【评价原理】

与人类相似，中性粒细胞在斑马鱼体内发挥固有免疫作用，且是体内数量最多的白细胞在炎症反应起始阶段有一系列事件发生，如血管舒张、毛细血管网的通透性增强、炎性介导释放等。化妆品对皮肤的刺激表型主要表现为皮肤炎症，炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进和水肿。刺激物进入斑马鱼体内，诱导炎症反应，中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表皮迁移并聚集。

采用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，可在荧光显微镜在观察到皮肤受刺激的斑马鱼皮肤上的中性粒细胞明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

皮肤吸收供试品一段时间后，我们在显微镜下观察斑马鱼皮肤上中性粒细胞数量（头部、心脏和血管中的中性粒细胞除外）。

【结果展示】

图1. 斑马鱼皮肤刺激性表型图

绿色光点为中性粒细胞，绿色荧光越多，中性粒细胞越多，皮肤刺激性越强

可以看到，供试品组斑马鱼皮肤上中性粒细胞数量明显增加。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，摄入供试品组的斑马鱼皮肤上中性粒细胞明显增多，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该十二烷基磺酸钠（SLS）和甲基异噻唑啉酮对斑马鱼有皮肤刺激性。

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环特生物，利用斑马鱼模型实验，为药品企业提供药效评价、药物功效与安全性评价、毒性毒理实验、临床前研究、药物筛选、活性成分筛选等生物检测服务，周期短、费用低、高效专业。助力药品企业做好研发、品控和宣传推广。

药物评价-药物筛选-毒性实验检测项目

药效评价-药物功效评价模型

药物安全性评价-毒性评价模型

更多药物评价筛选等项目及内容，请拨电话咨询：0571-83782130，项目经理手机 17364531293

环特生物公司已通过国家CNAS、CMA资质认定和AAALAC国际认证，自有2000m²生物评价实验室。

环特生物在斑马鱼技术研发与应用领域，已牵头起草发布团体标准10项，申请发明专利64余项，自主开发的主要斑马鱼模型150多种，发表SCI及核心期刊论文120余篇，已有7个新药项目成功将环特生物斑马鱼实验数据用于CFDA的临床试验申报，公司已累计完成项目超5000个，建立长期合作客户600多家。

【评价原理】

斑马鱼肾脏的肾小球具有与高等脊椎动物肾脏同样的细胞组成，同样的血液滤过、肾小管重吸收功能，一旦肾功能损伤或缺失，斑马鱼就会因无法调节渗透压而产生严重的水肿，同时可能导致肾小球滤过功能下降。

因此，我们可以用两种方法评价肾脏毒性：1. 肾性水肿发生率。由于斑马鱼通体透明，肾性水肿可以明显的被观察到。2. 肾小球滤过率。我们可以对斑马鱼注射一种荧光标记物，一段时间后，正常斑马鱼可将荧光标记物排出体外，而肾小球滤过功能损伤的斑马鱼则不能，通过荧光标记物排泄的情况可以反应斑马鱼肾脏的功能。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼表型进行观察评价，统计肾性水肿发生情况

【结果展示】

图1. 斑马鱼肾脏毒性表型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼出现了明显的肾性水肿的表型。

图2. 斑马鱼肾小球滤过率典型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼荧光强度明显强于正常对照组，标记物排泄明显减少，肾小球滤过率下降，肾脏功能受损。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼有明显的肾性水肿和肾小球滤过率明显下降，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验说明该供试品对斑马鱼有肾脏毒性。

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【评价原理】

过敏原/致敏因子诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放活性介质如组胺、5-HT，前列腺素D、白三烯、血小板活化因子等，表现为平滑肌收缩，毛细血管扩大和通透性增强，腺体分泌物增多等，诱发多种过敏症状。 类胰蛋白酶是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是临床上检验人体是否过敏的重要指标。斑马鱼产生过敏反应时，亦诱导肥大细胞分泌类胰蛋白酶。C48/80作为肥大细胞活化剂，可以诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放类胰蛋白酶。

我们检测过敏有两种方法。1. 类胰蛋白酶的含量：用酶标仪检测类胰蛋白酶的含量。2. 肥大细胞数量：制作病理切片，经过过碘酸雪夫染色，肥大细胞呈蓝色，肥大细胞释放的组胺和白三烯等物质呈红色。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成四组，分别是正常对照组和滴注致敏剂低、中、高剂量组。其中正常对照组未滴注C48/80，滴注致敏剂组均滴注C48/80低、中、高剂量（C48/80通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

