【评价原理】

半数致死浓度（LC50）是指在动物急性毒性实验中，使受试动物半数死亡的毒性浓度。在比较各种污染物的毒性，不同种或不同发育阶段的动物对污染物的敏感性以及环境因素对毒性影响等方面的研究中，都以LC50为依据。常规急性毒性实验常采用啮齿类和非啮齿类动物进行，能较准确地反映食品及保健食品的安全性，但实验周期一般较长，用量较大。用斑马鱼胚胎检验食品及保健食品的急性毒性，具有体积小，成本低，易于饲养，重复性好，便于观察，繁殖周期短，繁殖频率高，给药方式简单等诸多优点。因此斑马鱼是一种理想的试验模型，用以确定食品及保健品暴露在胚胎中的毒性效应，评价其半数致死浓度。

根据实验终点斑马鱼的死亡率，通过使用OriginPro 8.0统计学软件，拟合半数致死浓度。

【实验方案】

我们将供试品（保健食品）设置一系列浓度，并设置一个正常对照组。同时设置3个生物学重复。药物通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内进行3天的暴露实验。

每天观察记录斑马鱼死亡情况，药物处理结束后，统计各实验组的斑马鱼致死率，使用OriginPro 8.0统计学软件绘制最佳的剂量效应曲线，并计算LC50。

【结果展示】

图1. 斑马鱼“浓度-死亡率”效应曲线

可以看到，利用OriginPro 8.0软件模拟得出保健食品LC50= 8.0 μg/mL。

【评价结论】

1.根据保健食品“浓度-死亡率”统计数据，利用OriginPro 8.0软件模拟得出LC50=8.0 μg/mL。

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人体皮肤逐渐衰老的重要原因是活性氧自由基对皮肤的长期氧化作用，具有抗氧化活性的化妆品能够清除皮肤表面自由基，通过斑马鱼技术可以有效评价化妆品及其原料清除自由基的能力。

【评价原理】

甲萘醌能产生活性氧自由基，当自由基产生量大于机体清除能力时就发生氧化应激反应，通过斑马鱼卵黄囊荧光强度评价供试品抗氧化作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成若干组，含正常对照组、模型对照组和化妆品组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组和化妆品组都加入等量的甲萘醌（甲萘醌通过溶解到标准稀释水中的方式摄入到斑马鱼体内）。化妆品组在加入甲萘醌的同时加入一定浓度的化妆品。

使用化妆品24 hpf后，，我们对斑马鱼整体进行特异性荧光染色，观察斑马鱼卵黄囊活性氧自由基产生情况。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 斑马鱼卵黄囊荧光表型图

黄色为分析区域，绿色荧光代表氧自由基

可以看到，阳性对照组和化妆品组与正常对照组相似，卵黄囊中只有少量的活性氧自由基。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼对比实验，阳性对照组和化妆品组与正常对照组相似，卵黄囊中只有少量的活性氧自由基。

2.本实验证实了该化妆品具有抗氧化的作用。

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【评价原理】

免疫毒性是指化合物对机体免疫系统的损伤作用，包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反应性过度增强，可能包括免疫性产生，过敏反应（超敏反应或变态反应）、自身免疫反应以及不良免疫刺激等。

斑马鱼具有先天免疫系统和获得性免疫系统，与果蝇和线虫模型相比，斑马鱼的免疫系统发育的更完整。研究证实斑马鱼与哺乳动物一样，具有T细胞、B细胞、自然杀伤细胞，其免疫系统对于环境中的免疫毒性物质（包括哺乳动物）非常的敏感。

免疫毒性指标有3个：（1）应用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，观察中性粒细胞数量；（2）应用转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，观察巨噬细胞数量（荧光强度）；（3）注射红色荧光微球，巨噬细胞吞噬微球排出体外，用体内微球的数量反映巨噬细胞吞噬功能。（4）检测T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成二组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，我们对斑马鱼检测中性粒细胞和巨噬细胞计数、巨噬细胞吞噬功能和T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【结果展示】

（1）中性粒细胞数量 

图1. 斑马鱼中性粒细胞表型图

绿色小点为中性粒细胞

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内中性粒细胞数量比正常对照组明显减少。

（2）巨噬细胞数量

图2. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内巨噬细胞数量比正常对照组明显减少。

（3）巨噬细胞吞噬功能

图3. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组的吞噬颗粒的巨噬细胞数量与正常对照组比较有明显减少，说明巨噬细胞吞噬功能下降。

（4）T/B相关基因表达（rag1和rag2）

图4. 斑马鱼rag1和rag2表达

左图为rag1基因相对表达量，右图为rag2基因相对表达量

可以看到，服用供试品组的rag1和rag2相对表达量与正常对照组比较均有减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的中性粒细胞和巨噬细胞数量与正常对照组比较均有减少，其巨噬细胞吞噬功能有所下降，且rag1和rag2相对表达量减少。

