【评价原理】

斑马鱼为鲤科短担尼鱼属的小型硬骨鱼，1998年国际经济合作与发展组织将斑马鱼胚胎发育方法列入测定单一化学品毒性的标准方法。由于斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，近年来斑马鱼被广泛应用于人类疾病模型及药物筛选、毒理学与环境检测中，使其成为新型的脊椎模式生物。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或胚胎注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体进行观察评价，观察斑马鱼心脏、脑部、耳、下颌、眼、肝脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、鳍、体长、身体着色、循环系统、身体水肿和出血等毒性反应情况，统计毒性发生率。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胚胎毒性表型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼眼变小、心包水肿、肝脏变性、卵黄囊吸收延迟、胃肠道发育延迟。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的组织器官产生明显的毒性表型，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有胚胎毒性。

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类器官冻存液可应用于多种哺乳动物（如人、鼠、猪、蝙蝠、牛等）来源的类器官和细胞系的低温长期保存，该冻存液不含血清，不含任何动物来源成分，含有 10% DMSO。

【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位处，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。内毒素（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，我们将其注射到斑马鱼卵黄囊，诱导炎症介质的产生。斑马鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在卵黄囊。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到斑马鱼卵黄囊的中性粒细胞比正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎组。其中正常对照组未注射LPS，模型对照组和抗炎组均注射LPS（LPS通过注射到卵黄囊的方式摄入到斑马鱼体内）。抗炎药组在注射LPS之前摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为卵黄囊，绿色颗粒为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组卵黄囊内中性粒细胞比模型对照组明显，未出现中性粒细胞大量募集情况。

以IL-6、IL-10基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼IL-6基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-6基因表达明显下调。

图3. 斑马鱼IL-10基因相对表达量

与模型对照组比较，***p < 0.001

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-10基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射抗炎药组卵黄囊内中性粒细胞数量比正常对照组略多，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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【评价原理】

Caspase家族在细胞凋亡的调控上起着重要的作用。Caspase分为三大类：凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎症介导因子。凋亡启动因子在级联反应的上游，包括（Caspase-8和Caspase-9）等，能识别和激活下游的Caspase。Caspase-9参与线粒体途径介导的细胞凋亡。凋亡执行因子在级联反应的下游，包括Caspase-3和Caspase-7等，作用于其特异性底物并导致细胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中的，最重要的凋亡执行者之一，大多数引发细胞凋亡的因素，最终均需要通过caspase-3介导的信号传递途径，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志。

我们评价斑马鱼对caspase的诱导作用有3个指标：1.对caspase 3的诱导作用；2.对caspase 8的诱导作用；3.对caspase 9的诱导作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和供服用/注射试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，利用特异性试剂盒检测斑马鱼体内caspase的活性。

【结果展示】

图1. 斑马鱼caspase3活性

与正常对照组比较，*** p < 0.001

图2. 斑马鱼caspase8活性

与正常对照组比较，*** p < 0.001

图3. 斑马鱼caspase9活性

与正常对照组比较，*** p < 0.001

可以看到，服用/注射供试品组与正常对照组比较caspase活性明显上升。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼caspase活性明显上升，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼caspase有诱导作用。

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【评价原理】

斑马鱼胃肠道粘膜屏障系统由较完整的机械屏障、化学屏障和免疫屏障构成，与哺乳动物高度相似，可作为胃肠道粘膜屏障研究的动物模型。三硝基苯磺酸（TNBS）可破坏肠道粘膜屏障，与肠组织蛋白结合形成抗原，发生变态反应，诱发结肠炎。杯状细胞主要分泌黏蛋白，形成黏膜屏障以保护上皮细胞，肠黏膜损伤时杯状细胞数量减少。我们可以应用特异性的染料（呈蓝色），观察肠道杯状细胞数目，评价肠道粘液分泌功能。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用肠道粘膜辅助保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用肠道粘膜辅助保护剂组都摄入了等量的TNBS（TNBS通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用肠道粘膜辅助保护剂组在TNBS诱导肠道粘膜损伤之后摄入常欣卫口服液之类的肠道粘膜辅助保护剂。

