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【评价原理】
药物骨毒性的安全性研究与肝、肾、心脏毒性等一般毒性相比较为薄弱，尤其是儿科人群用药的骨毒性安全问题，骨毒性非临床安全性评价愈加受到重视。斑马鱼是一种与人类同源性较高的脊椎动物，和哺乳动物一样，斑马鱼的骨骼是从3种胚胎干细胞系即神经嵴、体节中胚层和侧板发育而来的。
斑马鱼骨骼经过特异性的荧光染色后，经荧光显微镜采集到荧光强度能反映出骨密度和脊椎骨的数量，从而评价供试品骨毒性。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。
服用/注射供试品一段时间后，我们对斑马鱼整体做骨钙染色，以脊椎骨荧光强度和脊椎骨数量评价供试品的骨毒性。
【结果展示】
图1. 斑马鱼骨密度表型图
黄色虚线区域为计算用脊椎骨
可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼脊椎骨荧光强度明显减弱。
图2. 斑马鱼脊椎骨数量表型图
可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼脊椎骨数量明显减少。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼脊椎骨荧光强度明显减弱、数量明显减少，与正常对照组存在明显的差别。
2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有骨毒性。
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【评价原理】
贫血是指人体外周血红细胞容量减少，低于正常范围下限的一种常见的临床症状。斑马鱼造血系统的形成，包括红系、髓系、淋系及巨核系为主的造血系统，其相关的转录因子及信号转导通路同人类有高度的同源性，这些特点使斑马鱼在人类造血系统和血液疾病的研究中有着更加广泛的应用。由于斑马鱼早期出现血液循环时胚胎透明，可通过染色剂在显微镜直接观察心脏红细胞的数量。
苯肼导致红细胞外翻和氧化应激产生，红细胞外翻能够引起血细胞聚集，氧化应激产生导致内皮细胞损伤，进而导致血小板聚集、纤维蛋白原形成，最终诱导血栓发生。
用特异性红细胞染色剂（呈红色），贫血斑马鱼心脏部位的红细胞较正常斑马鱼明显减少，在解剖显微镜下可以观察到。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用补血药物组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用补血药物组都摄入了等量的苯肼（苯肼通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用补血药物组先摄入生血宁之类的改善贫血药物后再摄入苯肼。
服用改善贫血药物一段时间后，再加入苯肼共同处理一段时间后，我们对斑马鱼整体做红细胞特异性染色，最终分析斑马鱼的红细胞信号强度。
【结果展示】
图1. 斑马鱼贫血表型图
可以看到，模型对照组红细胞信号强度较正常对照组明显减少，服用补血药物组的红细胞信号强度与正常对照组比较相似，没有明显的红细胞减少情况。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用补血药物组的红细胞信号强度与正常对照组相似，并未出现模型对照组红细胞减少的情况。
2.本实验证实了生血宁具有明显改善贫血的功效。
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【评价原理】
过敏原/致敏因子诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放活性介质如组胺、5-HT，前列腺素D、白三烯、血小板活化因子等，表现为平滑肌收缩，毛细血管扩大和通透性增强，腺体分泌物增多等，诱发多种过敏症状。 类胰蛋白酶是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是临床上检验人体是否过敏的重要指标。斑马鱼产生过敏反应时，亦诱导肥大细胞分泌类胰蛋白酶。C48/80作为肥大细胞活化剂，可以诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放类胰蛋白酶。
我们检测过敏有两种方法。1. 类胰蛋白酶的含量：用酶标仪检测类胰蛋白酶的含量。2. 肥大细胞数量：制作病理切片，经过过碘酸雪夫染色，肥大细胞呈蓝色，肥大细胞释放的组胺和白三烯等物质呈红色。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成四组，分别是正常对照组和滴注致敏剂低、中、高剂量组。其中正常对照组未滴注C48/80，滴注致敏剂组均滴注C48/80低、中、高剂量（C48/80通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。
滴注C48/80一段时间后，利用酶标仪检测类胰蛋白酶含量（吸光度值），同时制作病理切片进行过碘酸雪夫染色。
【结果展示】
图1. 斑马鱼类胰蛋白酶含量（吸光度值）
与正常对照组比较，*p < 0.05，***p < 0.001
可以看到，滴注中、高浓度致敏剂组类胰蛋白酶含量与正常对照组比较明显升高。
图2. 斑马鱼体内肥大细胞染色典型图
箭头指示为肥大细胞