2.本实验证实了该供试品具有免疫毒性。

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肤色暗沉是体内外多种因素共同作用的结果，其中重要的一种因素是由活性氧自由基引起的氧化应激反应，导致皮肤色素沉着，看上去黯淡无光。通过斑马鱼技术能有效评价化妆品提亮肤色的功效作用。

【评价原理】

甲萘醌能产生活性氧自由基，当自由基产生量大于机体清除能力时就发生氧化应激反应,最终导致皮肤色素沉着。用甲萘醌处理后的斑马鱼，被供试品作用后，在白光条件下分析皮肤局部亮度，通过亮度的增加程度反映受试物提亮肤色的功效。

【实验方案】

我们将斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组。正常对照组不做处理，模型对照组用甲萘醌处理，供试品组用甲萘醌处理后再用供试品处理，孵育一定时间后，对斑马鱼进行拍照，利用高级图像处理软件分析斑马卵黄囊部分的色素信号强度，从而评价其提亮肤色功效。

【结果展示】

图1. 斑马鱼卵黄囊色素表型图（红色为分析区域）

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼对比实验，供试品组与模型对照组对比，斑马鱼卵黄囊部分的色素明显降低，亮度增加。

2.本实验证实了该供试品具有提亮肤色的功效。

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过敏反应通常会引起许多皮肤症状，比如皮肤发红、发痒，严重的患者还会出现刺痛或者面部出现红斑、风团、丘疹或丘疱疹等症状。一些医美类化妆品除具有常规护肤功效外还能起到抗过敏作用。通过斑马鱼技术能有效评价化妆品及其原料对过敏反应的抑制作用。

【评价原理】

过敏反应的主要原因是过敏原/致敏因子诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放多种活性介质进而诱发各种过敏症状。其中类胰蛋白酶是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是临床上检验人体是否过敏的重要指标。斑马鱼产生过敏反应时，同样会诱导肥大细胞分泌类胰蛋白酶。因此，通过检测斑马鱼整体类胰蛋白酶水平可以判断化妆品及其原料的抗过敏作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成若干组，分别含正常对照组、模型对照组和化妆品组。其中正常对照组未经C48/80处理，模型对照组和化妆品组都用C48/80处理（C48/80通过溶解到标准稀释水中的方式摄入到斑马鱼体内，C48/80是一种能让皮肤表面产生过敏反应的物质），化妆品组另需加入相应浓度的化妆品样品。

处理24 h后，利用酶标仪检测各组吸光度值（OD值），以类胰蛋白酶的表达水平评价化妆品抗过敏作用。

此外，可以通过斑马鱼病理切片，用PAS染色后观察肠道壁上肥大细胞的状况反映化妆品的抗敏作用。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 化妆品处理后斑马鱼吸光度值

与模型对照组比较，*p < 0.05

图2. 化妆品处理后斑马鱼的致敏作用

与模型对照组比较，*p < 0.05

可以看到，使用化妆品的浓度组类胰蛋白酶含量与模型对照组比较明显降低。

图3. 斑马鱼体内肥大细胞染色典型图（箭头指示为肥大细胞，PAS 1000×）

从病理切片中也能看出来，模型对照组斑马鱼的肠道壁上的肥大细胞与正常对照组相比数量显著上升，而经色甘酸钠和化妆品处理的斑马鱼肠道肥大细胞相对于模型对照组明显减少。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，模型对照组斑马鱼的肠道壁上的肥大细胞与正常对照组相比数量显著上升，而经色甘酸钠和化妆品处理的斑马鱼肠道肥大细胞相对于模型对照组明显减少。

2.本实验证实了色甘酸钠和该化妆品具有抗过敏功效。

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皮肤组织中由于存在胶原蛋白、弹性蛋白等多种蛋白成分而具有一定的弹性，皮肤弹性是衡量皮肤健康与否的重要标志，很多针对熟龄肌的化妆品是由于提高了皮肤弹性而具有抗衰老功效。通过斑马鱼技术能有效评价化妆品增加皮肤弹性的功效。

【评价原理】

通过检测皮肤弹性相关基因的相对表达量（皮肤胶原蛋白col1a1a、col1a1b、col1a2基因）来表明样品是否具有增加皮肤弹性作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成若干组，含正常对照组和化妆品组。其中正常对照组未经任何处理，化妆品组添加受试化妆品。

使用化妆品24 hpf后，我们对每组斑马鱼进行收样，使用试剂盒提取RNA后，使用q-PCR检测目的基因的转录水平，通过斑马鱼皮肤胶原蛋白基因相对表达量评价化妆品增加皮肤弹性作用。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 斑马鱼体内col1a1b基因相对表达量

可以看到，化妆品高浓度组的col1a1b相对表达量较正常对照组显著增加。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼和两组平行对照的对比实验，化妆品高浓度组的col1a1b相对表达量较正常对照组显著增加。