服用一段时间肠道粘膜辅助保护剂后，我们观察和分析肠道杯状细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肠道杯状细胞表型图

可以看到，服用肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

2.本实验证实了常欣卫口服液具有明显的促肠道粘液分泌功能。

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【评价原理】

OECD近年大力推崇的“有害结局路径”（Adverse Outcome Pathway，AOP）毒性评估策略来测试类雌激素这一大类有害物质。本方法参照粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO，2000）关于类雌激素物质最高日摄取量来评估测试物的安全性，通过转基因标记技术表达的绿色荧光蛋白含量来量化类雌激素物质含量，绿色荧光蛋白特异性地在肝脏表达，一旦供试品中含一定量的类雌激素化学物质，雌激素转基因斑马鱼暴露后肝脏部位会出现绿色荧光，可用绿色荧光量化供试品中的类雌激素物质含量，从而达到检测效果。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

摄入供试品一段时间后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼肝脏荧光。

【结果展示】

图1.含类雌激素物质的供试品处理后斑马鱼荧光表型图

黄色曲线部位为肝脏，绿色荧光量化类雌激素含量

可以看到，摄入供试品组肝脏部位有明显的绿色荧光。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，摄入含类雌激素物质的供试品组斑马鱼肝脏荧光明显，与正常对照组存在明显差别。

2.本实验证实了该供试品含有类雌激素物质。

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【评价原理】

近三十年来，世界癌症发病率以年均3-5%的速度递增，癌症已成为人类第一位死因。肿瘤移植模型为快速筛选抗肿瘤药物提供巨大帮助。斑马鱼在早期仅有非特异性免疫，不具备完善的特异性免疫，对人肿瘤细胞不存在排斥反应。因此，斑马鱼可直接接种人肿瘤细胞来筛选广谱抗肿瘤药物。另外，斑马鱼与人肿瘤发生、发展相关的（凋亡、VEGF、Wnt、ALK等）信号通路上相似，可用于筛选靶向抗肿瘤药物。

1.肿瘤生长、转移

将荧光标记的人肿瘤细胞（呈红色）移植到野生型斑马鱼体内，肿瘤细胞在斑马鱼体内的生长和转移情况可以被观察到。

2.肿瘤部位新生血管

将荧光标记的人肿瘤细胞（呈红色）移植到转基因血管荧光斑马鱼（呈绿色）体内，肿瘤细胞刺激斑马鱼新生血管情况可以被观察到。

3.肿瘤细胞凋亡

将人肿瘤细胞移植到野生型斑马鱼体内，通过特异性荧光染色（凋亡细胞呈绿色），细胞凋亡情况可以被观察到。

4.肿瘤部位炎症

将人肿瘤细胞移植到转基因中性粒细胞荧光斑马鱼（呈绿色）体内，肿瘤部位炎症反应可以被观察到。

5.肿瘤病理

将人肿瘤细胞移植到野生型斑马鱼体内，制作成病理切片，观察肿瘤细胞的形态变化。

6.生存期

将人肿瘤细胞移植到野生型斑马鱼体内，统计斑马鱼每日存活率、计算其生存期。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品组。正常对照组不注射人肿瘤细胞，模型对照组与服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品组都注射了等量的荧光标记的人肿瘤细胞。服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品组注射等量的荧光标记的人肿瘤细胞后，摄入抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品。

服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品数天后，我们对斑马鱼进行图像采集，观察肿瘤细胞的生长和转移情况、细胞凋亡情况、炎症反应情况以及形态变化，同时计算其生存期。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肿瘤生长表型图

红色部分为荧光标记的人肿瘤细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组的肿瘤细胞数量相比模型对照组明显减少。

图2. 斑马鱼肿瘤转移距离表型图

绿色为斑马鱼血管，红色颗粒为荧光标记的人肿瘤细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组的肿瘤转移距离相比模型对照组明显减少。

图3. 斑马鱼肿瘤部位新生血管表型图

绿色为血管，红色颗粒为人肿瘤细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组的血管结构与正常对照组比较相似，未出现模型对照组血管增多、增粗、紊乱、出芽的情况。