从病理切片中也能看出来，滴注致敏剂组斑马鱼的肥大细胞与正常对照组相比数量明显上升。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，滴注致敏剂组斑马鱼类胰蛋白酶含量和肥大细胞数量与正常对照组相比数量明显上升。
2.本实验证实了C48/80具有明显的致敏作用。
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皮肤微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环。血液循环最根本的功能是进行血液和组织之间的物质交换，皮肤微循环状态与皮肤衰老密切相关。
【评价原理】
转基因血管内皮绿色荧光斑马鱼的节间血管可以在荧光显微镜下被明显地观察到，因而可以通过观察受试物对节间血管直径的影响来评价受试物促进血管新生的功效，进而表征改善微循环功效。此外，可以利用血流分析仪检测受试斑马鱼的血流速度，补充评价改善微循环功效。
【实验方案】
将斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组。正常对照组不做处理，供试品组添加一定浓度的受试化妆品，孵育24h小时后，在荧光显微镜下观察斑马鱼节间血管并拍照保存图片，用高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼节间直径，通过其统计学意义评价供试品改善微循环功效。
此外，通过血流分析仪分析观察各组斑马鱼的血流速度，以血流速度的增加量评价受试化妆品改善微循环功效。
【结果展示】
1、斑马鱼节间血管直径
图4. 供试品改善微循环功效表型图
黄色虚线标记部分为斑马鱼肠下血管，红色箭头所指为出芽数
2、斑马鱼血流速度（提供各组实验柱状图）
图5 斑马鱼血流速度
与模型对照组比较，***p<0.001
【评价结论】
1、经过斑马鱼对比实验，供试品组与正常对照组对比，肠下血管面积增大，出芽数增多，直径变大。
2、与正常对照组相比，化妆品组斑马鱼血流速度明显增大。
3、本实验证实了该化妆品具有改善微循环的功效。
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【评价原理】
斑马鱼与人类生理结构和功能高度相似。斑马鱼消化道的解剖结构和细胞结构与人类消化道相似，具有同心圆层的内上皮、结缔组织、环状肌肉和外纵肌层。因此，可利用斑马鱼模型评价调节胃肠功效。
饲喂特异性的荧光染料（呈红色），在斑马鱼体内荧光染料不被其他组织干扰，且不会被吸收，荧光染料的残留量取决于胃肠道蠕动功能。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是模型对照组和服用胃肠调节剂组。模型对照组与服用胃肠调节剂组都摄入了等量的荧光染料（荧光染料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用胃肠调剂组在摄入荧光染料的之后摄入多潘立酮（吗丁啉）之类的胃肠调节剂。
服用一段时间胃肠调节剂后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼胃肠道荧光强度。
【结果展示】
图1. 斑马鱼胃肠道表型图
可以看到，胃肠调节剂组肠道荧光强度明显比模型对照组弱，说明胃肠调节剂通过促进胃肠道蠕动将荧光染料排出体外。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用胃肠调节剂组的胃肠道荧光情况比模型对照组明显减弱。
2.本实验证实了多潘立酮（吗丁啉）具有明显的胃肠调节功效。
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【评价原理】
斑马鱼心血管系统的发育与人高度相似，虽然斑马鱼是单心房单心室，但其心脏结构及功能与人高度保守。同时，由于斑马鱼具有透明易观察等优点，开始被大量应用于心血管疾病研究和药物心血管毒性评价当中。
羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 ( HMGCR) 是他汀类药物发挥抑制作用的直接作用点, HMGCR功能被抑制会影响血管的完整性和稳定性，诱发心脏出血。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和药物组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用改善心脏出血药物组都摄入了等量的辛伐他汀（辛伐他汀通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。药物组在摄入辛伐他汀的同时摄入淫羊藿苷之类的改善心脏出血药物。
服用改善心脏出血药物一段时间后，我们通过解剖显微镜对斑马鱼进行心脏出血发生率的统计；对斑马鱼进行行为学分析；通过心跳血流分析系统采集斑马鱼血流影像，并分析血流速度改善作用。
【结果展示】
图1. 斑马鱼改善心脏出血表型图
可以看到，模型对照组的斑马鱼心脏有明显的出血，服用改善心脏出血药物组的心脏出血情况与正常对照组比较相似，没有明显的心脏出血。
图2. 斑马鱼运动改善表型图
可以看到，模型对照组的运动距离明显减少，服用改善心脏出血药物组的运动距离与正常对照组比较相似，没有明显的运动减少。
图3. 斑马鱼改善血流柱状图
