【评价原理】

斑马鱼成鱼体长5 cm左右，其胚胎透明，在受精72 h后完成孵化，并在孵出后3个月内性成熟。成年斑马鱼的繁殖周期短(一般7 d左右)，若条件适宜，成年雌性斑马鱼可定期产卵(每次200～300个)。在斑马鱼的早期胚胎及幼体的发育过程中，尚无性别分化，原始性腺都是相同的且具有双向发育的潜能，易受环境(温度、光照、pH值等)因素的影响而改变其遗传性别。

对于雌性斑马鱼而言，产卵量是评价其繁殖力的常用生物指标，它与鱼类繁殖过程中的多个环节（卵子发育、雌雄交配行为、性激素刺激等）相关，并对环境化学物质具有高敏感性，能直接反应鱼类繁殖力变化。环境化学物质除了直接对亲代斑马鱼的生殖系统造成损害，还可能对其子代的正常生长发育。

卵黄蛋白原在斑马鱼雌鱼成熟过程中发挥重要作用，成熟雌鱼在体内17β-雌二醇的刺激下，由肝脏合成的VTG经过血液到达卵巢并加工成卵黄蛋白，促进性腺发育。幼鱼和雄鱼在正常情况下不合成VTG,但在受到雌激素和类雌激素刺激时能合成VTG，导致鱼体内VTG浓度升高，出现雌性体征。

鱼类的性腺发育和繁殖行为受到下丘脑-垂体-性腺轴（HPG 轴）的调控。下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），其作用于脑垂体，刺激其分泌促黄体生成素（LH）和促卵泡素（FSH），这两种激素通过血液循环与相应的受体结合后作用于性腺，刺激性腺产生睾酮（T）、17β-雌二醇（E2）和 11-酮基睾酮（11-KT） 等类固醇激素，进而促进精子和卵子的发育和成熟。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，进行21天的暴露实验，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间供试品后，观察每次的产卵量、受精率及孵化率；对受精卵进行子一代发育毒性与致畸性评价。在实验终点取斑马鱼的组织，检测卵黄蛋白原（VTG）含量及相关基因表达，并对性腺进行病理组织学检查，指标主要包括：睾丸卵母细胞、睾丸间质细胞增生、卵黄形成减少、精原细胞和滤泡增生；其他性腺损伤包括：卵母细胞闭锁、睾丸变性和分期改变。

【结果展示】

图1. 供试品对斑马鱼体内卵黄蛋白原（VTG）的影响

可以看到，供试品组VTG有下降趋势，但与正常对照组比较没有显著性差异。

图2. 斑马鱼发育毒性与致畸性表型图

可以看到，供试品组斑马鱼诱发眼睛变小，下颌异常，心血管毒性等。

图3. 斑马鱼性腺病理切片

可以看到，供试品组斑马鱼精巢精子量变少，卵巢中卵母细胞体积变小、数量减少 。

图4. 供试品对斑马鱼基因表达的影响

可以看到，供试品组FSHβ、LHβ基因相较于正常对照组显著表达。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，摄入供试品组的斑马鱼体内VTG有下降趋势，子一代斑马鱼有致畸性，性腺病理切片有不同程度的异常，与性腺发育和繁殖行为相关基因的上调。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有生殖毒性。

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【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。当生物暴露在环境污染物中，生物可能会发生氧化应激，主要表现为活性氧（ROS）产生和消耗的不平衡。在需氧生物的活细胞中，活性氧被一种由水和脂溶性低分子量自由基清除剂、特异性抗氧化酶组成的抗氧化防御机制解毒。

 应用ROS特异性荧光检测试剂，它的水解产物能被ROS氧化为高荧光物质，用多功能酶标仪检测荧光值反映氧化应激的程度。本方法已被授予国家发明专利。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是底物对照组、正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内），并加入ROS特异性荧光检测试剂。

服用供试品一段时间后，我们使用酶标仪对斑马鱼体内ROS进行荧光定量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ROS荧光值

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内荧光值比正常对照组有明显升高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼ROS水平明显高于正常对照组，与正常对照组存在显著性差异。

2.本实验证实了该供试品诱发斑马鱼氧化应激。

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【评价原理】

对乙酰氨基酚是临床上常用于解热镇痛，但对肝脏有严重的副作用，其中间代谢产物激发细胞内氧化应激反应，加快了细胞脂质过氧化水平，引起线粒体膜电位消失和膜流动性降低，腺嘌呤核苷三磷酸合成障碍，最终导致肝细胞坏死。斑马鱼的肝脏组织、细胞组成和功能几乎与哺乳动物相同。疾病表征如胆汁淤积、脂肪肝（脂肪变性）和肿瘤的组织病理学也与哺乳动物具有可比性。斑马鱼对外来生物化学物质如酶诱导和氧化应激的一般防御机制与哺乳动物相同，斑马鱼药物代谢相关的细胞色素P450也与哺乳动物具有相似性。因此，斑马鱼适合用于评价产品对对乙酰氨基酚等药物引起肝损伤的保肝功效。