滴注C48/80一段时间后，利用酶标仪检测类胰蛋白酶含量（吸光度值），同时制作病理切片进行过碘酸雪夫染色。

【结果展示】

图1. 斑马鱼类胰蛋白酶含量（吸光度值）

与正常对照组比较，*p < 0.05，***p < 0.001

可以看到，滴注中、高浓度致敏剂组类胰蛋白酶含量与正常对照组比较明显升高。

图2. 斑马鱼体内肥大细胞染色典型图

箭头指示为肥大细胞

从病理切片中也能看出来，滴注致敏剂组斑马鱼的肥大细胞与正常对照组相比数量明显上升。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，滴注致敏剂组斑马鱼类胰蛋白酶含量和肥大细胞数量与正常对照组相比数量明显上升。

2.本实验证实了C48/80具有明显的致敏作用。

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服务项目

环特CRISPR/Cas9基因编辑技术，可构建转基因、基因敲除（KO）、基因敲入（KI）、点突变（PM）等各类基因编辑小鼠模型，为客户提供现大小鼠模型定制、联合研发等服务。

找大小鼠基因编辑公司，选环特生物，一站式大小鼠基因编辑服务！

大小鼠基因编辑定制流程图：

技术介绍

Cas9/gRNA复合物在靶位点进行切割，产生双链断裂，迫使细胞进行紧急修复。通常条件下，细胞偏向于使用非同源末端连接的方式对断裂的双链进行修复，进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。CRISPR/Cas9技术采用独特的受精卵处理方式让受精卵偏好同源重组修复路径，大大提高同源重组效率，使得DNA大片段敲入（KI）及条件性敲除（CKO）得以实现。

四大优势

● 周期短，效率高； ● 高嵌合率，生殖遗传稳定； ● 可实现DNA大片段敲入； ● 可实现条件性敲除。

服务流程和周期：

基因敲除小鼠模型构建

完全性基因敲除小鼠

通过CRISPR /Cas9基因敲除技术，针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。

CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。

条件性基因敲除小鼠

通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个floxed小鼠。该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，该基因表达正常；当floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因，而在其它组织或细胞中该基因表达正常。

▲小鼠基因敲除（Cas9-KO）方案图

基因敲入小鼠模型构建

利用CRISPR/Cas9基因敲入技术，针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector，通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达；也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生。

▲小鼠基因敲入（Cas9-KO）方案图

CRISPR/Cas9基因敲入小鼠包括：点突变、片段基因敲入。

▲点突变（Cas9-PM）方案图

转基因小鼠模型构建

制作转基因大小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。DNA原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。 

四大优势

● 更高的整合效率和目的基因表达概率； ● 更大的目的片段的插入； ● 更“精确”拷贝数的插入； ● 可自由移除插入片段。

服务流程和周期

质粒或BAC载体构建（2~3周）→ 原核显微注射：大小鼠（3周）→ 大小鼠的鉴定（1~2周）。

建立转基因大小鼠品系系原则与流程

1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不 同的首代转基因鼠中也不同。因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中 一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。

2、 原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。

3、 F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。

4、 对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。

转基因小鼠类型

● 过表达转基因小鼠； ● RNAi转基因小鼠； ● microRNA转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠。

全新基因编辑Immediate-Phenotype技术

全新基因编辑Immediate-Phenotype技术可实现三个月内拿到超过100只有表型小鼠，并可得到靶标基因所带来的表型变化，同时实现长达50KB片段基因编辑。

目前我们可实现基因敲除 、基因敲入和点突变的Immediate-Phenotype，尤其是点突变技术在遗传性疾病发现和疾病研究上有重大意义，可快速实现罕见病的定性。

在商业价值上，可实现生产成本和时间成本大幅降低。

 服 务 咨 询 

更详细的基因编辑服务内容，请拨电话咨询：0571-83782130，手机 17364531293（微信同号）。

环特拥有实验动物生产和使用许可证，已通过CNAS、CMA、AAALAC认证，自有8500m²动物试验实验室。

【评价原理】

光毒物质在特定的波长光线刺激下，形成单线态和三线态后，可迅速与细胞小分子物质结合形成特异的光激活物质。这种物质在体内会降解为普通毒物或再次成为光毒物质，对机体造成伤害。在急性光毒性反应中，皮肤在照射紫外线后数分钟至数小时内出现红斑、水疱等。在慢性光毒性中可引起照射处皮肤色素的沉着过多以及皮肤增厚。斑马鱼皮肤包括表皮、真皮和真皮下组织，结构与人高度相似。因此，斑马鱼适合评价化妆品的光毒性。

我们评价斑马鱼光毒性有2个指标：1.毒性表型；2.LC50。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成12个组，分别是避光正常对照组，5个避光供试品组，光照正常对照组，5个光照供试品组。供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内。