图4. 斑马鱼肿瘤部位细胞凋亡表型图

绿色为凋亡细胞，红色颗粒为人肿瘤细胞

可以看到，正常对照组未出现凋亡细胞，模型对照组一些凋亡细胞，服用抗肿瘤药组的出现大量的凋亡细胞。

图5. 斑马鱼肿瘤部位中性粒细胞表型图

绿色颗粒为中性粒细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组斑马鱼肿瘤部位中性粒细胞较少，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况。

图6. 斑马鱼肿瘤病理切片

绿色箭头指向人肿瘤细胞

可以看到，正常对照组斑马鱼腹腔内没有肿瘤细胞，模型对照组斑马鱼腹腔内可见较多的肿瘤细胞，肿瘤细胞多形性、核浆比增大、出现病理性核分裂。抗肿瘤药组斑马鱼腹腔内仅见少量肿瘤细胞，肿瘤细胞体积增大、核浆比增大。

图7. 斑马鱼生存期展示图

可以看到，服用抗肿瘤药组生存期与正常对照组斑马鱼相似，未出现模型对照组生存期明显缩短的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗肿瘤药组的肿瘤细胞数量、转移距离、新生血管数量较模型对照组明显减少；抗肿瘤药组肿瘤部位凋亡细胞较模型对照组明显增加；抗肿瘤药组肿瘤细胞形态较接近正常对照组。

2.经过每组60尾斑马鱼的对比实验，抗肿瘤药组斑马鱼生存期较模型对照组明显延长。

3.本实验证实了顺铂、康莱特、沙利度胺等抗肿瘤药具有显著的抗肿瘤作用。

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【评价原理】

斑马鱼成鱼体长5 cm左右，其胚胎透明，在受精72 h后完成孵化，并在孵出后3个月内性成熟。成年斑马鱼的繁殖周期短(一般7 d左右)，若条件适宜，成年雌性斑马鱼可定期产卵(每次200～300个)。在斑马鱼的早期胚胎及幼体的发育过程中，尚无性别分化，原始性腺都是相同的且具有双向发育的潜能，易受环境(温度、光照、pH值等)因素的影响而改变其遗传性别。

对于雌性斑马鱼而言，产卵量是评价其繁殖力的常用生物指标，它与鱼类繁殖过程中的多个环节（卵子发育、雌雄交配行为、性激素刺激等）相关，并对环境化学物质具有高敏感性，能直接反应鱼类繁殖力变化。环境化学物质除了直接对亲代斑马鱼的生殖系统造成损害，还可能对其子代的正常生长发育。

卵黄蛋白原在斑马鱼雌鱼成熟过程中发挥重要作用，成熟雌鱼在体内17β-雌二醇的刺激下，由肝脏合成的VTG经过血液到达卵巢并加工成卵黄蛋白，促进性腺发育。幼鱼和雄鱼在正常情况下不合成VTG,但在受到雌激素和类雌激素刺激时能合成VTG，导致鱼体内VTG浓度升高，出现雌性体征。

鱼类的性腺发育和繁殖行为受到下丘脑-垂体-性腺轴（HPG 轴）的调控。下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），其作用于脑垂体，刺激其分泌促黄体生成素（LH）和促卵泡素（FSH），这两种激素通过血液循环与相应的受体结合后作用于性腺，刺激性腺产生睾酮（T）、17β-雌二醇（E2）和 11-酮基睾酮（11-KT） 等类固醇激素，进而促进精子和卵子的发育和成熟。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，进行21天的暴露实验，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间供试品后，观察每次的产卵量、受精率及孵化率；对受精卵进行子一代发育毒性与致畸性评价。在实验终点取斑马鱼的组织，检测卵黄蛋白原（VTG）含量及相关基因表达，并对性腺进行病理组织学检查，指标主要包括：睾丸卵母细胞、睾丸间质细胞增生、卵黄形成减少、精原细胞和滤泡增生；其他性腺损伤包括：卵母细胞闭锁、睾丸变性和分期改变。