患有肝损伤的斑马鱼的肝脏较正常斑马鱼明显缩小，肝脏变性发黑，卵黄囊吸收延迟（卵黄囊是脂肪，吸收与肝脏功能相关）。由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用肝保护剂组。其中正常对照组未对乙酰氨基酚，模型对照组与服用肝保护剂组都摄入了等量的对乙酰氨基酚（对乙酰氨基酚通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用肝保护剂组在摄入对乙酰氨基酚的同时摄入N-乙酰半胱氨酸之类的肝保护剂。

服用一段时间肝保护剂后，我们观察肝脏的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼酒精性脂肪肝表型图

黄色虚线区域为肝脏，红色虚线区域为卵黄囊

可以看到，服用肝保护组的肝脏情况与未摄入对乙酰氨基酚的正常对照组比较相似，相比模型对照组的肝缩小和肝变性发黑都有明显改善。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用肝保护剂组的肝脏情况与未摄入肝保护的正常对照组相似，相比模型对照组的肝损伤明显改善。

2.本实验证实了N-乙酰半胱氨酸具有保护肝脏功效。

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【评价原理】

半数致死浓度（LC50）是指在动物急性毒性实验中，使受试动物半数死亡的毒性浓度。在比较各种污染物的毒性，不同种或不同发育阶段的动物对污染物的敏感性以及环境因素对毒性影响等方面的研究中，都以LC50为依据。常规急性毒性实验常采用啮齿类和非啮齿类动物进行，能较准确地反映药物的安全性，但实验周期一般较长，药物用量较大。用斑马鱼胚胎检验药物急性毒性，具有体积小，成本低，易于饲养，重复性好，便于观察，繁殖周期短，繁殖频率高，给药方式简单等诸多优点，因此它是一种理想的试验模型，用以确定药物暴露在胚胎中的毒性效应，评价药物半数致死浓度。

根据实验终点斑马鱼的死亡率，通过使用OriginPro 8.0统计学软件，拟合半数致死浓度。

【实验方案】

我们将供试品设置一系列浓度，并设置一个正常对照组。同时设置3个生物学重复。药物通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内进行3天的暴露实验。

每天观察记录斑马鱼死亡情况，药物处理结束后，统计各实验组的斑马鱼致死率，使用OriginPro 8.0统计学软件绘制最佳的剂量效应曲线，并计算LC50。

【结果展示】

图1. 斑马鱼“浓度-死亡率”效应曲线

可以看到，利用OriginPro 8.0软件模拟得出药物LC50=8.0 μg/mL。

【评价结论】

1.根据药物“浓度-死亡率”的统计数据，利用OriginPro 8.0软件模拟得出药物的LC50=8.0 μg/mL。

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【评价原理】

神经毒性通常指某些药物影响机体的神经传导，导致神经传导中断或减弱，从而影响机体的正常功能。斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，神经系统形成过程和发育机制与人类高度相似，在6 hpf（受精后6小时）神经系统开始发育，受精6天后所有神经系统发育完成。斑马鱼在短时间内形成整个神经系统，为神经毒性的评价带来了有利的条件。而且斑马鱼对药物神经毒性的预测准确性高，同时兼具快速、高效、经济的优点。

我们评价斑马鱼神经毒性有3个指标：1.行为学；2.中枢神经凋亡细胞荧光信号强度；3. 外周运动神经长度。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们观察斑马鱼的运动行为，通过荧光染色观察中枢神经凋亡细胞，也可以利用转基因运动神经绿色荧光NBT品系斑马鱼观察外周运动神经长度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼神经毒性运动轨迹图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼运动明显减少。

图2. 斑马鱼光暗刺激下每分钟运动速度表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼对光暗刺激不敏感。

图3. 斑马鱼中枢神经凋亡细胞表型图

黄色虚线框内为中枢神经分析区域，绿色荧光小点为凋亡细胞

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼中枢神经细胞凋亡明显增加。

图4. 斑马鱼外周运动神经表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼外周运动神经明显缩短。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼运动明显减少且对光暗刺激不敏感，中枢神经细胞凋亡增加且外周运动神经缩短，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有神经毒性。