皮肤吸收一段时间供试品后，我们记录斑马鱼各组斑马鱼死亡率，以软件计算供试品LC50；并记录拍照记录明显毒性表型。

【结果展示】

图1：光毒性表型图

可以看到，正常对照组和光照处理正常对照组未诱发任何毒性表型。供试品组诱发卵黄囊吸收延迟，光照处理的供试品组诱发心血管毒性和肾毒性等。

图2. 供试品LC50

可以看到，未光照的供试品与光照过的供试品LC50有明显差异。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，光照过的供试品诱发毒性表型较未光照的供试品严重，且与正常对照组存在明显的差别；未光照的供试品与光照过的供试品LC50有明显差异。

2.本实验证实了供试品具有光毒性。

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【评价原理】

 皮肤弹性作为皮肤组织的重要生物力学特性，对生理病理状态的分析、诊断、治疗有着极其重要的参考价值和指导作用，是评价皮肤功能的重要指标。皮肤的液体含量(血液、淋巴液)、弹力纤维和肌纤维的特性及神经组织的紧张度是决定皮肤弹性高低的重要因素。皮肤的弹性和胶原蛋白有关，人体内的胶原蛋白不足时，便会出现皮肤的弹性下降。

I型是在大多数结缔组织中发现的原纤维形成胶原，在骨骼，角膜，真皮和肌腱中含量丰富。在人体内，I型胶原是一种三聚体，主要由两条α1链和一条α2链组成，分别由col1a1和col1a2基因编码。相反，在斑马鱼中，存在三种I型胶原基因，分别编码α1（I），α3（I）和α2（I）链的col1a1a，col1a1b和col1a2。在胚胎和幼虫发育过程中，三种I型胶原基因显示出相似的时空表达模式，表明它们在这些阶段的共同调控和相互依赖性。通过检测皮肤弹性相关基因（皮肤胶原蛋白col1a2基因、col1a1a和col1a1b基因）相对表达量来表明产品的增加皮肤弹性功效。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和皮肤弹性产品组（皮肤弹性产品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

皮肤吸收皮肤弹性产品一段时间后，我们通过qPCR检测皮肤胶原蛋白col1a2基因（推荐）、col1a1a和col1a1b基因的转录水平，并计算其相对表达量。

【结果展示】

以col1a2基因为例，提供柱状图

图1. 斑马鱼体内col1a2相对表达量

与正常对照组比较，*** p< 0.001

可以看到，摄入皮肤弹性产品组的斑马鱼col1a2基因相对表达量较正常对照组明显增加。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用皮肤弹性产品组的col1a2基因、col1a1a和col1a1b基因相对表达量较正常对照组明显增加。

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环特生物是中国首家斑马鱼生物技术研究开发企业，专注于药物与大健康产品研发及毒理学评价等领域的技术外包服务，是中国首家通过AAALAC国际认证的斑马鱼研发机构，也是国家高新技术企业和国家火炬计划企业，并通过了中国合格评定国家认可委员会（CNAS，China National Accreditation Service for Conformity Assessment）和中国计量认证/认可（CMA，China Metrology Accredidation）的认证，检验检测项目表如下。

CNAS是由国家认证认可监督管理委员会批准设立并授权的国家认可机构，主要负责认证机构、实验室和检查机构等相关机构的认可工作。中国合格评定国家认可委员会是国际认可论坛（IAF）、国际实验室认可合作组织（IL-AC）、亚太实验室认可合作组织（APLAC）和太平洋认可合作组织（PAC）的正式成员，获得CNAS认证的实验室，也得到上述国际组织认可。

CMA是对检测机构的检测能力及可靠性进行全面的认证及评价。认证对象为所有对社会出具公正数据的产品质量监督检验机构及其他各类实验室如各种产品质量监督检验站、环境检测站、疾病预防控制中心等等。

下图为CNAS检测项目表：

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【评价原理】

正常人的皮肤颜色主要由黑色素决定，通常我们说的色斑、色沉也与黑色素有关。目前认可的黑色素形成途径主要为酪氨酸在酶催化下经过多巴氧化等过程，最终形成黑色素。由于斑马鱼拥有与人类相似的皮肤结构，黑色素的形成机理也与人类高度相似。而且斑马鱼的幼鱼身体透明，表皮的黑色素易于观察，因此可以用来观察产品的美白淡斑效果。

由于斑马鱼通体透明，斑马鱼的黑色素可以被明显地观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和美白淡斑产品组（美白淡斑产品熊果苷、曲酸等通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间美白淡斑产品后，我们对斑马鱼头部进行拍照，观察斑马鱼头部色素的变化情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼美白淡斑表型图

