【评价原理】

静脉注射给予长春瑞滨造模斑马鱼免疫力低下模型。大剂量长春瑞滨骨髓抑制明显，导致血小板、红细胞及白细胞数目（中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等）减少和贫血，最终导致免疫力低下。人类与斑马鱼在免疫系统的细胞组成上极为相似，而且斑马鱼是目前所有同时具有特异性免疫和非特异性免疫动物个体中体积最小的，适合高通量评价调节免疫功效。斑马鱼静脉注射大剂量长春瑞滨后可造成免疫低下。

采用转基因T细胞红色荧光斑马鱼，可在荧光显微镜在观察到免疫力低下的斑马鱼体内的T细胞荧光强度明显减弱。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用免疫调节剂组。其中正常对照组未注射长春瑞滨，模型对照组与服用免疫调节剂组都注射了等量的长春瑞滨（长春瑞滨通过静脉注射的方式摄入到斑马鱼体内）。服用免疫调节剂组在注射长春瑞滨后摄入异丙肌苷等免疫调节剂。

服用一段时间免疫调节剂后，我们观察斑马鱼T细胞荧光强度变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼T细胞表型图

蓝色箭头所指红色荧光颗粒为T细胞

可以看到，免疫调节剂组T细胞荧光强度与未注射长春瑞滨的正常对照组比较相似，没有出现明显的T细胞减少情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，免疫调节剂组的T细胞荧光强度与正常对照组相似，并未出现模型对照组T细胞减少的情况。

2.本实验证实了异丙肌苷具有增强免疫力的功效。

更多项目服务，请拨电话咨询：0571-83782130，项目经理手机 17364531293（微信同号）

【评价原理】

静脉注射给予长春瑞滨造模斑马鱼免疫力低下模型。大剂量长春瑞滨骨髓抑制明显，导致血小板、红细胞及白细胞数目（中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等）减少和贫血，最终导致免疫力低下。人类与斑马鱼在免疫系统的细胞组成上极为相似，而且斑马鱼是目前所有同时具有特异性免疫和非特异性免疫动物个体中体积最小的，适合高通量评价调节免疫功效。斑马鱼静脉注射大剂量长春瑞滨后可造成免疫低下。

采用转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，可在荧光显微镜在观察到免疫力低下的斑马鱼体内的巨噬细胞荧光强度明显减弱。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用免疫调节剂组。其中正常对照组未注射长春瑞滨，模型对照组与服用免疫调节剂组都注射了等量的长春瑞滨（长春瑞滨通过静脉注射的方式摄入到斑马鱼体内）。服用免疫调节剂组在注射长春瑞滨后摄入盐酸小檗胺等免疫调节剂。

服用一段时间免疫调节剂后，我们观察巨噬细胞荧光强度变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼巨噬细胞表型图

绿色荧光颗粒代表巨噬细胞

可以看到，免疫调节剂组巨噬细胞荧光强度与正常对照组相似，没有出现巨噬细胞荧光强度明显减弱的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，免疫调节剂组巨噬细胞数量与正常对照组相似，并未出现模型对照组免疫力低下的情况。

2.本实验证实了盐酸小檗胺具有增强免疫力的功效。

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【评价原理】

通常来说，炎症是机体的一种抗病反应，机体蒙受损坏后，机体的内坏境以及内境界和外坏境之间达到新的均衡的过程中会引发组装细胞的损坏，使片面组装细胞显现变性、坏死。

利用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼（MPO）作为模型，当体内炎症水平上升的时候，中性粒细胞的数量也就相对的增高，在荧光显微镜下，中性粒细胞的数量也就是表现出炎症反应程度的一个重要指标。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照与供试品组，通过服用/注射供试品一段时间后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼中性粒细胞的数量，同时检测体内炎症因子IL-6的表达情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼中性粒细胞数量

（箭头所指的绿色荧光点为中性粒细胞）

从实验结果可以看到，供试品组相对正常对照组斑马鱼侧线位置中性粒细胞数显著增多。

图2：斑马鱼体内的中性粒细胞数量及体内炎症因子表达水平的变化

从实验结果可以看到，斑马鱼供试品组相对正常对照组，IL-6炎症因子相对表达量下降。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，相对于正常对照组，服用或者注射供试品组之后，中性粒细胞增多和炎症因子上升。