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【评价原理】

药物主要通过影响血管生长因子的表达、阻滞血管生成因子受体的活性、抑制内皮细胞增殖、抑制基底膜降解和阻断内皮细胞特异性整合素等机制发挥抗血管生成作用。

利用特有的转基因血管内皮发荧光斑马鱼（呈绿色），摄入血管形成抑制剂的斑马鱼肠下血管面积会明显较正常斑马鱼的肠下血管面积变小，节间血管会断裂而失去完整性。由于转基因斑马鱼的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用/注射血管形成抑制剂组（血管形成抑制剂索拉非尼通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内，血管形成抑制剂恩度通过静脉注射吸收到斑马鱼体内）。

服用或注射一段时间血管形成抑制剂后，我们对斑马鱼进行荧光拍照，观察斑马鱼肠下血管和节间血管的变化。

【结果展示】

图1. 肠下血管表型图

黄色虚线区域为斑马鱼肠下血管

可以看到，服用血管抑制剂组的肠下血管面积明显小于正常对照组。

图2. 供试品对节间血管形成的抑制作用表型图

白色箭头指向断裂的血管

可以看到，注射血管形成抑制剂组的节间血管出现断裂。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，给予血管抑制组的肠下血管较正常对照组变小，节间血管较正常对照组失去完整性。

2.本实验证实了索拉非尼和恩度具有抑制血管形成作用。

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人胆管类器官培养试剂盒是一种用于构建、维持和扩增人胆管类器官的细胞培养基，即买即用。本产品由我司自主研发，不含血清，成分明确。

【评价原理】

细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染。斑马鱼有着与哺乳动物非常相似的发育良好的免疫系统(包括特异性免疫和非特异性免疫），使得斑马鱼成为了研究病菌感染机制和筛选抗菌剂非常有用的动物模型。

经过荧光标记的细菌（呈红色）注射进入斑马鱼体内，生长繁殖，可以明显地被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是模型对照组和服用抗菌剂组。模型对照组与服用细菌抑制剂组都注射了等量的细菌（细菌通过静脉注射的方式入到斑马鱼体内）。服用抗菌剂组在注射细菌后摄入阿奇霉素、比阿培南、利奈唑酮之类的抗菌剂。

服用一段时间抗菌剂后，我们将斑马鱼置于荧光显微镜下观察细菌数量的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内细菌繁殖表型图

白色箭头所指红色颗粒为细菌

可以看到，服用抗菌剂组的体内细菌数量较模型对照组显著减少，未出现全身性感染。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗菌剂组的斑马鱼体内细菌数量较模型对照组显著减少，未出现全身性感染。

2.本实验证实了阿奇霉素、比阿培南、利奈唑酮等抗生素具有显著的抑制细菌作用。

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【评价原理】

机体供能主要分为有氧供能与无氧供能，在两种供能条件下ATP均源源不断的合成以维持机体活动的需求。通过ATP含量的测定，可以分析能量调节剂对斑马鱼能量代谢快慢的影响。如持续的促进能量代谢、增加机体能量消耗是行之有效的减肥措施，促进脂肪分解类减肥产品可明显增加斑马鱼体内ATP含量。

【实验方案】

将受测试斑马鱼分成2组，分别是正常对照组、能量调节剂组。服用一段时间能量调节剂后，我们利用ATP试剂盒检测斑马鱼体内ATP含量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ATP含量

与正常对照组比较，***p<0.001

可以看到，服用能量调节剂的斑马鱼体内ATP含量明显比正常对照组高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用能量调节剂的斑马鱼体内ATP含量与正常对照组相比明显升高，说明本次实验中选用的能量调节剂可促进ATP生成，促进能量代谢。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。持续的高血糖水平导致糖尿病并发症发生，高血糖累及中枢和周围神经病变，出现神经炎症。感觉神经受损较为多见，出现麻木、触电、发热、蚁行感，运动神经受损则出现肌力下降。斑马鱼胰腺的形态发生和基本细胞结构、排列方式类似于哺乳动物，斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖负荷状态下表现出持续高血糖现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病的神经并发症。

用中性粒细胞荧光与运动神经荧光杂交品系斑马鱼（呈绿色），患有高血糖的斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目增多，在荧光显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖产品。

服用一段时间降糖产品后，我们用荧光显微镜观察斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目

黄色框线内绿色荧光点代表中性粒细胞

可以看到，模型对照组的周围运动神经中性粒细胞数目较正常对照组明显增多，而降糖产品组斑马鱼明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖产品组斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目与模型对照组比较明显减少。

2.本实验证实了松花蛹虫草之类的降糖产品具有神经炎症消退功效。

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