红色虚线区域为头部分析区域，区域内黑色部分为黑色素

可以看到，美白淡斑产品组的黑色素相比正常对照组明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用美白淡斑产品组的色素相比正常对照组明显减少。

2.本实验证实了熊果苷、曲酸美白产品具有美白淡斑功效。

更多项目服务，请拨电话咨询：0571-83782130，项目经理手机 17364531293（微信同号）

一、概述

依托领先业界的斑马鱼实验能力和创新平台资源，环特生物可为科研单位或个人提供基于斑马鱼技术的课题设计、中期审核、结题报告、实验场地、仪器设备、科研咨询、文献检索、样品安全与功效检测、文章发表、专利申请等科研课题整体解决方案。

斑马鱼，作为一种新的科研工具，其特色优势显著：可靠、快速、高效、高通量、高性价比，且创新性强，易于从众多课题项目中脱颖而出，能针对性地提供快速、准确、可靠的科研数据，协助科研人员发表论文专著、申报专利，实现项目顺利结题。

在科研合作前期，会针对性地对每个项目进行全方位的可行性评估，后期对该项目提供实验执行和技术支持等全面的科研服务，实现双方的学术共赢。借助本单位的资源优势，环特生物可助您：快速清除毕业、职称晋升阶段的技术障碍。即使面临繁忙工作的困扰，也一样能获得快速成长，高效实现科研目标。

二、服务内容

（1）基金写作与申请指导

科研思路把握；立题及开题设计；资料格式优化；标书内容编撰优化；预算评估；分配方案设计

（2）课题设计

文献搜索查询；实验思路可行性分析；实验方法技术指标分析；整体设计协助

（3）结题报告

数据整理与统计；结题报告撰写；结题资料整理改进；专家审评；资料校稿、排版与装订；组织专家组考核

（4）中期审核

实验数据整理；报告整改；预算审计与评估；专家审核；课题进度优化

（5）论文发表

期刊文章撰写；文章内容查重；投稿；投稿答复；实验补充

（6）专利申请

专利查新；专利设计；专利撰写；审核意见答复

三、公司介绍

杭州环特生物科技股份有限公司，是亚洲第一家斑马鱼技术公司，是专注服务于大健康和美妆产业的一站式功效与安全研发检测解决方案提供商。凭借在斑马鱼技术领域逾20年的深厚积累，环特生物将原本用于基础研究的斑马鱼生物技术，开创性地运用到药物、保健食品、化妆品和食品及农产品的研究与评价中。

公司研发团队由经验丰富的毒理学、药理学、食品化学、生物化学、生物信息学等各领域专业技术人员组成。技术团队成员中，具有硕博以上学历或高级以上职称占比70%以上。实验室场地面积超过1500平方米，拥有荧光显微镜、斑马鱼行为分析系统、斑马鱼心跳血液分析系统、GC-MS/MS等专业分析测试设备。拥有国际一流的斑马鱼养殖设施，养殖中心现有40,000尾成年斑马鱼，周产胚胎斑马鱼100,000条以上供实验研究用，领先、完善的设施设备，从硬件层面有效保障了项目顺利开展。

知识产权成果方面，环特生物在斑马鱼应用领域已牵头起草、发布团体标准3项，申请国家发明专利57项、授权27项（截止2021年5月）。公司自主开发斑马鱼技术模型150多种，发表SCI及核心期刊论文99篇（IF=12）、英文专著1部。有7个新药项目，成功将环特生物斑马鱼实验数据用于CFDA的临床试验申报。两项成果分获浙江省科学技术进步奖三等奖和神农中华农业科技奖一等奖，并作为核心技术方承担2022年杭州“亚运果蔬类食品农药残留非靶向快筛斑马鱼模型构建研究”的项目。两项斑马鱼产业化项目成果鉴定，经张伯礼院士和孙宝国院士技术专家审核评定，分获“国内领先水平”和“先进水平”。

截止目前，环特生物已通过国家CNAS实验室认可、CMA资质认定及 AAALAC国际实验动物认证。多项技术成果先后荣获德国纽伦堡国际发明金奖、英国国际发明展金奖及杰出创新奖、俄罗斯“新时代”第十六届国际发明与新技术展金奖、第48届日内瓦国际发明展银奖等国际权威大奖。近年来，环特生物承担省级（含）以上科研项目8项，相继被评为国家高新技术企业、浙江省科技型中小企业，且设有院士专家工作站、省级高新技术企业研发中心、浙江省博士后工作站等科研平台，并与中国农科院质标所成立了“农业农村部农产品质量标准研究中心生物评价实验室”的联合创新平台。