【评价原理】

脑缺血脑血管疾病占70%左右，主要是由于脑动脉管腔出现狭窄或闭塞，导致脑部血流供应障碍，引起部分脑部组织缺血缺氧而出现坏死，最终造成神经功能缺损的疾病。普纳替尼进入人体后导致血栓形成与抑制血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成，影响一氧化氮合成，导致血管内皮损伤诱发脑血栓。斑马鱼大脑具有典型脊椎动物脑部形态学特征，而且拥有凝血因子、血小板受体，在摄入大量普纳替尼后也会诱发脑血栓。

经过红细胞特异性染色（呈红色），患有脑缺血的斑马鱼的头部血栓会明显比正常斑马鱼增多，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗血栓药物组。其中正常对照组未加入普纳替尼，模型对照组与服用抗血栓药物组都摄入了等量的普纳替尼（普纳替尼通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用抗血栓药物组在摄入普纳替尼的同时摄入阿司匹林、安宫牛黄丸之类的抗血栓药物。

服用抗血栓药物一段时间后，我们对斑马鱼整体做红细胞特异性染色，观察头部的血栓情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脑血栓表型图

蓝色虚线区域为脑血栓区域

可以看到，服用抗血栓药物组的脑血栓情况与未摄入普纳替尼的正常对照组比较相似，没有明显的脑血栓情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗血栓药物组的脑血栓情况与未摄入普纳替尼的正常对照组相似，并未出现模型对照组明显的脑血栓的情况。

2.本实验证实了阿司匹林、安宫牛黄丸具有脑血栓防治作用。

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【评价原理】

当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越小，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。彗星实验检测低浓度基因毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，检测尾长、彗星长、尾矩和Olive尾矩。

【结果展示】

图1. 彗星电泳图片

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼细胞核出现拖尾。该供试品改变DNA链的负超螺旋结构、空间构象，使DNA链断裂、形成类核，最终导致细胞死亡（坏死、凋亡或自体吞噬）。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼细胞核出现明显拖尾，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有基因毒性。

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【评价原理】

斑马鱼皮肤结构与功能与人类高度相似，斑马鱼皮肤含有基底层、棘层、颗粒层、透明层和表皮角质细胞层；另外尚有与人皮肤结构相同的固有层、半桥粒、黑色素细胞、血管和皮下脂肪细胞等。斑马鱼皮肤间质结缔组织、胶原及其临近的纤维母细胞及皮肤基因表达亦与人类皮肤相似。

我们评价斑马鱼皮肤肌肉毒性有4个指标：1.皮肤刺激；2.肌肉纹理；3.皮肤凋亡细胞定量；4.皮肤色素变化。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。

皮肤吸收供试品一段时间后，我们通过中性粒转基因荧光斑马鱼，观察皮肤/肌肉刺激性；通过表型拍照，观察肌肉纹理及皮肤色素变化；通过AO染色凋亡细胞，观察皮肤细胞凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼皮肤刺激性典型图片

可以看到，供试品组皮肤/肌肉可见明显中性粒细胞聚集。

图2. 斑马鱼皮肤损伤典型图片

可以看到，供试品组可见明显肌肉纹理不清晰。

图3. 斑马鱼凋亡细胞表型图

可以看到，供试品组尾部可见明显凋亡（绿色荧光亮点）。

图4. 斑马鱼皮肤色素异常表型图

可以看到，供试品组躯干可见明显色素异常（黄色虚线区域）。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，供试品组的斑马鱼皮肤肌肉产生明显的毒性表型（包括肌肉纹理异常和色素异常），在斑马鱼尾部可见明显的凋亡细胞，在躯干部可见明显的中性粒细胞聚集。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有皮肤肌肉毒性。

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【评价原理】

缺氧可能导致心血管系统、呼吸系统、神经系统、消化系统等等一系列危害身体的疾病。斑马鱼心血管系统在分子信号通路上与人和哺乳动物的同源性达到85%以上,近年来斑马鱼广泛地被用于心血管疾病研究领域。因此，斑马鱼适用于评价耐缺氧功效。钴离子作用细胞后，可直接取代类血红素中的铁离子，使类血红素不能和氧结合而保持脱氧状态，从而模拟缺氧。

经过行为分析仪检测，缺氧的斑马鱼的总运动距离会明显比正常斑马鱼明显减少；经过凋亡细胞特异性荧光染色（呈绿色），斑马鱼脑部细胞凋亡可以被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用耐缺氧剂组。其中正常对照组未服用氯化钴，模型对照组与服用耐缺氧剂组都摄入了等量的氯化钴（氯化钴通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用耐缺氧剂组在摄入氯化钴之前摄入红景天苷之类的耐缺氧剂。

服用耐缺氧剂一段时间后，我们对斑马鱼进行行为分析，分析其总运动距离；同时对斑马鱼进行凋亡细胞染色，观察脑细胞凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼运动轨迹图