2.本实验证实了供试品组等具有增加中性粒细胞数量，以及促进炎性因子表达的作用。

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过敏反应通常会引起许多皮肤症状，比如皮肤发红、发痒，严重的患者还会出现刺痛或者面部出现红斑、风团、丘疹或丘疱疹等症状。一些医美类化妆品除具有常规护肤功效外还能起到抗过敏作用。通过斑马鱼技术能有效评价化妆品及其原料对过敏反应的抑制作用。

【评价原理】

过敏反应的主要原因是过敏原/致敏因子诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放多种活性介质进而诱发各种过敏症状。其中类胰蛋白酶是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是临床上检验人体是否过敏的重要指标。斑马鱼产生过敏反应时，同样会诱导肥大细胞分泌类胰蛋白酶。因此，通过检测斑马鱼整体类胰蛋白酶水平可以判断化妆品及其原料的抗过敏作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成若干组，分别含正常对照组、模型对照组和化妆品组。其中正常对照组未经C48/80处理，模型对照组和化妆品组都用C48/80处理（C48/80通过溶解到标准稀释水中的方式摄入到斑马鱼体内，C48/80是一种能让皮肤表面产生过敏反应的物质），化妆品组另需加入相应浓度的化妆品样品。

处理24 h后，利用酶标仪检测各组吸光度值（OD值），以类胰蛋白酶的表达水平评价化妆品抗过敏作用。

此外，可以通过斑马鱼病理切片，用PAS染色后观察肠道壁上肥大细胞的状况反映化妆品的抗敏作用。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 化妆品处理后斑马鱼吸光度值

与模型对照组比较，*p < 0.05

图2. 化妆品处理后斑马鱼的致敏作用

与模型对照组比较，*p < 0.05

可以看到，使用化妆品的浓度组类胰蛋白酶含量与模型对照组比较明显降低。

图3. 斑马鱼体内肥大细胞染色典型图（箭头指示为肥大细胞，PAS 1000×）

从病理切片中也能看出来，模型对照组斑马鱼的肠道壁上的肥大细胞与正常对照组相比数量显著上升，而经色甘酸钠和化妆品处理的斑马鱼肠道肥大细胞相对于模型对照组明显减少。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，模型对照组斑马鱼的肠道壁上的肥大细胞与正常对照组相比数量显著上升，而经色甘酸钠和化妆品处理的斑马鱼肠道肥大细胞相对于模型对照组明显减少。

2.本实验证实了色甘酸钠和该化妆品具有抗过敏功效。

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【评价原理】

斑马鱼成鱼体长5 cm左右，其胚胎透明，在受精72 h后完成孵化，并在孵出后3个月内性成熟。成年斑马鱼的繁殖周期短(一般7 d左右)，若条件适宜，成年雌性斑马鱼可定期产卵(每次200～300个)。斑马鱼与人类的基因相似率高达87%, 与哺乳类动物相比, 斑马鱼的信号传导以及生理结构和功能方面都非常相似。斑马鱼能够对药物在体内的分布情况、吸收情况、代谢以及排泄等生理动态方面提供准确的信息, 尤其对小分子所引起的内分泌紊乱、再生毒性、行为缺陷、致畸、心血管毒性、肝毒性等毒性反应与人具有高度相似性。因此，使用斑马鱼作为药物早期的安全性评价是非常可靠的。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。供试品通过水溶暴露给药或灌胃等方式处理斑马鱼3个月。

服用一段时间供试品后，将斑马鱼固定、脱水、包埋、切片，进行H&E染色，我们观察斑马鱼各组织脏器结构病理变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼致癌性表型图

可以看到，服用供试品组11.1 µg/mL浓度组组织结构异常，产生癌变。异位的精原细胞簇可见于中央小叶，远离基膜。精子生成明显减少。

【评价结论】

1.经过每组10尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼精巢结构明显异常，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有致癌性。

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【评价原理】

心肌损伤多数是由于炎症、缺血、冠状动脉狭窄等因素引发的心肌损伤，常表现为胸闷、胸痛、气短、四肢乏力、心慌、恶心呕吐等症状。斑马鱼心脏包含心房、心室和静脉窦，心电图谱也与哺乳动物类似。而且斑马鱼生长发育周期短，胚胎透明易观察，心脏在受精后48小时就发育完全，有利于开展心肌损伤保护剂的研究。盐酸异丙肾上腺素可以诱导斑马鱼心率加快，心肌持续收缩，心肌耗氧量持续增加，心脏由代偿性收缩转化为失代偿，最终导致心肌损伤，使心肌细胞凋亡。

