【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。当生物暴露在环境污染物中，生物可能会发生氧化应激，主要表现为活性氧（ROS）产生和消耗的不平衡。在需氧生物的活细胞中，活性氧被一种由水和脂溶性低分子量自由基清除剂、特异性抗氧化酶组成的抗氧化防御机制解毒。

 应用ROS特异性荧光检测试剂，它的水解产物能被ROS氧化为高荧光物质，用多功能酶标仪检测荧光值反映氧化应激的程度。本方法已被授予国家发明专利。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是底物对照组、正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内），并加入ROS特异性荧光检测试剂。

服用供试品一段时间后，我们使用酶标仪对斑马鱼体内ROS进行荧光定量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ROS荧光值

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内荧光值比正常对照组有明显升高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼ROS水平明显高于正常对照组，与正常对照组存在显著性差异。

2.本实验证实了该供试品诱发斑马鱼氧化应激。

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【评价原理】

斑马鱼成鱼体长5 cm左右，其胚胎透明，在受精72 h后完成孵化，并在孵出后3个月内性成熟。成年斑马鱼的繁殖周期短(一般7 d左右)，若条件适宜，成年雌性斑马鱼可定期产卵(每次200～300个)。在斑马鱼的早期胚胎及幼体的发育过程中，尚无性别分化，原始性腺都是相同的且具有双向发育的潜能，易受环境(温度、光照、pH值等)因素的影响而改变其遗传性别。

对于雌性斑马鱼而言，产卵量是评价其繁殖力的常用生物指标，它与鱼类繁殖过程中的多个环节（卵子发育、雌雄交配行为、性激素刺激等）相关，并对环境化学物质具有高敏感性，能直接反应鱼类繁殖力变化。环境化学物质除了直接对亲代斑马鱼的生殖系统造成损害，还可能对其子代的正常生长发育。

卵黄蛋白原在斑马鱼雌鱼成熟过程中发挥重要作用，成熟雌鱼在体内17β-雌二醇的刺激下，由肝脏合成的VTG经过血液到达卵巢并加工成卵黄蛋白，促进性腺发育。幼鱼和雄鱼在正常情况下不合成VTG,但在受到雌激素和类雌激素刺激时能合成VTG，导致鱼体内VTG浓度升高，出现雌性体征。

鱼类的性腺发育和繁殖行为受到下丘脑-垂体-性腺轴（HPG 轴）的调控。下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），其作用于脑垂体，刺激其分泌促黄体生成素（LH）和促卵泡素（FSH），这两种激素通过血液循环与相应的受体结合后作用于性腺，刺激性腺产生睾酮（T）、17β-雌二醇（E2）和 11-酮基睾酮（11-KT） 等类固醇激素，进而促进精子和卵子的发育和成熟。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，进行21天的暴露实验，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间供试品后，观察每次的产卵量、受精率及孵化率；对受精卵进行子一代发育毒性与致畸性评价。在实验终点取斑马鱼的组织，检测卵黄蛋白原（VTG）含量及相关基因表达，并对性腺进行病理组织学检查，指标主要包括：睾丸卵母细胞、睾丸间质细胞增生、卵黄形成减少、精原细胞和滤泡增生；其他性腺损伤包括：卵母细胞闭锁、睾丸变性和分期改变。

【结果展示】

图1. 供试品对斑马鱼体内卵黄蛋白原（VTG）的影响

可以看到，供试品组VTG有下降趋势，但与正常对照组比较没有显著性差异。

图2. 斑马鱼发育毒性与致畸性表型图

可以看到，供试品组斑马鱼诱发眼睛变小，下颌异常，心血管毒性等。

图3. 斑马鱼性腺病理切片

可以看到，供试品组斑马鱼精巢精子量变少，卵巢中卵母细胞体积变小、数量减少 。

图4. 供试品对斑马鱼基因表达的影响

可以看到，供试品组FSHβ、LHβ基因相较于正常对照组显著表达。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，摄入供试品组的斑马鱼体内VTG有下降趋势，子一代斑马鱼有致畸性，性腺病理切片有不同程度的异常，与性腺发育和繁殖行为相关基因的上调。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有生殖毒性。

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【评价原理】

癫痫发作是指大脑神经元广泛同步放电所致的大脑功能紊乱。若反复发作则称为癫痫或癫痫综合征。GABA是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质。戊四唑（PTZ）是γ-氨基丁酸（简称GABA）抑制剂，大剂量PTZ可诱导癫痫发作，是哺乳动物癫痫模型中的常用诱导剂。斑马鱼已被建议作为一种替代动物模型用于研究癫痫的机制和筛选抗癫痫药。用戊四唑诱导斑马鱼后，中枢神经系统受影响，斑马鱼幼鱼表现出运动行为异常(类似人类癫痫的痉挛)和c-fos基因表达的上调。