黑线：斑马鱼静止运动轨迹；绿线：中速运动；红线：快速运动

可以看到，服用耐缺氧剂组的总运动距离与未服用氯化钴的正常对照组比较相似，没有明显的运动减少。

图2. 缺氧导致的脑细胞凋亡表型图

计算黄色区域内的凋亡细胞

可以看到，服用耐缺氧剂组的脑部细胞与未服用氯化钴的正常对照组比较相似，没有明显的凋亡细胞。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用耐缺氧剂组的总运动距离和脑部凋亡细胞与正常对照组相似，并未出现模型对照组总运动距离减少和脑部凋亡细胞增多的情况。

2.本实验证实了红景天苷具有明显的耐缺氧功效。

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【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，斑马鱼肝脏中有许多与哺乳动物同源的脂质代谢酶，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。而且斑马鱼幼鱼通体透明，容易观察到毒性表型。

我们评价斑马鱼肝脏毒性有4个指标：1.肝脏面积；2.肝脏变性程度；3. 卵黄囊吸收延迟的发生率（卵黄囊是脂肪，卵黄囊吸收与肝功能密切相关）；4. 肝脏病理切片。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们观察斑马鱼肝脏及卵黄囊表型，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肝脏毒性表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼肝脏肿大、变性、卵黄囊吸收延迟。

图2. 斑马鱼肝脏病理切片

绿色箭头指向红细胞淤积

从病理切片中可见，正常对照组肝组织结构规则，肝细胞形态完整，细胞质均匀，细胞核呈规则圆形，位于细胞中央；服用/注射供试品组的斑马鱼肝脏红细胞淤积严重，细胞肿胀现象严重，细胞核萎缩变形，位于细胞边缘，局部可见炎性浸润，坏死。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼肝脏产生明显的毒性表型且组织病理学改变，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有肝脏毒性。

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暴露于生活环境中的皮肤，接触到有毒有害物质后可能引起一定程度的皮肤炎症，出现皮肤红肿、瘙痒等现象。一些医美类化妆品除具有常规护肤功效外还能起到抗炎舒缓作用。通过斑马鱼技术能有效评价化妆品及其原料抗炎舒缓功效。

【评价原理】

化妆品对皮肤的刺激表型主要表现为皮肤炎症，炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通

透性亢进和水肿。

十二烷基磺酸钠（SLS）是人体皮肤刺激物模型斑贴试验常见的阳性对照物，SLS刺激后能诱发表皮炎症细胞浸润，刺激物进入斑马鱼体内，诱导炎症反应，中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表皮迁移并聚集。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组（供试品通过溶解到标准稀释水中的方式接触到斑马鱼皮肤）。

正常对照组不做处理，模型对照组仅用SLS处理，供试品组在用SLS的同时添加受试化妆品。孵育一段时间后，我们将斑马鱼整体放到荧光显微镜下拍照，以皮肤表面中性粒

细胞数量评价供试品的抗炎舒缓功效。

【结果展示】

图1 斑马鱼皮肤中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为计算区域，绿色荧光点为中性粒细胞

可以看到，供试品组斑马鱼的中性粒细胞数目比模型对照组少，与正常对照组相似。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，水溶给予供试品组的斑马鱼中性粒细胞数目比模型对照组少，与正常对照组相似。。

2.本实验证实了该供试品具有抗炎舒缓功效。

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【评价原理】

中枢神经损伤常表现为偏瘫、失语、智力障碍或昏迷，甚至死亡。斑马鱼是一种与人类同源性较高的脊椎动物，大脑具有典型脊椎动物脑部形态学特征，髓鞘结构特征和少突胶质细胞分化过程与哺乳动物高度一致。而且斑马鱼生长发育周期短，神经系统简单，有利于开展中枢神经保护剂的研究。霉酚酸吗啉乙酯可以抑制斑马鱼神经元轴突的生长，干扰神经及细胞的迁移和导致发育畸形，使神经元细胞凋亡。

经过特异性荧光染色（凋亡细胞呈绿色），中枢神经损伤的斑马鱼在脑和脊髓部位会布满凋亡细胞，比正常斑马鱼多很多，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用中枢神经保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用中枢神经保护剂组都摄入了等量的霉酚酸吗啉乙酯（霉酚酸吗啉乙酯通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用中枢神经保护剂组在摄入霉酚酸吗啉乙酯的同时摄入还原型谷胱甘肽、养血清脑颗粒和安宫牛黄丸之类的中枢神经保护剂。

服用中枢神经保护剂一段时间后，我们对斑马鱼整体进行特异性荧光染色，观察中枢神经细胞的凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼中枢神经保护表型图

黄色虚线区域为中枢神经，绿色光点为凋亡细胞

可以看到，服用中枢神经保护剂组的中枢神经情况与正常对照组比较相似，没有明显的细胞凋亡。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用中枢神经保护剂组的中枢神经情况与正常对照组相似，并未出现模型对照组大量凋亡细胞的情况。

