【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。持续的高血糖水平导致糖尿病并发症发生，高血糖累及中枢和周围神经病变，出现神经炎症。感觉神经受损较为多见，出现麻木、触电、发热、蚁行感，运动神经受损则出现肌力下降。斑马鱼胰腺的形态发生和基本细胞结构、排列方式类似于哺乳动物，斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖负荷状态下表现出持续高血糖现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病的神经并发症。

用中性粒细胞荧光与运动神经荧光杂交品系斑马鱼（呈绿色），患有高血糖的斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目增多，在荧光显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖产品。

服用一段时间降糖产品后，我们用荧光显微镜观察斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目

黄色框线内绿色荧光点代表中性粒细胞

可以看到，模型对照组的周围运动神经中性粒细胞数目较正常对照组明显增多，而降糖产品组斑马鱼明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖产品组斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目与模型对照组比较明显减少。

2.本实验证实了松花蛹虫草之类的降糖产品具有神经炎症消退功效。

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人小肠类器官培养试剂盒是一种用于构建、维持和扩增人小肠类器官的细胞培养基，即买即用。本产品由我司自主研发，不含血清，成分明确。

【评价原理】

由于硬骨鱼和人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，而且与其他的动物模型相比，斑马鱼具有个体小适合高通量化学筛选、幼鱼身体透明易于观察骨骼发育的特点，所以近年来以斑马鱼为模型的骨骼研究逐渐成为这一领域的热点。斑马鱼从前向后的脊椎发育过程是非连续的，而是分成两个不同的区域：前域（包括前3块椎骨）和后域（包括第4-31块椎骨）。将斑马鱼脊椎骨钙化过程分成两个不同区域是基于第2和第3椎骨的出现晚于第4椎骨。我们利用斑马鱼骨骼发育的规律，摄入生长发育促进剂的斑马鱼脊椎骨发育会加快。

脊椎骨染色应用与钙特异性结合的荧光染料（呈绿色），经荧光显微镜观察脊椎骨的数量。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用生长发育促进剂组（维生素D3、碳酸钙之类的生长发育促进剂通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间生长发育促进剂后，我们对斑马鱼做骨骼特异性荧光染色，观察斑马鱼脊椎骨的发育情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脊椎骨荧光图

黄色虚线区域为定量的脊椎骨

可以看到，服用生长发育促进剂的脊椎骨数量明显比正常对照组增多。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用生长发育促进剂的斑马鱼脊椎骨数量比正常对照组增多。

2.本实验证实了维生素D3、碳酸钙具有明显促进生长发育功效。

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【评价原理】

泼尼松是糖皮质激素的一种常用制剂，糖皮质激素由于其抗炎和免疫抑制作用，在临床上得到广泛运用。皮质类固醇治疗过程中引起骨保护素(OPG)与核因子KB受体激活因子(RANK)配体(RANKL)之间的比例发生改变，导致在前3～6个月时骨吸收增加，使其发生骨质疏松并增加骨折的风险的不良反应。钙黄绿素是一种特异性的荧光染料，可与钙化的骨结构进行特异性结合。故在实验终点，用钙黄绿素工作液对斑马鱼进行染色，并置于荧光显微镜下观察，可观察到骨质疏松的斑马鱼脊椎骨荧光强度，比正常对照组斑马鱼弱很多。

我们评价骨质疏松症有2个指标：1. 骨形态发生蛋白（BMP）表达水平；2. 骨密度（荧光信号强度）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和增加骨密度药物组。其中正常对照组未加泼尼松，模型对照组与增加骨密度药物组都加入了等量的泼尼松（泼尼松通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用治疗骨质疏松药物组在加入泼尼松的同时加入依替膦酸二钠、特立帕肽之类的治疗骨质疏松的药物。服用药物后一段时间后，在显微镜下观察斑马鱼脊椎骨荧光强度同时测定基因的表达量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脊椎骨荧光表型图