用行为分析仪记录斑马鱼的运动（快速运动类似于癫痫发作的线呈现红色），癫痫斑马鱼快速运动距离较正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和药物组。其中正常对照组未摄入PTZ，模型对照组与服用抗癫痫药物组都摄入了等量的PTZ（PTZ通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。抗癫痫药物组在摄入PTZ之前摄入苯妥英钠、丙戊酸钠之类的抗癫痫药物。

服用一段时间抗癫痫药物后，我们利用行为分析仪追踪记录斑马鱼的运动，同时检测与癫痫相关的c-fos和gabra1（GABA A受体α1）基因。

【结果展示】

图1. 斑马鱼癫痫表型图

红线代表快速运动距离（>20mm/s抽搐）

可以看到，模型对照组的快速运动距离较正常对照组明显增多，而抗癫痫药物组快速运动距离明显减少。

图2. c-fos和gabra1基因图

从基因图中也能看出来，模型对照组c-fos基因上调，gabra1下调，而抗癫痫药物组c-fos基因下调，gabra1上调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗癫痫药物组斑马鱼运动与模型对照组比较，快速运动距离明显减少。

2.本实验证实了苯妥英钠、丙戊酸钠具有抗癫痫作用。

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【评价原理】

斑马鱼消化道的解剖结构和细胞结构与人类消化道相似，具有同心圆层的内上皮、结缔组织、环状肌肉和外纵肌层。三硝基苯磺酸（TNBS）的乙醇溶液造模法属于正常免疫系统下的半抗原诱导性模型，当TNBS的乙醇溶液灌肠时，乙醇作为有机溶剂溶解肠粘膜表面的黏液，暂时性破坏肠粘膜屏障，使TNBS和肠组织蛋白结合形成完全抗原，导致肠黏膜免疫系统针对该抗原的迟发性变态反应，并造成肠黏膜的损伤。杯状细胞是黏蛋白的主要来源，其数量和形态反应肠粘膜的健康状况，是肠粘膜异常的敏感指标。

由于斑马鱼通体透明的特点，有两种方法检测结肠炎的防治作用。1.观察肠腔面积的变化，2. 通过特异性染料（呈蓝色）对肠道的杯状细胞染色，通过观察杯状细胞数量来判断肠粘膜的损伤情况。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和抗结肠炎药物组。其中正常对照组未摄入TNBS，模型对照组与抗结肠炎药物组都加入了等量的TNBS（TNBS通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。抗结肠炎药物组在摄入TNBS的同时摄入泼尼松之类抗结肠炎药物。

服用一段时间抗结肠炎药物组后，我们观察斑马鱼的肠腔面积变化、杯状细胞数量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肠腔面积表型图

绿色虚线区域为斑马鱼肠腔

可以看到，服用抗结肠炎药物的肠腔面积与未加TNBS的正常对照组比较相似，没有明显的肠腔面积扩大。

图2. 斑马鱼肠道杯状细胞表图

红色框线区域内蓝色颗粒为杯状细胞

可以看到，服用抗结肠炎药物的肠道杯状细胞数量与未加TNBS的正常对照组比较相似，没有像模型组明显的杯状细胞减少情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗结肠炎药物的肠腔面积和杯状细胞数量与未加入TNBS的正常对照组相似，并未出现模型对照组的肠腔变大和杯状细胞减少的情况。

2.本实验证实了泼尼松具有结肠炎的防治作用。

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【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。用手术刀截断斑马鱼尾鳍，诱发急性损伤，促使斑马鱼中性粒细胞发生免疫应答。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到尾鳍截断的斑马鱼创面中性粒细胞数量比正常斑马鱼明显增加。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中正常对照组未截断尾鳍，模型对照组和服用抗炎药组均截断尾鳍。服用抗炎药组在切断尾鳍后摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼尾鳍中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼尾鳍炎症中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为尾鳍，绿色颗粒为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组尾鳍中性粒细胞与正常对照组相似，未出现创面中性粒细胞募集情况。

以TNF-α、COX-2基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼TNF-α基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，TNF-α基因表达明显下调。

图3. 斑马鱼COX-2基因相对表达量

与模型对照组比较，***p < 0.001

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，COX-2基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射抗炎药组尾鳍中性粒细胞数量与正常对照组相似，未出现创面中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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【评价原理】

行为是动物毒性应激反应重要而敏感的指标，神经毒性往往会导致机体行为表现异常。斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，神经系统形成过程和发育机制与人类高度相似，且对于药物的反应也有着高度相似性。斑马鱼对药物行为毒性的预测准确性高，同时兼具快速、高效、经济的优点。