2.本实验证实了该化妆品具有增加皮肤弹性的作用。

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【评价原理】

静脉注射给予长春瑞滨造模斑马鱼免疫力低下模型。大剂量长春瑞滨骨髓抑制明显，导致血小板、红细胞及白细胞数目（中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等）减少和贫血，最终导致免疫力低下。人类与斑马鱼在免疫系统的细胞组成上极为相似，而且斑马鱼是目前所有同时具有特异性免疫和非特异性免疫动物个体中体积最小的，适合高通量评价调节免疫功效。斑马鱼静脉注射大剂量长春瑞滨后可造成免疫低下。

采用转基因T细胞红色荧光斑马鱼，可在荧光显微镜在观察到免疫力低下的斑马鱼体内的T细胞荧光强度明显减弱。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用免疫调节剂组。其中正常对照组未注射长春瑞滨，模型对照组与服用免疫调节剂组都注射了等量的长春瑞滨（长春瑞滨通过静脉注射的方式摄入到斑马鱼体内）。服用免疫调节剂组在注射长春瑞滨后摄入异丙肌苷等免疫调节剂。

服用一段时间免疫调节剂后，我们观察斑马鱼T细胞荧光强度变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼T细胞表型图

蓝色箭头所指红色荧光颗粒为T细胞

可以看到，免疫调节剂组T细胞荧光强度与未注射长春瑞滨的正常对照组比较相似，没有出现明显的T细胞减少情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，免疫调节剂组的T细胞荧光强度与正常对照组相似，并未出现模型对照组T细胞减少的情况。

2.本实验证实了异丙肌苷具有增强免疫力的功效。

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【评价原理】

当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越小，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。彗星实验检测低浓度基因毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，检测尾长、彗星长、尾矩和Olive尾矩。

【结果展示】

图1. 彗星电泳图片

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼细胞核出现拖尾。该供试品改变DNA链的负超螺旋结构、空间构象，使DNA链断裂、形成类核，最终导致细胞死亡（坏死、凋亡或自体吞噬）。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼细胞核出现明显拖尾，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有基因毒性。

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【评价原理】

利用物理/化学方法损伤斑马鱼肌肉、皮肤，伤口愈合过程中黑色素细胞会募集到伤口部位，伤口愈合相关基因表达量（如皮肤胶原蛋白colla1b基因）会显著增加以促进伤口愈合。由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和伤口愈合促进剂组。其中正常对照组未经过物理/化学损伤，模型对照组与伤口愈合促进组都经过了同程度的损伤。服用伤口愈合促进组在损伤后摄入胶原蛋白等伤口愈合促进剂。

服用一段时间伤口愈合促进剂后，观察伤口色素变化，并用实时荧光定量PCR仪检测伤口愈合相关基因的表达量。

【结果展示】

图1.伤口部位色素募集表型图

黄色虚线内为损伤部位

可以看出，伤口愈合促进剂组的伤口黑色素募集程度与同等程度损伤的模型对照组比较明显减轻。

图2. 斑马鱼体内cola1b基因相对表达量

与模型对照组比较，***p < 0.001 

可以看出，服用伤口愈合促进剂组cola1b相对表达量明显高于模型对照组。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用伤口愈合促进剂组的黑色素募集情况较模型对照组明显减轻，cola1b相对表达量也明显高于模型对照组。

2.本实验证实了胶原蛋白具有促进伤口愈合功效。

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【评价原理】

斑马鱼成鱼体长5 cm左右，其胚胎透明，在受精72 h后完成孵化，并在孵出后3个月内性成熟。成年斑马鱼的繁殖周期短(一般7 d左右)，若条件适宜，成年雌性斑马鱼可定期产卵(每次200～300个)。斑马鱼与人类的基因相似率高达87%, 与哺乳类动物相比, 斑马鱼的信号传导以及生理结构和功能方面都非常相似。斑马鱼能够对药物在体内的分布情况、吸收情况、代谢以及排泄等生理动态方面提供准确的信息, 尤其对小分子所引起的内分泌紊乱、再生毒性、行为缺陷、致畸、心血管毒性、肝毒性等毒性反应与人具有高度相似性。因此，使用斑马鱼作为药物早期的安全性评价是非常可靠的。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。供试品通过水溶暴露给药或灌胃等方式处理斑马鱼3个月。

服用一段时间供试品后，将斑马鱼固定、脱水、包埋、切片，进行H&E染色，我们观察斑马鱼各组织脏器结构病理变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼致癌性表型图

可以看到，服用供试品组11.1 µg/mL浓度组组织结构异常，产生癌变。异位的精原细胞簇可见于中央小叶，远离基膜。精子生成明显减少。

【评价结论】

1.经过每组10尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼精巢结构明显异常，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有致癌性。

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