【评价原理】

利用物理/化学方法损伤斑马鱼肌肉、皮肤，伤口愈合过程中黑色素细胞会募集到伤口部位，伤口愈合相关基因表达量（如皮肤胶原蛋白colla1b基因）会显著增加以促进伤口愈合。由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和伤口愈合促进剂组。其中正常对照组未经过物理/化学损伤，模型对照组与伤口愈合促进组都经过了同程度的损伤。服用伤口愈合促进组在损伤后摄入胶原蛋白等伤口愈合促进剂。

服用一段时间伤口愈合促进剂后，观察伤口色素变化，并用实时荧光定量PCR仪检测伤口愈合相关基因的表达量。

【结果展示】

图1.伤口部位色素募集表型图

黄色虚线内为损伤部位

可以看出，伤口愈合促进剂组的伤口黑色素募集程度与同等程度损伤的模型对照组比较明显减轻。

图2. 斑马鱼体内cola1b基因相对表达量

与模型对照组比较，***p < 0.001 

可以看出，服用伤口愈合促进剂组cola1b相对表达量明显高于模型对照组。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用伤口愈合促进剂组的黑色素募集情况较模型对照组明显减轻，cola1b相对表达量也明显高于模型对照组。

2.本实验证实了胶原蛋白具有促进伤口愈合功效。

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人体皮肤逐渐衰老的重要原因是活性氧自由基对皮肤的长期氧化作用，具有抗氧化活性的化妆品能够清除皮肤表面自由基，通过斑马鱼技术可以有效评价化妆品及其原料清除自由基的能力。

【评价原理】

甲萘醌能产生活性氧自由基，当自由基产生量大于机体清除能力时就发生氧化应激反应，通过斑马鱼卵黄囊荧光强度评价供试品抗氧化作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成若干组，含正常对照组、模型对照组和化妆品组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组和化妆品组都加入等量的甲萘醌（甲萘醌通过溶解到标准稀释水中的方式摄入到斑马鱼体内）。化妆品组在加入甲萘醌的同时加入一定浓度的化妆品。

使用化妆品24 hpf后，，我们对斑马鱼整体进行特异性荧光染色，观察斑马鱼卵黄囊活性氧自由基产生情况。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 斑马鱼卵黄囊荧光表型图

黄色为分析区域，绿色荧光代表氧自由基

可以看到，阳性对照组和化妆品组与正常对照组相似，卵黄囊中只有少量的活性氧自由基。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼对比实验，阳性对照组和化妆品组与正常对照组相似，卵黄囊中只有少量的活性氧自由基。

2.本实验证实了该化妆品具有抗氧化的作用。

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【评价原理】

血管新生是指在已有血管结构的基础上长出新血管的生物学过程，是一个涉及多种细胞、基质及细胞因子的复杂过程。其中血管内皮细胞是循环血液与血管平滑肌的机械屏障，在缺血性疾病的治疗中，促进内皮细胞的增殖，重建缺血区微循环，促进血管新生是重要的治疗手段之一。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 ( HMGCR) 是他汀类药物发挥抑制作用的直接作用点, HMGCR功能被抑制会影响血管的完整性和稳定性。斑马鱼在发育起始阶段，存活不依赖血液循环，不会像哺乳动物那样由于循环缺失导致胚胎死亡。因此，可用辛伐他汀诱导斑马鱼血管缺失模型从而筛选血管再生促进剂。

运用转基因血管内皮荧光斑马鱼（呈绿色），血管缺失的斑马鱼肠下血管面积较正常斑马鱼肠下血管面积减小且肠下血管分支变少。由于转基因斑马鱼的特点，血管的变化可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和摄入血管再生促进剂组。其中正常对照组未摄入辛伐他汀，模型对照组与摄入血管再生促进剂组都摄入等量的辛伐他汀（辛伐他汀通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。摄入血管再生促进剂组在摄入辛伐他汀后摄入黄芪甲苷之类的血管再生促进剂。