我们评价斑马鱼行为毒性有4个指标：1.行为学；2.中枢神经凋亡细胞荧光信号强度；3. 外周运动神经长度；4. 脑变性发生率。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们观察斑马鱼的运动行为，通过荧光染色观察中枢神经凋亡细胞，也可以利用转基因运动神经绿色荧光NBT品系斑马鱼观察外周运动神经长度，同时可以观察脑变性发生率。

【结果展示】

图1. 斑马鱼行为毒性运动轨迹图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼运动明显减少。

图2. 斑马鱼中枢神经凋亡细胞表型图

黄色虚线框内为中枢神经分析区域，绿色荧光小点为凋亡细胞

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼中枢神经细胞凋亡明显增加。

图3. 斑马鱼外周运动神经表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼外周运动神经明显缩短。

图4. 斑马鱼脑变性表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼脑部变性呈黑色。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼运动明显减少，中枢神经细胞凋亡增加，外周运动神经缩短且脑变性发生率增加，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有行为毒性。

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【评价原理】

由于斑马鱼大脑具有典型脊椎动物脑部形态学特征，血管与神经系统在分子信号通路上与人和哺乳动物的同源性达到85%以上。GSK-3β是在进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，斑马鱼和人类表现出90%以上的序列相似性。单胺氧化酶（MAO）的核酸和氨基酸序列同大小鼠和人类MAO有67%～69%的同一性, 斑马鱼与人的MAO有着相同的外显子-内含子结构。

1.氯化铝诱导的老年痴呆模型

氯化铝超过正常摄入量可导致动物行为异常，同时破坏胆碱能神经功能，还可增加淀粉样蛋白的产量，最终导致记忆力减退、学习能力降低。

通过行为分析仪检测斑马鱼的对外界刺激的反应能力，经氯化铝诱发的痴呆型斑马鱼反应能力比正常对照组斑马鱼差；通过酶标仪检测斑马鱼的乙酰胆碱酯酶，经氯化铝诱发的老年痴呆斑马鱼乙酰胆碱酯酶活性高于正常斑马鱼。

2.GSK-3β抑制剂筛选模型

GSK-3β对APP的代谢过程、Tau蛋白的磷酸化过程以及神经元凋亡机制均有影响。GSK-3β抑制剂有效降低Aβ以及Tau蛋白造成的神经毒性作用。

通过对斑马鱼表型的观察，经GSK-3β抑制剂处理过后的斑马鱼会产生无眼无脑的表型。

3.MAO抑制剂筛选模型

通过抑制MAO-B或Bestrophin-1通道来降低生产和释放γ-氨基丁酸（GABA），这样能降低老年痴呆模型的神经元、突触传递和记忆的损伤。

通过酶标仪检测单胺氧化酶活性，若能抑制正常斑马鱼的单胺氧化酶活性说明供试品为MAO抑制剂。

【实验方案】

1.氯化铝诱导的老年痴呆模型

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和乙酰胆碱酯酶抑制剂组。其中正常对照组未摄入氯化铝造模，模型对照组与服用乙酰胆碱酯酶抑制剂都摄入等量的氯化铝（氯化铝通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。乙酰胆碱酯酶抑制剂在摄入氯化铝的同时摄入多奈哌齐之类的乙酰胆碱酯酶抑制剂。

服用一段时间乙酰胆碱酯酶抑制剂后，我们对斑马鱼进行行为学检测，观察斑马鱼的外界光暗刺激的反应能力（反应速度）；同时酶标仪检测斑马鱼体内乙酰胆碱酯酶活性。

2.GSK-3β抑制剂筛选模型

我们将受测试斑马鱼分成2组，分别是正常对照组和GSK-3β抑制剂组（GSK-3β抑制剂氯化锂通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间GSK-3β抑制剂后，我们对斑马鱼进行表型观察，若观察到无眼无脑斑马鱼则认为是GSK-3β抑制剂（注意要与发育缓慢区分）。

3.MAO抑制剂筛选模型

我们将受测试斑马鱼分成2组，分别是正常对照组和MAO抑制剂组（MAO抑制剂司来吉兰通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间MAO抑制剂后，我们用酶标仪检测斑马鱼体内乙酰单胺氧化酶活性。