框内为定量的脊椎骨

可以看到，服用治疗骨质疏松药物组的斑马鱼脊椎骨表型与未加入泼尼松的正常对照组比较相似，与模型对照组比较荧光信号明显增强，说明斑马鱼的骨密度有所恢复。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用治疗骨质疏松药物组的脊椎骨荧光强度与模型对照组比较明显增强，骨密度有所恢复；骨形态发生蛋白（BMP）表达量明显上调。

2.本实验证实了依替膦酸二钠、特立帕肽等治疗骨质疏松的药物具有增强骨密度的功效。

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化妆品中的功效活性成分是通过经皮吸收到达皮肤各层而发挥作用的，许多在体外试验中表现良好的活性物质在消费者实际使用过程中并未达到理想的功效结果，这与活性物的经皮吸收性能密切相关。

斑马鱼的皮肤结构与人体高度相似，因此活性成分在活体斑马鱼上的经皮吸收结果可以反映在人体皮肤上的吸收状况。

【评价原理】

    通过高效液相色谱法定量检测养鱼用水在孵育斑马鱼一段时间后的活性成分含量变化反映活性成分经斑马鱼的皮肤吸收状况，含量的减少量即为斑马鱼的经皮吸收量。

【实验方案】

我们将受试的斑马鱼分为三组，分别为正常对照组（不含活性物）、活性物对照组（不含鱼）和受试物组。在相同的温、湿度条件下孵育一段时间，在孵育前后分别检测各组中活性成分的含量。

【结果展示】

图1. 活性成分在不同组别中的色谱图

可以看到，受试物组的斑马鱼养鱼用水中的活性成分，在孵育后发生减少，减少量即为经皮吸收量。

【评价结论】

1、正常对照组的鱼水中未检测到活性成分，说明该方法不存在基体干扰；

2、活性物对照组孵育前后活性物含量无明显变化，说明在没有斑马鱼存在的孵育条件下活性物含量不发生变化；

3、受试物组，孵育后活性物含量明显低于孵育前，说明活性成分被经皮吸收至斑马鱼体内，经皮吸收量即为鱼水中的减少量。

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【评价原理】

多发性硬化是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病，可能是遗传易感个体与环境因素作用而发生的神经免疫过程，由于其发病率较高，成慢性病程和倾向于年轻人罹患，而成为最重要的神经系统疾病之一。研究表明斑马鱼的髓鞘少突胶质细胞的结构特性和细胞谱系关系与哺乳动物具有高度的可比性。斑马鱼体内与髓鞘形成相关的基因与哺乳动物具有很好的同源性。尽管这些基因与哺乳动物有些不同，但高度保守的基因序列足够表达出功能类似的蛋白。

溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，能诱导斑马鱼脑脊髓神经细胞髓鞘损伤。经过特异性荧光染色，髓鞘损伤的斑马鱼荧光比正常斑马鱼弱很多，可以在荧光显微镜下明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用髓鞘保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用髓鞘保护剂组都摄入了等量的溴化乙锭（溴化乙锭通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用髓鞘保护剂组先摄入溴化乙锭再摄入L-甲状腺素钠之类的髓鞘保护剂。

服用髓鞘保护剂后，我们对斑马鱼整体进行荧光染色，对斑马鱼髓鞘进行定量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼多发性硬化症表型图

黄色箭头为斑马鱼髓鞘细胞

可以看到，模型对照组的髓鞘细胞荧光强度较正常对照组明显减弱，服用髓鞘保护剂组的髓鞘细胞荧光强度明显增强。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用髓鞘保护剂组的髓鞘细胞荧光强度明显增强，并未出现模型对照组明显髓鞘损伤的情况。

2.本实验证实了L-甲状腺素钠具有明显治疗多发性硬化症的功效。

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随着年龄的增长，人体皮肤因自身生理调节和外界因素的作用而逐渐出现雀斑、日晒斑、黄褐斑等色斑，色斑的形成与皮肤中黑色素的沉着有关，祛斑功效实质上是对黑色素的清除作用。通过班斑马鱼技术能简洁而有效的评价化妆品的祛斑功效。

【评价原理】

斑马鱼在发育初期全身透明，胚胎发育至 24 h时黑色素开始从视网膜上皮生长，48h逐渐形成稳定并可见的黑色素色斑。将受试物于斑马鱼发育48h时加入鱼水中，72h时观察黑色素的降低程度，从而评价祛斑功效