服用一段时间血管再生促进剂后，我们对斑马鱼进行荧光拍照，观察斑马鱼肠下血管面积和肠下血管分支的变化。

【结果展示】

图1. 肠下血管面积表型图

黄色虚线区域为斑马鱼肠下血管面积

可以看到，服用血管再生促进剂组肠下血管面积与未摄入辛伐他汀的正常对照组比较相似，没有明显的血管缺失。

图2. 肠下血管分支表型图

白色箭头所指为斑马鱼肠下血管分支数

可以看到，服用血管再生促进剂组肠下血管分支与未摄入辛伐他汀的正常对照组比较相似，没有明显的血管缺失。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用血管再生促进剂的肠下血管面积和血管分支均与正常对照组比较相似，并未模型对照组肠下血管面积缩小、血管分支减少的情况。

2.本实验证实了黄芪甲苷具有促进血管再生作用。

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● 项目意义

肿瘤类器官是将肿瘤患者的新鲜组织经体外3D培养系统建立的、与肿瘤患者特征高度相似的一种立体模型，已被证实与患者肿瘤的病理组织学特征、分子特征、药物敏感性等保持高度一致，在对应的药物筛选领域有着巨大的应用空间。

同时，环特生物已建立的多癌种实体瘤斑马鱼PDX药敏评价体系已用于临床，为患者提供精准的用药指导。我们基于真实世界肿瘤患者的临床研究，联合国内知名三甲医院，开展全世界首个胃癌斑马鱼PDX与患者治疗效果的一致性评价项目（美国临床研究Clinical Trials注册号：NCT05616533），为斑马鱼PDX的临床应用提供更加充分的科学依据。

为满足不同科研场景的行业需求，环特生物联合该医院共同发起“基于胃癌的斑马鱼PDX与类器官抗肿瘤药效评价的科研项目”，通过构建胃癌的精准医疗生物样本库，致力于为广大药企的抗肿瘤药物提供药效评价的科研服务。

● 预期成果

1）构建不少于50例基于胃癌的类器官生物样本库，并完成类器官样本的临床信息、基因信息的采集

2）按需交付药物在胃癌斑马鱼PDX或类器官模型中的定性、定量数据

3）共同产出数篇国际前沿的科研论文

4）实现相关课题项目、技术创新奖项的申报

● 合作伙伴权益

标准权益——

1）享有项目所述样本库的“联合建设单位”两年冠名权

2）享有该项目最终成果的宣传权利

3）项目结束后，一定期限内享受特定数量的药物药效评价折扣

定制（付费）权益——

1）类器官药物研发平台建设（含培训1-3名类器官技术人员、胃癌类器官构建方法的技术转让）

2）其他相关需求及服务

● 项目分工

1）合作医院负责提供胃癌肿瘤组织样本

2）环特生物负责斑马鱼PDX与类器官样本库的构建服务与药效评价

3）药合作伙伴负责根据实际科研需求提供药物和科研经费

● 申报条件

1）具有一定新药研发经验的大中型药物研发机构

2）药物类型为胃癌的化疗药物、靶向药物（免疫类药物除外）、中药，以及辅助治疗的相关药物

● 合作伙伴名额

预计招募合作单位3家

● 项目周期

5-6个月

● 合作详询：成先生 17364531293

【评价原理】

斑马鱼胚胎在母体外发育，从合子期到孵化期仅72小时，且发育的完整过程均是透明的，利于实时观察和检测。斑马鱼幼鱼长3~4毫米，拥有6-384孔板的高通量检测体系，可实现低费-高效筛选。斑马鱼与人类基因同源性达到87%，用于保健食品的体内快速评价实验结果可比性强。故可以利用斑马鱼早期各个阶段的发育形态，准确高效的确定保健食品暴露在胚胎中的毒性，广泛应用于保健食品的发育毒性与致畸性研究。

实验结束后，在显微镜下观察并记录各浓度组织器官反应及死亡情况，用来保健食品对斑马鱼的毒性，并对典型毒性器官进行拍照。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和保健食品组。其中正常对照组为标准稀释水处理组，保健食品组按照既定浓度摄入了不同浓度的待测保健食品（待测保健食品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

