整性，筛选出组蛋白去乙酰化酶抑制剂等表观遗传调节剂。

（2）药物重定位:检测约150种已获批药物,快速发现新适应症。如线粒体通透性转换孔抑制剂在斑马鱼DMD模型中显示出改善肌肉功能的潜力。

（3）自动化系统：结合自动化药物筛选系统，可高效评估候选药物疗效。

3.基因修饰因子鉴定

利用CRISPR/Cas9筛选平台,研究人员在斑马鱼DMD模型中鉴定出galntl6、manla1等新型疾病修饰基因,为开发联合治疗策略提供了新靶点。

4.超罕见疾病的研究突破

对于患者极少的超罕见疾病(如XMEA,全球仅33例报道)，斑马鱼模型提供了可行的研究途径。美国阿拉巴马大学通过构建VMA21基因突变斑马鱼,成功模拟了该病的肌肉无力症状,并从中筛选出两种显著改善症状的药物。

（二）类器官经典案例

服务咨询

了解更多罕见病研究，请留言或拨电话咨询：0571-83782130，手机 17364531293（微信同号）。

环特生物，利用斑马鱼模型实验，为药品企业提供药物临床前研究、临床前动物实验、药理/毒理研究实验、临床前药效评价、临床前安全性评价等服务，周期短、费用低、高效专业。助力企业做好研发、品控和宣传推广。

临床前-药物评价-药物筛选-毒性实验检测项目

临床前-药效评价-药物功效评价模型

临床前-药物安全性评价-毒性评价模型

更多药物临床前研究实验及内容，请拨电话咨询：0571-83782130，项目经理手机 17364531293

环特生物公司已通过国家CNAS、CMA资质认定和AAALAC国际认证，自有2000m²生物评价实验室。

环特生物在斑马鱼技术研发与应用领域，已牵头起草发布团体标准10项，申请发明专利64余项，自主开发的主要斑马鱼模型150多种，发表SCI及核心期刊论文120余篇，已有7个新药项目成功将环特生物斑马鱼实验数据用于CFDA的临床试验申报，公司已累计完成项目超5000个，建立长期合作客户600多家。

服务项目

环特CRISPR/Cas9基因编辑技术，可构建转基因、基因敲除（KO）、基因敲入（KI）、点突变（PM）等各类基因编辑小鼠模型，为客户提供现大小鼠模型定制、联合研发等服务。

找大小鼠基因编辑公司，选环特生物，一站式大小鼠基因编辑服务！

大小鼠基因编辑定制流程图：

技术介绍

Cas9/gRNA复合物在靶位点进行切割，产生双链断裂，迫使细胞进行紧急修复。通常条件下，细胞偏向于使用非同源末端连接的方式对断裂的双链进行修复，进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。CRISPR/Cas9技术采用独特的受精卵处理方式让受精卵偏好同源重组修复路径，大大提高同源重组效率，使得DNA大片段敲入（KI）及条件性敲除（CKO）得以实现。

四大优势

● 周期短，效率高； ● 高嵌合率，生殖遗传稳定； ● 可实现DNA大片段敲入； ● 可实现条件性敲除。

服务流程和周期：

基因敲除小鼠模型构建

完全性基因敲除小鼠

通过CRISPR /Cas9基因敲除技术，针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。

CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。

条件性基因敲除小鼠

通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个floxed小鼠。该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，该基因表达正常；当floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因，而在其它组织或细胞中该基因表达正常。

▲小鼠基因敲除（Cas9-KO）方案图

基因敲入小鼠模型构建

利用CRISPR/Cas9基因敲入技术，针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector，通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达；也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生。

▲小鼠基因敲入（Cas9-KO）方案图

CRISPR/Cas9基因敲入小鼠包括：点突变、片段基因敲入。

▲点突变（Cas9-PM）方案图

转基因小鼠模型构建

制作转基因大小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。DNA原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。 

四大优势

● 更高的整合效率和目的基因表达概率； ● 更大的目的片段的插入； ● 更“精确”拷贝数的插入； ● 可自由移除插入片段。

服务流程和周期

质粒或BAC载体构建（2~3周）→ 原核显微注射：大小鼠（3周）→ 大小鼠的鉴定（1~2周）。

建立转基因大小鼠品系系原则与流程

1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不 同的首代转基因鼠中也不同。因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中 一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。

2、 原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。

3、 F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。

4、 对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。

转基因小鼠类型

● 过表达转基因小鼠； ● RNAi转基因小鼠； ● microRNA转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠。

全新基因编辑Immediate-Phenotype技术

全新基因编辑Immediate-Phenotype技术可实现三个月内拿到超过100只有表型小鼠，并可得到靶标基因所带来的表型变化，同时实现长达50KB片段基因编辑。

目前我们可实现基因敲除 、基因敲入和点突变的Immediate-Phenotype，尤其是点突变技术在遗传性疾病发现和疾病研究上有重大意义，可快速实现罕见病的定性。

在商业价值上，可实现生产成本和时间成本大幅降低。

 服 务 咨 询 

更详细的基因编辑服务内容，请拨电话咨询：0571-83782130，手机 17364531293（微信同号）。

环特拥有实验动物生产和使用许可证，已通过CNAS、CMA、AAALAC认证，自有8500m²动物试验实验室。