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服务项目

环特CRISPR/Cas9基因编辑技术，可构建转基因、基因敲除（KO）、基因敲入（KI）、点突变（PM）等各类基因编辑小鼠模型，为客户提供现大小鼠模型定制、联合研发等服务。

找大小鼠基因编辑公司，选环特生物，一站式大小鼠基因编辑服务！

大小鼠基因编辑定制流程图：

技术介绍

Cas9/gRNA复合物在靶位点进行切割，产生双链断裂，迫使细胞进行紧急修复。通常条件下，细胞偏向于使用非同源末端连接的方式对断裂的双链进行修复，进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。CRISPR/Cas9技术采用独特的受精卵处理方式让受精卵偏好同源重组修复路径，大大提高同源重组效率，使得DNA大片段敲入（KI）及条件性敲除（CKO）得以实现。

四大优势

● 周期短，效率高； ● 高嵌合率，生殖遗传稳定； ● 可实现DNA大片段敲入； ● 可实现条件性敲除。

服务流程和周期：

基因敲除小鼠模型构建

完全性基因敲除小鼠

通过CRISPR /Cas9基因敲除技术，针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。

CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。

条件性基因敲除小鼠

通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个floxed小鼠。该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，该基因表达正常；当floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因，而在其它组织或细胞中该基因表达正常。

▲小鼠基因敲除（Cas9-KO）方案图

基因敲入小鼠模型构建

利用CRISPR/Cas9基因敲入技术，针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector，通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达；也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生。

▲小鼠基因敲入（Cas9-KO）方案图

CRISPR/Cas9基因敲入小鼠包括：点突变、片段基因敲入。

▲点突变（Cas9-PM）方案图

转基因小鼠模型构建

制作转基因大小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。DNA原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。 

四大优势

● 更高的整合效率和目的基因表达概率； ● 更大的目的片段的插入； ● 更“精确”拷贝数的插入； ● 可自由移除插入片段。

服务流程和周期

质粒或BAC载体构建（2~3周）→ 原核显微注射：大小鼠（3周）→ 大小鼠的鉴定（1~2周）。

建立转基因大小鼠品系系原则与流程

1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不 同的首代转基因鼠中也不同。因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中 一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。

2、 原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。

3、 F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。

4、 对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。

转基因小鼠类型

● 过表达转基因小鼠； ● RNAi转基因小鼠； ● microRNA转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠。

全新基因编辑Immediate-Phenotype技术

全新基因编辑Immediate-Phenotype技术可实现三个月内拿到超过100只有表型小鼠，并可得到靶标基因所带来的表型变化，同时实现长达50KB片段基因编辑。

目前我们可实现基因敲除 、基因敲入和点突变的Immediate-Phenotype，尤其是点突变技术在遗传性疾病发现和疾病研究上有重大意义，可快速实现罕见病的定性。

在商业价值上，可实现生产成本和时间成本大幅降低。

 服 务 咨 询 

更详细的基因编辑服务内容，请拨电话咨询：0571-83782130，手机 17364531293（微信同号）。

环特拥有实验动物生产和使用许可证，已通过CNAS、CMA、AAALAC认证，自有8500m²动物试验实验室。

【评价原理】

斑马鱼的听觉外侧系统由内耳和侧线两个关键的感觉结构组成，斑马鱼具有典型的内耳结构，内耳的毛细胞和侧线的毛细胞在结构功能及分子水平上与哺乳动物的内耳毛细胞非常相似，包括对耳毒性药物的相似反应。

经过DASPEI特异性荧光染色（呈绿色），听力损伤的斑马鱼比正常斑马鱼毛细胞明显减少或缺失（荧光减弱或者消失）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体做毛细胞特异性染色，观察毛细胞的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼“浓度-死亡率”效应曲线

供试品最大非致死浓度（MNLC）和LC10

图2. 斑马鱼毛细胞表型图

绿色荧光点为听细胞聚集的神经丘

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼毛细胞减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼毛细胞明显减少，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有听毒性。

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【评价原理】

斑马鱼的骨骼看似与人类差别明显，实际上它的生长发育过程和调控机制与哺乳动物高度相似。而且斑马鱼骨骼发育迅速，适合快速建立骨骼疾病模型。在大量摄入糖皮质激素（以泼尼松为例）后，斑马鱼会出现继发性骨质疏松。

骨密度几乎由骨骼中钙含量来反映，应用特异性地结合钙的荧光染料染色（呈绿色），用其荧光强度可反映骨密度。斑马鱼骨骼染色后经荧光显微镜采集到的荧光强度能够客观反映骨密度。