在保健食品暴露过程中，每天观察记录各个浓度组斑马鱼的死亡情况，并及时挑除死鱼。实验结束后，统计斑马鱼死亡情况并使用OriginPro 8软件拟合数据曲线，获得保健食品的最大非致死浓度（MNLC）和LC10。

保健食品暴露一段时间后，我们在显微镜下观察记录斑马鱼身体各个指标的情况并对典型毒性器官进行拍照。

【结果展示】

图1. 斑马鱼发最大非致死浓度（MNLC）和LC10摸索数据拟合图

可以看到，该保健食品的MNLC为313 μg/mL，LC10为350 μg/mL。

图2. 斑马鱼发育毒性与致畸性表型图

H=Heart;J=Jaw;In=Intestinal tract;L=Liver;Y=Yolk sac;E=Eye

可以看到，保健食品组较正常对照组出现卵黄囊吸收延迟、心包水肿、体长变短、眼变小和肝变形。

【评价结论】

1.该保健食品的MNLC为313 μg/mL，LC10为350 μg/mL，诱发斑马鱼卵黄囊吸收延迟、心包水肿、体长变短、眼变小和肝变形。

2.本实验证实了该保健食品对斑马鱼有发育毒性与致畸性风险。

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【评价原理】

静脉注射给予长春瑞滨造模斑马鱼免疫力低下模型。大剂量长春瑞滨骨髓抑制明显，导致血小板、红细胞及白细胞数目（中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等）减少和贫血，最终导致免疫力低下。人类与斑马鱼在免疫系统的细胞组成上极为相似，而且斑马鱼是目前所有同时具有特异性免疫和非特异性免疫动物个体中体积最小的，适合高通量评价调节免疫功效。斑马鱼静脉注射大剂量长春瑞滨后可造成免疫低下。

采用转基因T细胞红色荧光斑马鱼，可在荧光显微镜在观察到免疫力低下的斑马鱼体内的T细胞荧光强度明显减弱。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用免疫调节剂组。其中正常对照组未注射长春瑞滨，模型对照组与服用免疫调节剂组都注射了等量的长春瑞滨（长春瑞滨通过静脉注射的方式摄入到斑马鱼体内）。服用免疫调节剂组在注射长春瑞滨后摄入异丙肌苷等免疫调节剂。

服用一段时间免疫调节剂后，我们观察斑马鱼T细胞荧光强度变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼T细胞表型图

蓝色箭头所指红色荧光颗粒为T细胞

可以看到，免疫调节剂组T细胞荧光强度与未注射长春瑞滨的正常对照组比较相似，没有出现明显的T细胞减少情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，免疫调节剂组的T细胞荧光强度与正常对照组相似，并未出现模型对照组T细胞减少的情况。

2.本实验证实了异丙肌苷具有增强免疫力的功效。

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【评价原理】

通常来说，炎症是机体的一种抗病反应，机体蒙受损坏后，机体的内坏境以及内境界和外坏境之间达到新的均衡的过程中会引发组装细胞的损坏，使片面组装细胞显现变性、坏死。

利用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼（MPO）作为模型，当体内炎症水平上升的时候，中性粒细胞的数量也就相对的增高，在荧光显微镜下，中性粒细胞的数量也就是表现出炎症反应程度的一个重要指标。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照与供试品组，通过服用/注射供试品一段时间后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼中性粒细胞的数量，同时检测体内炎症因子IL-6的表达情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼中性粒细胞数量

（箭头所指的绿色荧光点为中性粒细胞）

从实验结果可以看到，供试品组相对正常对照组斑马鱼侧线位置中性粒细胞数显著增多。

图2：斑马鱼体内的中性粒细胞数量及体内炎症因子表达水平的变化

从实验结果可以看到，斑马鱼供试品组相对正常对照组，IL-6炎症因子相对表达量下降。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，相对于正常对照组，服用或者注射供试品组之后，中性粒细胞增多和炎症因子上升。