【结果展示】

图1. 供试品对斑马鱼体内卵黄蛋白原（VTG）的影响

可以看到，供试品组VTG有下降趋势，但与正常对照组比较没有显著性差异。

图2. 斑马鱼发育毒性与致畸性表型图

可以看到，供试品组斑马鱼诱发眼睛变小，下颌异常，心血管毒性等。

图3. 斑马鱼性腺病理切片

可以看到，供试品组斑马鱼精巢精子量变少，卵巢中卵母细胞体积变小、数量减少 。

图4. 供试品对斑马鱼基因表达的影响

可以看到，供试品组FSHβ、LHβ基因相较于正常对照组显著表达。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，摄入供试品组的斑马鱼体内VTG有下降趋势，子一代斑马鱼有致畸性，性腺病理切片有不同程度的异常，与性腺发育和繁殖行为相关基因的上调。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有生殖毒性。

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【评价原理】

酒精进入人体后90%进入肝脏进行代谢，长期过量饮酒诱发酒精性脂肪肝，临床表现为肝脏受脂肪浸润。由于斑马鱼拥有与人类相似的消化系统，如肝脏、肠道等，消化和营养的吸收及运输与人类高度相似，在大量摄入酒精后，肝脏也会出现脂肪变性（酒精性脂肪肝）的情况。

经过脂肪特异性染色（呈红色），患有酒精性脂肪肝的斑马鱼的肝脏会明显比正常斑马鱼的肝脏要红很多，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用解酒剂组。其中正常对照组未摄入酒精，模型对照组与服用解酒剂组都摄入了等量的酒精（酒精通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用解酒剂组在摄入酒精的同时摄入RU21、海王金樽之类的解酒剂。

服用一定时间解酒剂后，我们对斑马鱼整体做脂肪特异性染色，观察肝脏的脂肪变化，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼酒精性脂肪肝表型图

黄色虚线区域为肝脏，肝脏内红色代表脂肪

可以看到，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组比较相似，没有明显的脂肪沉积。

图2. 肝脏病理切片

黄色箭头指向脂肪颗粒

从病理切片中也能看出来，酒精性脂肪肝斑马鱼的肝脏有很多脂肪颗粒，而服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组都没有出现类似的脂肪颗粒。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组相似，并未出现模型对照组的出现大量脂肪颗粒（酒精性脂肪肝）的情况。

2.本实验证实了RU21、海王金樽解酒剂具有疏肝解酒（酒精性脂肪肝防治）功效。

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【评价原理】

酒精进入人体后90%进入肝脏进行代谢，长期过量饮酒诱发酒精性脂肪肝，临床表现为肝脏受脂肪浸润。由于斑马鱼拥有与人类相似的消化系统，如肝脏、肠道等，消化和营养的吸收及运输与人类高度相似，在大量摄入酒精后，肝脏也会出现脂肪变性（酒精性脂肪肝）的情况。

经过脂肪特异性染色（呈红色），患有酒精性脂肪肝的斑马鱼的肝脏会明显比正常斑马鱼的肝脏要红很多，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用解酒剂组。其中正常对照组未摄入酒精，模型对照组与服用解酒剂组都摄入了等量的酒精（酒精通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用解酒剂组在摄入酒精的同时摄入RU21、海王金樽之类的解酒剂。

服用一定时间解酒剂后，我们对斑马鱼整体做脂肪特异性染色，观察肝脏的脂肪变化，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼酒精性脂肪肝表型图

黄色虚线区域为肝脏，肝脏内红色代表脂肪

可以看到，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组比较相似，没有明显的脂肪沉积。

图2. 肝脏病理切片

黄色箭头指向脂肪颗粒

从病理切片中也能看出来，酒精性脂肪肝斑马鱼的肝脏有很多脂肪颗粒，而服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组都没有出现类似的脂肪颗粒。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组相似，并未出现模型对照组的出现大量脂肪颗粒（酒精性脂肪肝）的情况。

2.本实验证实了RU21、海王金樽解酒剂具有疏肝解酒（酒精性脂肪肝防治）功效。

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