可以看到，模型组的血流速度明显减慢，服用改善心脏出血药物组的血流速度与模型对照组比较血流速度增加，没有明显的血流速度减慢。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用改善心脏出血药物组的心脏出血情况、运动距离、血流速度均有明显改善作用。
2.本实验证实了淫羊藿苷具有明显改善心脏出血的功效。
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【评价原理】
糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。高血脂患者由于血液中胆固醇、油脂含量过多，就会使过多油脂沉积于血管壁上，容易使动脉管壁增厚、变硬、失去弹性，导致动脉硬化。斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖脂负荷状态下表现出持续高血糖、高血脂现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病。
用转基因绿色血管荧光斑马鱼（呈绿色），患有高糖高脂的斑马鱼眼部血管壁厚度较正常斑马鱼明显增厚，在共聚焦显微镜下可以观察到。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖降脂产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖降脂产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖降脂产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖降脂产品。
服用一段时间降糖降脂产品后，我们用共聚焦显微镜下观察斑马鱼眼部血管壁厚度。
【结果展示】
图1. 斑马鱼眼部血管壁厚度
白色箭头所指为血管壁
可以看到，模型对照组的眼部血管壁厚度较正常对照组明显增厚，而降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近，并未出现模型对照组眼部血管壁增厚的情况。
2.本实验证实了松花蛹虫草具有眼部血管壁厚度增厚改善功效。
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【评价原理】
正常成人的心率在每分钟60～100次之间，如果低于60次称为心动过缓，是心律失常的一个重要类型，患者平时有头晕、乏力、倦怠、精神差的症状。研究表明，斑马鱼心血管系统的发育与人高度相似，虽然斑马鱼是单心房单心室，但其心脏结构及功能与人高度保守。同时，由于斑马鱼具有透明易观察等优点，开始被大量应用于心血管疾病研究和药物心血管毒性评价当中。
维拉帕米能阻滞心肌细胞慢通道，抑制Ca2+向细胞的内流，阻碍心脏慢反应电活动，降低舒张期去极化速度，抑制窦房结的自律性，减慢心率；亦能延长房室结的有效不应期，减慢房室传导。
用解剖显微镜下观察斑马鱼心率，模型对照组斑马鱼心率较正常斑马鱼明显减慢。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和药物组。其中正常对照组未摄入维拉帕米，模型对照组与药物组都摄入了等量的维拉帕米（维拉帕米通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。药物组先摄入地高辛之类的改善心动过缓药物再摄入维拉帕米。
服用改善心动过缓药物后再加入维拉帕米共同处理至实验终点后，我们对斑马鱼统计斑马鱼的心率。
【结果展示】
图1. 斑马鱼心动过缓柱状图
可以看到，模型对照组心率明显减慢，服用药物组的心率与正常对照组比较相似，没有明显的心率减慢。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用改善心动过缓药物组的心率相较于模型对照组。
2.本实验证实了地高辛具有明显改善心动过缓的功效。
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【评价原理】
甲萘醌是一种氧化剂，通过细胞内还原酶系统（微粒体的P450还原酶和线粒体的呼吸链还原酶），产生不稳定的半醌，进入氧化还原循环，产生活性氧族。用甲萘醌可诱导斑马鱼建立氧化应激模型。
经过特异性荧光染色（呈绿色，主要定位于细胞核和线粒体），发生氧化应激反应斑马鱼全身明显比正常斑马鱼绿很多，可以用荧光显微镜下观察到斑马鱼体内的活性氧含量。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和抗氧化剂组。其中正常对照组未摄入甲萘醌，模型对照组与抗氧化剂组都摄入了等量的甲萘醌（甲萘醌通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。抗氧化剂组在摄入甲萘醌之后摄入还原型谷胱甘肽之类的抗氧化剂。
服用一定时间抗氧化剂后，我们对斑马鱼整体做活性氧染色，观察整体绿色荧光强度的变化。
【结果展示】
图1. 斑马鱼活性氧表型图
绿色荧光为活性氧
可以看到，抗氧化剂组的荧光强度较正常对照组强，但较模型对照组明显减弱。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗氧化剂组的荧光强度比模型对照组弱。
2.本实验证实了还原型谷胱甘肽具有明显抗氧化功效。
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