2.本实验证实了供试品组等具有增加中性粒细胞数量，以及促进炎性因子表达的作用。

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【评价原理】

斑马鱼的胃肠道在细胞功能和解剖学方面均与人类相似，由内皮细胞、结缔组织、外纵肌和环状肌组成。胚胎发育至26～126 hpf( hours post fertilization，受精后小时)，斑马鱼胃肠道的管腔形成并不断生长，形成有功能的肠道上皮。在未喂食情况下，斑马鱼胚胎受精约72 hpf，肠道首次出现不稳定的自发收缩。伴随着发育的进行，第120～144 hpf，斑马鱼大部分的卵黄囊被吸收，肠道自发的蠕动及摄食能力增强。

我们评价斑马鱼胃肠道毒性有2个指标：1.胃肠道形态的变化；2.肠蠕动功能抑制。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。摄入供试品之前提前给予食物，摄入供试品一段时间后，我们观察斑马鱼肠道表型。

服用一段时间供试品后，我们观察胃肠道形态及内容物的情况。

【结果展示】

可以看到，斑马鱼给予食物后，食物充盈肠道。服用/注射供试品组食物明显多于正常对照组，表明肠蠕动功能被抑制。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼胃肠道形态与正常对照组比较，发生了明显的变化，且肠道蠕动功能被抑制。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有胃肠道毒性。

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皮肤组织中由于存在胶原蛋白、弹性蛋白等多种蛋白成分而具有一定的弹性，皮肤弹性是衡量皮肤健康与否的重要标志，很多针对熟龄肌的化妆品是由于提高了皮肤弹性而具有抗衰老功效。通过斑马鱼技术能有效评价化妆品增加皮肤弹性的功效。

【评价原理】

通过检测皮肤弹性相关基因的相对表达量（皮肤胶原蛋白col1a1a、col1a1b、col1a2基因）来表明样品是否具有增加皮肤弹性作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成若干组，含正常对照组和化妆品组。其中正常对照组未经任何处理，化妆品组添加受试化妆品。

使用化妆品24 hpf后，我们对每组斑马鱼进行收样，使用试剂盒提取RNA后，使用q-PCR检测目的基因的转录水平，通过斑马鱼皮肤胶原蛋白基因相对表达量评价化妆品增加皮肤弹性作用。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 斑马鱼体内col1a1b基因相对表达量

可以看到，化妆品高浓度组的col1a1b相对表达量较正常对照组显著增加。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼和两组平行对照的对比实验，化妆品高浓度组的col1a1b相对表达量较正常对照组显著增加。

2.本实验证实了该化妆品具有增加皮肤弹性的作用。

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急性毒性试验是了解外源化学物对机体产生急性毒性的根本依据，也是毒理学安全性评价的一步工作，斑马鱼早期发育阶段的胚胎期是其对外界环境敏感的阶段。斑马鱼的急性胚胎毒性对于化妆品的安全性评价具有重要的实际意义。

【评价原理】

将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的受试物溶液，一定时间段后记录斑马鱼胚胎的死亡率，确定50%试验鱼胚胎死亡的受试物浓度，用LC50表示。

【实验方案】

配制一定浓度系列的受试物溶液，在斑马鱼发育初期（4hpf-6hpf）分别水溶加入受试物，同时设置正常对照组，孵育48h后分别观察每组斑马鱼的发育状况，以卵凝结、体节异常、尾部未分离等判定胚胎死亡。记录每组斑马鱼胚胎的死亡率，绘制“浓度-死亡率”效应曲线，计算LC50值。

【结果展示】

1、斑马鱼胚胎死亡判定

图1.斑马鱼胚胎死亡表型图

2、LC50值：“浓度-死亡率”效应曲线

图2. 斑马鱼胚胎“浓度-死亡率”效应曲线

【评价结论】

经过48小时的实验，斑马鱼胚胎随着受试物浓度的增加逐渐出现死亡特征，LC50值为31.5μg/ml。

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