【实验方案】

我们将测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用强健骨骼产品组。其中正常对照组未加入泼尼松，模型对照组与服用强健骨骼产品组加入了等量的泼尼松（泼尼松通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用强健骨骼产品组在加入泼尼松的同时加入碳酸钙、维生素D3之类的强健骨骼产品。

服用一段时间强健骨骼产品后，我们对斑马鱼整体做钙黄绿素染色，观察脊椎骨荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脊椎骨表型图

黄色虚线区域为脊椎骨

可以看到，服用强健骨骼产品的脊椎骨骨密度与正常对照组比较相似，没有明显的骨质疏松。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用强健骨骼产品组的骨密度与未经泼尼松处理的正常对照组相似，并未出现模型对照组的骨质疏松的情况。

2.本实验证实了碳酸钙、维生素D3具有显著的强健骨骼功效。

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【评价原理】

斑马鱼与人类的基因相似率高达87%, 与哺乳类动物相比, 斑马鱼的信号传导以及生理结构和功能方面都非常相似。斑马鱼能够对药物在体内的分布情况、吸收情况、代谢以及排泄等生理动态方面提供准确的信息, 尤其对小分子所引起的内分泌紊乱、再生毒性、行为缺陷、致畸、心血管毒性、肝毒性等毒性反应与人具有高度相似性。因此，使用斑马鱼作为药物早期的安全性评价是非常可靠的。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。通过环特生物剂量换算公式，将人每日推荐服用剂量换算为斑马鱼使用浓度进行安全性评价。

服用一段时间供试品后，我们观察斑马鱼各组织脏器的表型。

【结果展示】

图1. 斑马鱼毒性表型图

J：下颌；E:眼；H：心脏；L：肝脏；In：胃肠道；Y：卵黄囊

可以看到，服用人每日推荐服用剂量的供试品组未见明显异常。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用人每日推荐服用剂量的供试品组未诱发斑马鱼明显的毒性表型，与正常对照组斑马鱼相似。

2.本实验证实了在短期服用时，该供试品以人每日推荐服用剂量使用并未诱发安全性风险。

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雌激素是一类固醇激素，目前已成为一种新兴的污染物。一些无良商家为片面追求功效而在护肤产品中违规添加，导致很多女性因使用了此类护肤品而出现“激素脸”，表现为面部翻红、发痒、干燥脱皮，甚至烂脸流脓。

环特生物应用诺贝尔奖技术——荧光蛋白基因转移技术，可实现对化妆品中雌激素类化学物质的直观、精确和高效的检测评价。

【评价原理】

通过转基因标记表达的绿色荧光蛋白含量来反映雌激素含量，绿色荧光蛋白特异性地在肝脏进行表达，一旦供试品中含有雌激素类化学物质，转基因斑马鱼暴露后肝脏部位会出现特异性绿色荧光，可用绿色荧光量化供试品中的雌激素含量，从而达到评价效果。

【实验方案】

我们将受试的斑马鱼分为两组，分别为正常对照组和供试品组。在相同的温、湿度条件下培育一段时间后，在显微镜下对肝脏部位的绿色荧光进行量化分析。

【结果展示】

 图1. 雌激素处理后斑马鱼荧光表型图

可以看到，用供试品处理后的斑马鱼在肝脏部位显示明显的绿色荧光。

【评价结论】

1、经过各组斑马鱼的对比实验，雌激素处理组斑马鱼的肝脏部位出现明显的绿色荧光，与正常对照组存在明显的差别；

2、本实验说明供试品中存在雌激素类有害物质。

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【评价原理】

肠道消化是食物在消化道中分解的过程，包括机械性消化（通过消化道肌肉搜索将食物与消化液混合并向消化道远端推送）和化学性消化（通过消化腺分泌的消化酶将大分子分解为小分子物质的过程）。肠道内的消化液包括胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶等。在受精后的26-126 h，斑马鱼肠道的管腔形成，内胚层分化出连续的有功能的肠道上皮。斑马鱼肠道肌肉发达，可分为两层平滑肌，有利于食物的蠕动消化。

通过特异性的检测试剂盒检测OD值，可以量化斑马鱼体内胰脂肪酶和胰蛋白酶含量。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成二组，分别是正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内），加入相应的胰脂肪酶和胰蛋白酶特异性检测试剂。

服用供试品后，我们使用酶标仪对斑马鱼进行OD值的检测。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胰脂肪酶和胰蛋白酶OD值