经过特异性荧光染色（凋亡细胞呈绿色），心肌损伤的斑马鱼在心脏部位会布满凋亡细胞，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用心肌保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用心肌保护剂组都摄入了等量的盐酸异丙肾上腺素（盐酸异丙肾上腺素通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用心肌损伤保护剂组在摄入盐酸异丙肾上腺素的同时摄入N-乙酰半胱氨酸之类的心肌保护剂。

服用一段时间心肌保护剂后，我们对斑马鱼整体进行特异性荧光染色，观察心肌细胞的凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼心肌保护表型图

黄色虚线区域为心脏，绿色光点为凋亡细胞

可以看到，服用心肌保护剂组的心脏情况与正常对照组比较相似，细胞凋亡明显比模型对照组减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用心肌保护剂组的心脏情况与正常对照组相似，并未出现模型对照组大量凋亡细胞的情况。

2.本实验证实了N-乙酰半胱氨酸具有明显保护心肌作用。

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【评价原理】

利用物理/化学方法损伤斑马鱼肌肉、皮肤，伤口愈合过程中黑色素细胞会募集到伤口部位，伤口愈合相关基因表达量（如皮肤胶原蛋白colla1b基因）会显著增加以促进伤口愈合。由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和伤口愈合促进剂组。其中正常对照组未经过物理/化学损伤，模型对照组与伤口愈合促进组都经过了同程度的损伤。服用伤口愈合促进组在损伤后摄入胶原蛋白等伤口愈合促进剂。

服用一段时间伤口愈合促进剂后，观察伤口色素变化，并用实时荧光定量PCR仪检测伤口愈合相关基因的表达量。

【结果展示】

图1.伤口部位色素募集表型图

黄色虚线内为损伤部位

可以看出，伤口愈合促进剂组的伤口黑色素募集程度与同等程度损伤的模型对照组比较明显减轻。

图2. 斑马鱼体内cola1b基因相对表达量

与模型对照组比较，***p < 0.001 

可以看出，服用伤口愈合促进剂组cola1b相对表达量明显高于模型对照组。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用伤口愈合促进剂组的黑色素募集情况较模型对照组明显减轻，cola1b相对表达量也明显高于模型对照组。

2.本实验证实了胶原蛋白具有促进伤口愈合功效。

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一、促进组织再生功效评价

【评价原理】

机械损伤将产生皮肤组织的结构性破坏，斑马鱼尾鳍具有自我再生功能，通过对尾鳍再生速度的观察可以评价受试物促进组织再生功效。

【实验方案】

将斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组。正常对照组不做处理，模型对照组和供试品组均采用手术方法定量切断尾鳍，从而完成造模处理，供试品组中添加一定浓度的受试化妆品。避光孵育一段时间后，将各组斑马鱼在体视显微镜下拍照并保存图片，用高级图像分析软件对斑马鱼尾鳍面积进行定量分析，以尾鳍面积的增量评价受试化妆品促进组织再生功效。

【结果展示】

斑马鱼尾鳍面积

图1. 斑马鱼尾鳍面积表型图

红色区域为分析区域

可以看到，孵育相同时间后，供试品组斑马鱼尾鳍面积明显大于模型对照组，说明该化妆品具有促进组织再生功效。

【评价结论】

1.经过斑马鱼对比实验，供试品组与模型对照组相比，斑马鱼尾鳍面积明显增加。

2.本实验证实了该化妆品具有促进组织再生功效。

二、促进伤口愈合（抗炎）功效评价

【评价原理】

斑马鱼幼鱼的再生能力非常强大：切断尾鳍后，伤口立即紧缩、上皮细胞覆盖，数小时内便出现炎症反应，伤口处中性粒细胞的数量可以反映炎症反应的程度。转基因中性粒细胞荧光斑马鱼的中性粒细胞可在荧光显微镜下被明显观察，因此可以通过实时观察斑马鱼伤口附近的中性粒细胞数量评价受试物的抗炎功效。

【实验方案】

将斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组。正常对照组不做处理，模型对照组和供试品组均采用手术方法定量切断尾鳍，从而完成造模处理，供试品组中添加一定浓度的受试化妆品。避光孵育一段时间后，将各组斑马鱼在荧光显微镜下拍照并保存图片，用高级图像分析软件对斑马鱼尾鳍损伤部位的中性粒细胞进行计数，以中性粒细胞相比于模型对照组的减少量评价受试化妆品促进组织再生功效。

