雌激素是一类固醇激素，目前已成为一种新兴的污染物。一些无良商家为片面追求功效而在护肤产品中违规添加，导致很多女性因使用了此类护肤品而出现“激素脸”，表现为面部翻红、发痒、干燥脱皮，甚至烂脸流脓。

环特生物应用诺贝尔奖技术——荧光蛋白基因转移技术，可实现对化妆品中雌激素类化学物质的直观、精确和高效的检测评价。

【评价原理】

通过转基因标记表达的绿色荧光蛋白含量来反映雌激素含量，绿色荧光蛋白特异性地在肝脏进行表达，一旦供试品中含有雌激素类化学物质，转基因斑马鱼暴露后肝脏部位会出现特异性绿色荧光，可用绿色荧光量化供试品中的雌激素含量，从而达到评价效果。

【实验方案】

我们将受试的斑马鱼分为两组，分别为正常对照组和供试品组。在相同的温、湿度条件下培育一段时间后，在显微镜下对肝脏部位的绿色荧光进行量化分析。

【结果展示】

 图1. 雌激素处理后斑马鱼荧光表型图

可以看到，用供试品处理后的斑马鱼在肝脏部位显示明显的绿色荧光。

【评价结论】

1、经过各组斑马鱼的对比实验，雌激素处理组斑马鱼的肝脏部位出现明显的绿色荧光，与正常对照组存在明显的差别；

2、本实验说明供试品中存在雌激素类有害物质。

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【评价原理】

斑马鱼肾脏的肾小球具有与高等脊椎动物肾脏同样的细胞组成，同样的血液滤过、肾小管重吸收功能，一旦肾功能损伤或缺失，斑马鱼就会因无法调节渗透压而产生严重的水肿，同时可能导致肾小球滤过功能下降。

因此，我们可以用两种方法评价肾脏毒性：1. 肾性水肿发生率。由于斑马鱼通体透明，肾性水肿可以明显的被观察到。2. 肾小球滤过率。我们可以对斑马鱼注射一种荧光标记物，一段时间后，正常斑马鱼可将荧光标记物排出体外，而肾小球滤过功能损伤的斑马鱼则不能，通过荧光标记物排泄的情况可以反应斑马鱼肾脏的功能。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼表型进行观察评价，统计肾性水肿发生情况

【结果展示】

图1. 斑马鱼肾脏毒性表型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼出现了明显的肾性水肿的表型。

图2. 斑马鱼肾小球滤过率典型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼荧光强度明显强于正常对照组，标记物排泄明显减少，肾小球滤过率下降，肾脏功能受损。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼有明显的肾性水肿和肾小球滤过率明显下降，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验说明该供试品对斑马鱼有肾脏毒性。

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【评价原理】

免疫毒性是指化合物对机体免疫系统的损伤作用，包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反应性过度增强，可能包括免疫性产生，过敏反应（超敏反应或变态反应）、自身免疫反应以及不良免疫刺激等。

斑马鱼具有先天免疫系统和获得性免疫系统，与果蝇和线虫模型相比，斑马鱼的免疫系统发育的更完整。研究证实斑马鱼与哺乳动物一样，具有T细胞、B细胞、自然杀伤细胞，其免疫系统对于环境中的免疫毒性物质（包括哺乳动物）非常的敏感。

免疫毒性指标有3个：（1）应用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，观察中性粒细胞数量；（2）应用转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，观察巨噬细胞数量（荧光强度）；（3）注射红色荧光微球，巨噬细胞吞噬微球排出体外，用体内微球的数量反映巨噬细胞吞噬功能。（4）检测T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成二组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，我们对斑马鱼检测中性粒细胞和巨噬细胞计数、巨噬细胞吞噬功能和T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【结果展示】

（1）中性粒细胞数量 

图1. 斑马鱼中性粒细胞表型图

绿色小点为中性粒细胞

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内中性粒细胞数量比正常对照组明显减少。

（2）巨噬细胞数量

图2. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内巨噬细胞数量比正常对照组明显减少。

（3）巨噬细胞吞噬功能

图3. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组的吞噬颗粒的巨噬细胞数量与正常对照组比较有明显减少，说明巨噬细胞吞噬功能下降。

（4）T/B相关基因表达（rag1和rag2）

图4. 斑马鱼rag1和rag2表达

左图为rag1基因相对表达量，右图为rag2基因相对表达量

可以看到，服用供试品组的rag1和rag2相对表达量与正常对照组比较均有减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的中性粒细胞和巨噬细胞数量与正常对照组比较均有减少，其巨噬细胞吞噬功能有所下降，且rag1和rag2相对表达量减少。