【结果展示】

可以看到，服用乙酰胆碱酯酶抑制剂组斑马鱼的乙酰胆碱酯酶活性显著降低与正常对照组相似，未出现乙酰胆碱酯酶活性明显升高的情况。

可以看到，服用MAO抑制剂组斑马鱼的单胺氧化酶酶活性与正常对照组相比显著降低。

【评价结论】

1.在氯化铝诱导的老年痴呆模型中，服用多奈哌齐的斑马鱼反应能力较模型对照组有明显的改善，且对氯化铝诱导的老年痴呆模型斑马鱼的乙酰胆碱酯酶活性也有显著降低的作用。

2.在GSK-3β抑制剂筛选模型中，氯化锂诱导斑马鱼出现无眼无脑模型，具有GSK-3β抑制作用。

3.在MAO抑制剂筛选模型中，司来吉兰具有显著抑制单胺氧化酶活性作用。

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【评价原理】

酒精进入人体后90%进入肝脏进行代谢，长期过量饮酒诱发酒精性脂肪肝，临床表现为肝脏受脂肪浸润。由于斑马鱼拥有与人类相似的消化系统，如肝脏、肠道等，消化和营养的吸收及运输与人类高度相似，在大量摄入酒精后，肝脏也会出现脂肪变性（酒精性脂肪肝）的情况。

经过脂肪特异性染色（呈红色），患有酒精性脂肪肝的斑马鱼的肝脏会明显比正常斑马鱼的肝脏要红很多，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用解酒剂组。其中正常对照组未摄入酒精，模型对照组与服用解酒剂组都摄入了等量的酒精（酒精通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用解酒剂组在摄入酒精的同时摄入RU21、海王金樽之类的解酒剂。

服用一定时间解酒剂后，我们对斑马鱼整体做脂肪特异性染色，观察肝脏的脂肪变化，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼酒精性脂肪肝表型图

黄色虚线区域为肝脏，肝脏内红色代表脂肪

可以看到，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组比较相似，没有明显的脂肪沉积。

图2. 肝脏病理切片

黄色箭头指向脂肪颗粒

从病理切片中也能看出来，酒精性脂肪肝斑马鱼的肝脏有很多脂肪颗粒，而服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组都没有出现类似的脂肪颗粒。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组相似，并未出现模型对照组的出现大量脂肪颗粒（酒精性脂肪肝）的情况。

2.本实验证实了RU21、海王金樽解酒剂具有疏肝解酒（酒精性脂肪肝防治）功效。

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【评价原理】

斑马鱼为鲤科短担尼鱼属的小型硬骨鱼，1998年国际经济合作与发展组织将斑马鱼胚胎发育方法列入测定单一化学品毒性的标准方法。由于斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，近年来斑马鱼被广泛应用于人类疾病模型及药物筛选、毒理学与环境检测中，使其成为新型的脊椎模式生物。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或胚胎注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体进行观察评价，观察斑马鱼心脏、脑部、耳、下颌、眼、肝脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、鳍、体长、身体着色、循环系统、身体水肿和出血等毒性反应情况，统计毒性发生率。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胚胎毒性表型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼眼变小、心包水肿、肝脏变性、卵黄囊吸收延迟、胃肠道发育延迟。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的组织器官产生明显的毒性表型，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有胚胎毒性。

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【评价原理】

肿瘤治疗中一个普遍存在的问题就是多药耐药。在化疗引起的肿瘤耐药机制中，肿瘤细胞的P-糖蛋白（P-gp）表达水平升高是主要机制之一。P-gp是一种细胞外转运子，P-gp表达水平升高会导致进入肿瘤细胞会很快被转运到细胞外，导致肿瘤细胞内的化疗药浓度达不到杀死肿瘤细胞的浓度，进而产生耐药性。

让正常斑马鱼摄入荧光底物（呈红色），由于P-gp的存在，正常斑马鱼将荧光底物泵出体外，残留在体内的荧光底物很少；而用P-gp抑制剂环孢菌素A处理后，P-gp的活性受到抑制，P-gp荧光底物不能被排出，残留在斑马鱼体内的荧光底物增多。若某种药物能够增加荧光底物在斑马鱼体内的存留，则其可能是潜在的P-gp抑制剂。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用P-gp抑制剂组。斑马鱼提前P-gp抑制剂数小时，而正常斑马鱼和服用P-gp抑制剂组都摄入了等量的荧光底物（荧光底物通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。一定时间后，观察斑马鱼卵黄囊荧光底物的残留情况（卵黄囊荧光强度）来体现P-gp抑制剂逆转多药耐药作用。

【结果展示】

图1. 斑马鱼多药耐药表型图

可以看到，服用P-gp抑制剂组的斑马鱼卵黄囊明显比正常对照组的亮，说明其对P-gp有显著的抑制作用。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用P-gp抑制剂组的斑马鱼卵黄囊明显比正常对照组的亮，说明其对P-gp有显著的抑制作用。

2.本实验证实了环孢菌素A、维拉帕米具有逆转多药耐药作用。

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