此外，可通过Q-PCR检测IL-1β、IL-6和IL-10等炎症因子的表达，通过相关炎症因子表达量的降低评价受试化妆品的抗炎功效。

【结果展示】

1、尾鳍损伤部位中性粒细胞（推荐）

图2 斑马鱼尾鳍中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为计算区域，绿色荧光点为中性粒细胞

可以看到，供试品组斑马鱼的中性粒细胞数目比模型对照组明显减少。

2、炎症因子的表达量（提供柱状图）

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，水溶给予供试品组的斑马鱼中性粒细胞数目及炎症因子的相对表达量与模型对照组相比明显减少。

2.本实验证实了该供试品具有促进伤口愈合（抗炎）功效。

三、促进疤痕淡化

【评价原理】

    冰乙酸对皮肤伤口具有一定的损伤作用，斑马鱼皮肤表面被注射冰乙酸后，伤口部位将出现色素的聚集，口修复过程中色素含量逐渐减少。通过观察对伤口部位的色素含量的减少量可以评价受试物对伤口的愈合作用。

【实验方案】

将斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组。正常对照组不做处理，模型对照组和供试品组均采用注射方式在斑马鱼躯干部位定量注射冰乙酸，受试化妆品以一定浓度水溶添加到供试品组中。各实验组在避光条件下孵育一段时间后，在显微镜下拍照保存图片，用高级图像处理软件分析斑马鱼伤口部位色素的不透光总和，计算供试品组相对于模型对照组的色素减少量，从而评价受试化妆品的促进伤口愈合功效。

【结果展示】

图3 斑马鱼躯干色素表型图

可以看到，供试品组斑马鱼躯干部位的色素含量比模型对照组明显减少。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，水溶给予供试品组的斑马鱼躯干部位色素含量与模型对照组相比明显减少。

2.本实验证实了该供试品具有促进疤痕淡化功效。

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【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。硫酸铜损伤斑马鱼神经丘（斑马鱼体表侧线器的末稍器官），造成神经丘细胞死亡，斑鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在神经丘周围，吞噬死亡的细胞 。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞比正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中正常对照组未摄入硫酸铜，模型对照组和服用/注射抗炎药组均摄入硫酸铜（硫酸铜通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用/注射抗炎药组在摄入硫酸铜之前摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体表侧线上中性粒细胞表型图

黄色箭头所指为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组侧线上中性粒细胞与正常对照组相似，未出现中性粒细胞募集情况。

以IL-1β基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼IL-1β基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-1β基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗炎药组侧线上中性粒细胞数量与正常对照组数量相当，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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【评价原理】

免疫毒性是指化合物对机体免疫系统的损伤作用，包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反应性过度增强，可能包括免疫性产生，过敏反应（超敏反应或变态反应）、自身免疫反应以及不良免疫刺激等。

斑马鱼具有先天免疫系统和获得性免疫系统，与果蝇和线虫模型相比，斑马鱼的免疫系统发育的更完整。研究证实斑马鱼与哺乳动物一样，具有T细胞、B细胞、自然杀伤细胞，其免疫系统对于环境中的免疫毒性物质（包括哺乳动物）非常的敏感。

免疫毒性指标有3个：（1）应用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，观察中性粒细胞数量；（2）应用转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，观察巨噬细胞数量（荧光强度）；（3）注射红色荧光微球，巨噬细胞吞噬微球排出体外，用体内微球的数量反映巨噬细胞吞噬功能。（4）检测T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成二组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，我们对斑马鱼检测中性粒细胞和巨噬细胞计数、巨噬细胞吞噬功能和T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【结果展示】

（1）中性粒细胞数量 

图1. 斑马鱼中性粒细胞表型图

绿色小点为中性粒细胞

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内中性粒细胞数量比正常对照组明显减少。

（2）巨噬细胞数量

图2. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内巨噬细胞数量比正常对照组明显减少。

（3）巨噬细胞吞噬功能

图3. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组的吞噬颗粒的巨噬细胞数量与正常对照组比较有明显减少，说明巨噬细胞吞噬功能下降。

（4）T/B相关基因表达（rag1和rag2）

图4. 斑马鱼rag1和rag2表达

左图为rag1基因相对表达量，右图为rag2基因相对表达量

可以看到，服用供试品组的rag1和rag2相对表达量与正常对照组比较均有减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的中性粒细胞和巨噬细胞数量与正常对照组比较均有减少，其巨噬细胞吞噬功能有所下降，且rag1和rag2相对表达量减少。

2.本实验证实了该供试品具有免疫毒性。

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