可以看到，服用供试品组的胰脂肪酶和胰蛋白酶的OD值与正常对照组比较，有显著性提高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组与正常对照组比较胰脂肪酶和胰蛋白酶含量均有明显的升高。

2.本实验证实了供试品具有促进肠道消化功能的作用，主要表现为增加胰脂肪酶和胰蛋白酶的含量。

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【评价原理】

药物骨毒性的安全性研究与肝、肾、心脏毒性等一般毒性相比较为薄弱，尤其是儿科人群用药的骨毒性安全问题，骨毒性非临床安全性评价愈加受到重视。斑马鱼是一种与人类同源性较高的脊椎动物，和哺乳动物一样，斑马鱼的骨骼是从3种胚胎干细胞系即神经嵴、体节中胚层和侧板发育而来的。

斑马鱼骨骼经过特异性的荧光染色后，经荧光显微镜采集到荧光强度能反映出骨密度和脊椎骨的数量，从而评价供试品骨毒性。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，我们对斑马鱼整体做骨钙染色，以脊椎骨荧光强度和脊椎骨数量评价供试品的骨毒性。

【结果展示】

图1. 斑马鱼骨密度表型图

黄色虚线区域为计算用脊椎骨

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼脊椎骨荧光强度明显减弱。

图2. 斑马鱼脊椎骨数量表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼脊椎骨数量明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼脊椎骨荧光强度明显减弱、数量明显减少，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有骨毒性。

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【评价原理】

斑马鱼和哺乳动物的心脏有相似的功能，包括血流方向、由专门的心内膜肌肉组织驱动的高压系统、由电子系统调节的心律以及与起搏活动相关的心跳。而且斑马鱼幼鱼通体透明，血细胞在心脏和血液循环系统的堆积非常容易观察，因而利用斑马鱼模型研究心血管毒性极为方便。

我们评价斑马鱼心血管毒性有4个指标：1.心率；2.心节律；3.心包水肿面积；4.静脉瘀血面积。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼的心脏进行观察评价。

【结果展示】

图1. 斑马鱼心血管毒性表型图

红色虚线框内为心脏

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼出现明显的心包水肿。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼出现明显的心包水肿，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有心血管毒性。

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【评价原理】

蛋黄粉中60%为脂类，用蛋黄粉喂食斑马鱼，可以使斑马鱼血液中的脂肪含量快速升高，从而建立斑马鱼高血脂症模型。

经过油红O特异性脂肪染色（与组织内甘油三酯等脂肪滴结合呈橘红色），高血脂斑马鱼血管内肉眼可见明显的脂质聚积，通过静脉注射，可见荧光标记胆固醇的积累。

我们评价斑马鱼降低血脂功效有4个指标：1.斑马鱼血脂表型图；2.斑马鱼总甘油三脂含量；3.斑马鱼胆固醇表型图；4.斑马鱼总胆固醇含量。

【实验方案】

我们先将测试斑马鱼喂食蛋黄粉和荧光标记的胆固醇（蛋黄粉和荧光标记的胆固醇通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内），建立高血脂模型后，再将受测试斑马鱼分成两组，分别是模型对照组和服用降脂剂组，服用降脂组摄入阿托伐他汀钙、辛伐他汀、洛伐他汀之类的降脂剂。

服用一段时间降脂剂后，我们对斑马鱼整体做脂肪特异性染色，观察体内甘油三酯聚积的变化，以及观察体内胆固醇的聚积情况，同时利用甘油三酯和胆固醇试剂盒检测斑马鱼体内甘油三酯和胆固醇含量的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼血脂表型图

橘红色脂滴为血脂

可以看到，服用降脂剂组的血脂聚积情况与模型对照组比较明显减少。

图2. 斑马鱼胆固醇表型图

红色为荧光胆固醇

可以看到，服用降脂剂组的胆固醇荧光强度与模型对照组比较明显减少。

图3. 斑马鱼总胆固醇含量（mmol/gprot）

与模型对照组比较，** p < 0.01

从生化指标可以看出，服用降脂剂组的斑马鱼整体总胆固醇含量与模型对照组比较明显降低。

图4. 斑马鱼甘油三酯含量（mmol/gprot）

与模型对照组比较，*** p < 0.001

从实验结果可以看出，服用降脂剂组的斑马鱼整体甘油三酯含量与模型对照组比较明显降低。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用降脂产品组的血脂聚积情况与模型对照组比较明显减少。

2.本实验证实了阿托伐他汀钙、辛伐他汀、洛伐他汀类降脂产品具有显著的降脂降胆固醇作用。

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