2.本实验证实了该供试品具有免疫毒性。

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过敏反应通常会引起许多皮肤症状，比如皮肤发红、发痒，严重的患者还会出现刺痛或者面部出现红斑、风团、丘疹或丘疱疹等症状。敏感性肌肤的人群选用化妆品时，需要特别关注化妆品的致敏性。通过斑马鱼技术可以有效评价化妆品及其原料的致敏性。

【评价原理】

过敏反应的主要原因是过敏原/致敏因子诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放多种活性介质进而诱发各种过敏症状。其中类胰蛋白酶是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是临床上检验人体是否过敏的重要指标。斑马鱼产生过敏反应时，同样会诱导肥大细胞分泌类胰蛋白酶。因此，通过检测斑马鱼整体类胰蛋白酶水平可以判断化妆品及其原料的致敏性。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成若干组组，包含正常对照组和化妆品组。其中正常对照组未加入化妆品，化妆品组分别加入不同剂量（化妆品通过溶解到标准稀释水中的方式添加到实验体系中）的样品。

处理24 h后，利用酶标仪检测各组吸光度值（OD值），以类胰蛋白酶的表达水平评价化妆品致敏作用。

此外，可以通过斑马鱼病理切片，用PAS染色后观察肠道壁上肥大细胞的状况反映化妆品的致敏性。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 斑马鱼类胰蛋白酶含量（吸光度值）

与正常对照组比较，*p < 0.05，***p < 0.001

可以看到，化妆品中剂量和高剂量组类胰蛋白酶含量与正常对照组比较明显升高，具有致敏性，低剂量组无致敏性。

图2. 斑马鱼体内肥大细胞染色典型图（箭头指示为肥大细胞）

从经过PAS染色的病理切片中也能看出来，化妆品组斑马鱼的肠道壁上的肥大细胞与正常对照组相比数量明显增加。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，化妆品中、高剂量组斑马鱼类胰蛋白酶含量和肠道壁上的肥大细胞数量与正常对照组相比数量明显增加。

2.本实验证实了该化妆品具有明显的致敏作用。

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【评价原理】

斑马鱼的胃肠道在细胞功能和解剖学方面均与人类相似，由内皮细胞、结缔组织、外纵肌和环状肌组成。胚胎发育至26～126 hpf( hours post fertilization，受精后小时)，斑马鱼胃肠道的管腔形成并不断生长，形成有功能的肠道上皮。在未喂食情况下，斑马鱼胚胎受精约72 hpf，肠道首次出现不稳定的自发收缩。伴随着发育的进行，第120～144 hpf，斑马鱼大部分的卵黄囊被吸收，肠道自发的蠕动及摄食能力增强。

我们评价斑马鱼胃肠道毒性有2个指标：1.胃肠道形态的变化；2.肠蠕动功能抑制。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。摄入供试品之前提前给予食物，摄入供试品一段时间后，我们观察斑马鱼肠道表型。

服用一段时间供试品后，我们观察胃肠道形态及内容物的情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胃肠道形态表型图

可以看到，服用/注射供试品组可见明显肠褶皱缺失、肠腔异常等。

图2. 斑马鱼肠蠕动功能抑制表型图

可以看到，斑马鱼给予食物后，食物充盈肠道。服用/注射供试品组食物明显多于正常对照组，表明肠蠕动功能被抑制。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼胃肠道形态与正常对照组比较，发生了明显的变化，且肠道蠕动功能被抑制。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有胃肠道毒性。

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【评价原理】

脑出血是指非外伤性脑实质内部血管破裂引发的脑内出血病症，占全部脑卒中的20%～30%，急性期病死率为30%～40%。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 ( HMGCR) 是他汀类药物发挥抑制作用的直接作用点, HMGCR功能被抑制会影响血管的完整性和稳定性，诱发脑出血。由于斑马鱼大脑具有典型脊椎动物脑部形态学特征，血管与神经系统在分子信号通路上与人和哺乳动物的同源性达到85%以上。在大量摄入辛伐他汀后，斑马鱼脑部也会出现脑出血的情况，患有脑出血的斑马鱼的脑部会出现明显的片状出血，而正常斑马鱼没有；由于脑出血斑马鱼的心搏输出量和血流速度也会降低，利用血流分析仪可明显观察到。脑出血可直接造成反应迟钝、运动功能障碍，可通过行为分析软件观察斑马鱼的行为轨迹。

我们评价斑马鱼脑出血有4个指标：1.脑出血发生率；2.心搏输出量；3. 血流速度；4. 行为学（运动改善）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用脑血管保护剂组。其中正常对照组未摄入辛伐他汀，模型对照组与服用脑血管保护剂组都摄入了等量的辛伐他汀（辛伐他汀通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用脑血管保护剂组在摄入辛伐他汀的同时摄入淫羊藿苷之类的脑血管保护剂。