2.本实验证实了还原型谷胱甘肽、养血清脑颗粒和安宫牛黄丸具有明显保护中枢神经作用。

【评价原理】

斑马鱼的听觉外侧系统由内耳和侧线两个关键的感觉结构组成，斑马鱼具有典型的内耳结构，内耳的毛细胞和侧线的毛细胞在结构功能及分子水平上与哺乳动物的内耳毛细胞非常相似，包括对耳毒性药物的相似反应。

经过DASPEI特异性荧光染色（呈绿色），听力损伤的斑马鱼比正常斑马鱼毛细胞明显减少或缺失（荧光减弱或者消失）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体做毛细胞特异性染色，观察毛细胞的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼“浓度-死亡率”效应曲线

供试品最大非致死浓度（MNLC）和LC10

图2. 斑马鱼毛细胞表型图

绿色荧光点为听细胞聚集的神经丘

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼毛细胞减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼毛细胞明显减少，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有听毒性。

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【评价原理】

近年来，各种各样的美食迫使人们越来越关注胃肠道健康问题。斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，并拥有与人类结构和功能相似的胃肠道组织。斑马鱼胃肠道粘膜屏障系统由较完整的机械屏障、化学屏障和免疫屏障构成，与哺乳动物高度相似，可作为胃肠道粘膜屏障研究的动物模型。三硝基苯磺酸（TNBS）可破坏胃肠粘膜屏障，与肠组织蛋白结合形成抗原，发生变态反应，诱发溃疡性胃肠道损伤。胃肠道病变累及肌层和神经，导致胃肠壁张力减退，胃肠腔扩大。胃肠道病变时出现炎症反应，中性粒细胞募集到损伤部位。杯状细胞主要分泌黏蛋白，形成黏膜屏障以保护上皮细胞，胃肠黏膜损伤时杯状细胞数量减少。通过病理切片可观察胃肠道组织学改变（如溃疡形成等）的情况。

我们评价斑马鱼胃肠道粘膜损伤辅助保护功效有4个指标：1. 观察胃肠腔面积；2. 应用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，观察胃肠道中性粒细胞数量；3. 应用特异性的染料（呈蓝色），观察肠道杯状细胞数目；4. 胃肠道病理切片。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用胃肠道粘膜辅助保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用胃肠道粘膜辅助保护剂组都摄入了等量的TNBS（TNBS通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用胃肠道粘膜辅助保护剂组在TNBS诱导胃肠道粘膜损伤之后摄入常欣卫口服液之类的胃肠道粘膜辅助保护剂。

服用一段时间胃肠道粘膜辅助保护剂后，我们观察斑马鱼胃肠道表型，分析胃肠腔面积，胃肠道中性粒细胞数目和杯状细胞数目，同时制作成病理切片观察胃肠道的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胃肠道表型图（蓝色虚线区域为胃肠腔）

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护组的胃肠腔面积与正常对照组比较相似，没有明显的胃肠腔扩张。

图2. 斑马鱼胃肠道中性粒细胞表型图（黄色虚线区域为肠腔）

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的肠道中性粒细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的增多。

图3. 斑马鱼胃肠道杯状细胞表型图

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

图4. 斑马鱼胃肠道病理切片

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的胃肠粘膜形态与正常对照组比较相似，没有明显的胃肠腔扩张、粘膜糜烂溃疡等症状。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的胃肠腔情况与正常对照组相似，并未出现模型对照组胃肠腔扩张、中性粒细胞数量增加、肠道杯状细胞数目减少、粘膜糜烂溃疡等情况。

2.本实验证实了常欣卫口服液具有明显胃肠道粘膜辅助保护功效。

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【评价原理】

贫血是外周血红细胞减少。斑马鱼在受精后24 h出现血液循环，可以直接在显微镜下观察到血细胞。造血过程在脊椎动物的进化过程中保守。苯肼作用于红细胞膜，加速膜表面亮氨酸、赖氨酸、组氨酸的水解，同时降低红细胞变形能力，增强红细胞黏附到细胞外基质的能力从而破坏循环血中的成熟红细胞。

经过红细胞特异性染色（呈红色），患有贫血的斑马鱼心脏的血红细胞比正常斑马鱼心脏的血红细胞模型减少，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和补血剂组。其中正常对照组未摄入苯肼，模型对照组与补血剂组都加入了等量的苯肼（苯肼通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用补血剂组在加入苯肼的同时摄入氯生血宁片之类的补血剂。

服用一段时间补血剂后，我们对斑马鱼整体做红细胞特异性染色，观察心脏血红细胞变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼心脏红细胞表型图

绿色虚线区域为心脏红细胞

可以看到，服用预防血栓药物组的心脏情况与未加入苯肼的正常对照组比较相似，没有明显的红细胞减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用补血剂组的心脏红细胞情况与未摄入苯肼的正常对照组比较相似，没有明显的红细胞减少。

2.本实验证实了生血宁片具有补血功效。

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