【实验方案】

我们挑选2dpf的斑马鱼分成若干组，含正常对照组和供试品组。正常对照组不做处理，供试品组使用受试化妆品，孵育24hpf后，对斑马鱼头部进行拍照，利用高级图像处理软件分析斑马鱼头部的黑色素信号强度，从而评价其祛斑功效。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 斑马鱼头部黑色素表型图（蓝色为分析区域）

阳性对照组和化妆品组与正常对照组对比分析，得出祛斑功效作用。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼对比实验，阳性对照组和化妆品组与正常对照组对比，斑马鱼头部只有少量的黑色素。

2.本实验证实了该化妆品具有祛斑作用。

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【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。当生物暴露在环境污染物中，生物可能会发生氧化应激，主要表现为活性氧（ROS）产生和消耗的不平衡。在需氧生物的活细胞中，活性氧被一种由水和脂溶性低分子量自由基清除剂、特异性抗氧化酶组成的抗氧化防御机制解毒。

 应用ROS特异性荧光检测试剂，它的水解产物能被ROS氧化为高荧光物质，用多功能酶标仪检测荧光值反映氧化应激的程度。本方法已被授予国家发明专利。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是底物对照组、正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内），并加入ROS特异性荧光检测试剂。

服用供试品一段时间后，我们使用酶标仪对斑马鱼体内ROS进行荧光定量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ROS荧光值

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内荧光值比正常对照组有明显升高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼ROS水平明显高于正常对照组，与正常对照组存在显著性差异。

2.本实验证实了该供试品诱发斑马鱼氧化应激。

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【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。硫酸铜损伤斑马鱼神经丘（斑马鱼体表侧线器的末稍器官），造成神经丘细胞死亡，斑鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在神经丘周围，吞噬死亡的细胞 。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞比正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中正常对照组未摄入硫酸铜，模型对照组和服用/注射抗炎药组均摄入硫酸铜（硫酸铜通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用/注射抗炎药组在摄入硫酸铜之前摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体表侧线上中性粒细胞表型图

黄色箭头所指为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组侧线上中性粒细胞与正常对照组相似，未出现中性粒细胞募集情况。

以IL-1β基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼IL-1β基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-1β基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗炎药组侧线上中性粒细胞数量与正常对照组数量相当，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，斑马鱼肝脏中有许多与哺乳动物同源的脂质代谢酶，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。而且斑马鱼幼鱼通体透明，容易观察到毒性表型。酒精性肝损伤是全世界发病率和死亡率的主要原因，酒精性肝损伤是过量饮酒的结果。当患者继续饮酒时，会诱发严重的肝损伤形式，如脂肪性肝炎，纤维化，肝硬化和肝细胞癌。用乙醇可以诱发斑马鱼肝脏损伤，模拟人的肝脏疾病。

我们评价斑马鱼肝脏毒性有4个指标：1.肝脏面积；2.肝脏变性程度；3. 卵黄囊吸收延迟的发生率（卵黄囊是脂肪，卵黄囊吸收与肝功能密切相关）；4. 肝脏病理切片。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用肝保护剂组。其中正常对照组未摄入乙醇，模型对照组与服用肝保护剂组都摄入了等量的乙醇（乙醇通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。肝保护剂组在摄入对乙醇的同时摄入美他多辛之类的肝保护剂。

服用一段时间肝保护剂后，我们在显微镜下观察斑马鱼肝脏及卵黄囊表型，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

从病理切片中也能看出来，正常对照组肝细胞核规则清晰，肝细胞结构正常，边缘清晰。乙醇处理后，斑马鱼肝细胞结构模糊、肝细胞核肿大，肝组织出现脂肪空泡样变性，而肝保护剂组细胞和正常斑马鱼中形态相似。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，肝保护剂组斑马鱼肝脏与正常对照组相似，并未出现模型对照组的肝脏肿大、肝变性和卵黄囊吸收延迟情况。

2.本实验证实美他多辛对斑马鱼肝脏的保护作用。

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