服用脑血管保护剂一段时间后，我们对斑马鱼脑部出血、心搏输出、血流速度和行为学（运动改善）情况进行观察。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脑出血表型图

黄色虚线区域为脑出血区域

可以看到，服用脑血管保护剂组的斑马鱼头部情况与正常对照组比较相似，没有明显的脑出血现象。

图2. 斑马鱼心搏输出量

与模型对照组比较，*** p< 0.001

可以看到，服用脑血管保护剂组的斑马鱼心搏输出量与模型对照组比较明显增加。

图3. 斑马鱼血流速度

与模型对照组比较，*** p< 0.001

可以看到，服用脑血管保护剂组的斑马鱼血流速度与模型对照组比较明显增加。

图4 .斑马鱼运动轨迹图

（黑线：斑马鱼慢速运动轨迹；绿线：中速运动；红线：快速运动）

可以看到，模型对照组斑马鱼总运动距离较正常对照组明显减少，而服用脑血管保护剂组斑马鱼运动功能得到明显改善。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用脑血管保护剂组的斑马鱼脑部情况与未摄入辛伐他汀的正常对照组相似，并未出现模型对照组明显的脑出血的情况；服用脑血管保护剂组的与模型对照组比较，心搏输出量明显增多、血流速度明显加快、运动功能得到明显改善。

2.本实验证实了淫羊藿苷具有显著的防治脑出血作用。

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服务项目

环特CRISPR/Cas9基因编辑技术，可构建转基因、基因敲除（KO）、基因敲入（KI）、点突变（PM）等各类基因编辑小鼠模型，为客户提供现大小鼠模型定制、联合研发等服务。

找大小鼠基因编辑公司，选环特生物，一站式大小鼠基因编辑服务！

大小鼠基因编辑定制流程图：

技术介绍

Cas9/gRNA复合物在靶位点进行切割，产生双链断裂，迫使细胞进行紧急修复。通常条件下，细胞偏向于使用非同源末端连接的方式对断裂的双链进行修复，进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。CRISPR/Cas9技术采用独特的受精卵处理方式让受精卵偏好同源重组修复路径，大大提高同源重组效率，使得DNA大片段敲入（KI）及条件性敲除（CKO）得以实现。

四大优势

● 周期短，效率高； ● 高嵌合率，生殖遗传稳定； ● 可实现DNA大片段敲入； ● 可实现条件性敲除。

服务流程和周期：

基因敲除小鼠模型构建

完全性基因敲除小鼠

通过CRISPR /Cas9基因敲除技术，针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。

CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。

条件性基因敲除小鼠

通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个floxed小鼠。该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，该基因表达正常；当floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因，而在其它组织或细胞中该基因表达正常。

▲小鼠基因敲除（Cas9-KO）方案图

基因敲入小鼠模型构建

利用CRISPR/Cas9基因敲入技术，针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector，通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达；也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生。

▲小鼠基因敲入（Cas9-KO）方案图

CRISPR/Cas9基因敲入小鼠包括：点突变、片段基因敲入。

▲点突变（Cas9-PM）方案图

转基因小鼠模型构建

制作转基因大小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。DNA原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。 

四大优势

● 更高的整合效率和目的基因表达概率； ● 更大的目的片段的插入； ● 更“精确”拷贝数的插入； ● 可自由移除插入片段。

服务流程和周期

质粒或BAC载体构建（2~3周）→ 原核显微注射：大小鼠（3周）→ 大小鼠的鉴定（1~2周）。

建立转基因大小鼠品系系原则与流程

1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不 同的首代转基因鼠中也不同。因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中 一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。

2、 原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。

3、 F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。

4、 对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。

转基因小鼠类型

● 过表达转基因小鼠； ● RNAi转基因小鼠； ● microRNA转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠。

全新基因编辑Immediate-Phenotype技术

全新基因编辑Immediate-Phenotype技术可实现三个月内拿到超过100只有表型小鼠，并可得到靶标基因所带来的表型变化，同时实现长达50KB片段基因编辑。

目前我们可实现基因敲除 、基因敲入和点突变的Immediate-Phenotype，尤其是点突变技术在遗传性疾病发现和疾病研究上有重大意义，可快速实现罕见病的定性。

在商业价值上，可实现生产成本和时间成本大幅降低。

 服 务 咨 询 

更详细的基因编辑服务内容，请拨电话咨询：0571-83782130，手机 17364531293（微信同号）。

环特拥有实验动物生产和使用许可证，已通过CNAS、CMA、AAALAC认证，自有8500m²动物试验实验室。

【评价原理】

斑马鱼皮肤结构与功能与人类高度相似，斑马鱼皮肤含有基底层、棘层、颗粒层、透明层和表皮角质细胞层；另外尚有与人皮肤结构相同的固有层、半桥粒、黑色素细胞、血管和皮下脂肪细胞等。斑马鱼皮肤间质结缔组织、胶原及其临近的纤维母细胞及皮肤基因表达亦与人类皮肤相似。

我们评价斑马鱼皮肤肌肉毒性有4个指标：1.皮肤刺激；2.肌肉纹理；3.皮肤凋亡细胞定量；4.皮肤色素变化。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。

皮肤吸收供试品一段时间后，我们通过中性粒转基因荧光斑马鱼，观察皮肤/肌肉刺激性；通过表型拍照，观察肌肉纹理及皮肤色素变化；通过AO染色凋亡细胞，观察皮肤细胞凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼皮肤刺激性典型图片

可以看到，供试品组皮肤/肌肉可见明显中性粒细胞聚集。

图2. 斑马鱼皮肤损伤典型图片

可以看到，供试品组可见明显肌肉纹理不清晰。

图3. 斑马鱼凋亡细胞表型图

可以看到，供试品组尾部可见明显凋亡（绿色荧光亮点）。

图4. 斑马鱼皮肤色素异常表型图

可以看到，供试品组躯干可见明显色素异常（黄色虚线区域）。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，供试品组的斑马鱼皮肤肌肉产生明显的毒性表型（包括肌肉纹理异常和色素异常），在斑马鱼尾部可见明显的凋亡细胞，在躯干部可见明显的中性粒细胞聚集。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有皮肤肌肉毒性。

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【评价原理】

斑马鱼胚胎在母体外发育，从合子期到孵化期仅72小时，且发育的完整过程均是透明的，利于实时观察和检测。斑马鱼幼鱼长3~4毫米，拥有6-384孔板的高通量检测体系，可实现低费-高效筛选。斑马鱼与人类基因同源性达到87%，用于药物的体内快速评价实验结果可比性强。故可以利用斑马鱼早期各个阶段的发育形态，准确高效的确定药物暴露在胚胎中的毒性，广泛应用于药物的发育毒性与致畸性研究。

实验结束后，以各浓度组织器官反应及死亡情况的统计学分析结果评价药物对斑马鱼的毒性，并对典型毒性器官进行拍照。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和药物组。其中正常对照组未摄入待测药物，药物组按照既定浓度摄入了不同浓度的待测药物（待测药物通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

在药物暴露过程中，每天观察记录各个浓度组斑马鱼的死亡情况，并及时挑走死鱼。实验结束后，统计斑马鱼死亡情况并使用OriginPro 8软件拟合数据曲线，获得药物的最大非致死浓度（MNLC）和LC10。

在药物暴露一段时间后，我们在显微镜下观察记录斑马鱼身体各个指标的情况并对典型毒性器官进行拍照。

【结果展示】

图1. 斑马鱼发最大非致死浓度（MNLC）和LC10摸索数据拟合图

可以看到，该药物的MNLC为313 μg/mL，LC10为350 μg/mL。

图2. 斑马鱼发育毒性与致畸性表型图

H=Heart;J=Jaw;In=Intestinal tract;L=Liver;Y=Yolk sac;E=Eye

可以看到，药物组较正常对照组出现卵黄囊吸收延迟、心包水肿、体长变短、眼变小和肝变形。

【评价结论】

1.该药物的MNLC为313 μg/mL，LC10为350 μg/mL，诱发斑马鱼卵黄囊吸收延迟、心包水肿、体长变短、眼变小和肝变形。

2.本实验证实了该药物对斑马鱼有发育毒性与致畸性风险。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。高血脂患者由于血液中胆固醇、油脂含量过多，就会使过多油脂沉积于血管壁上，容易使动脉管壁增厚、变硬、失去弹性，导致动脉硬化。斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖脂负荷状态下表现出持续高血糖、高血脂现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病。

用转基因绿色血管荧光斑马鱼（呈绿色），患有高糖高脂的斑马鱼眼部血管壁厚度较正常斑马鱼明显增厚，在共聚焦显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖降脂产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖降脂产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖降脂产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖降脂产品。

服用一段时间降糖降脂产品后，我们用共聚焦显微镜下观察斑马鱼眼部血管壁厚度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼眼部血管壁厚度

白色箭头所指为血管壁

可以看到，模型对照组的眼部血管壁厚度较正常对照组明显增厚，而降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近，并未出现模型对照组眼部血管壁增厚的情况。

2.本实验证实了松花蛹虫草具有眼部血管壁厚度增厚改善功效。

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