【评价原理】

静脉注射给予长春瑞滨造模斑马鱼免疫力低下模型。大剂量长春瑞滨骨髓抑制明显，导致血小板、红细胞及白细胞数目（中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等）减少和贫血，最终导致免疫力低下。人类与斑马鱼在免疫系统的细胞组成上极为相似，而且斑马鱼是目前所有同时具有特异性免疫和非特异性免疫动物个体中体积最小的，适合高通量评价调节免疫功效。斑马鱼静脉注射大剂量长春瑞滨后可造成免疫低下。

采用转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，可在荧光显微镜在观察到免疫力低下的斑马鱼体内的巨噬细胞荧光强度明显减弱。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用免疫调节剂组。其中正常对照组未注射长春瑞滨，模型对照组与服用免疫调节剂组都注射了等量的长春瑞滨（长春瑞滨通过静脉注射的方式摄入到斑马鱼体内）。服用免疫调节剂组在注射长春瑞滨后摄入盐酸小檗胺等免疫调节剂。

服用一段时间免疫调节剂后，我们观察巨噬细胞荧光强度变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼巨噬细胞表型图

绿色荧光颗粒代表巨噬细胞

可以看到，免疫调节剂组巨噬细胞荧光强度与正常对照组相似，没有出现巨噬细胞荧光强度明显减弱的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，免疫调节剂组巨噬细胞数量与正常对照组相似，并未出现模型对照组免疫力低下的情况。

2.本实验证实了盐酸小檗胺具有增强免疫力的功效。

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【评价原理】

斑马鱼的听觉外侧系统由内耳和侧线两个关键的感觉结构组成，斑马鱼具有典型的内耳结构，内耳的毛细胞和侧线的毛细胞在结构功能及分子水平上与哺乳动物的内耳毛细胞非常相似，包括对耳毒性药物的相似反应。

经过DASPEI特异性荧光染色（呈绿色），听力损伤的斑马鱼比正常斑马鱼毛细胞明显减少或缺失（荧光减弱或者消失）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体做毛细胞特异性染色，观察毛细胞的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼“浓度-死亡率”效应曲线

供试品最大非致死浓度（MNLC）和LC10

图2. 斑马鱼毛细胞表型图

绿色荧光点为听细胞聚集的神经丘

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼毛细胞减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼毛细胞明显减少，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有听毒性。

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【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。硫酸铜损伤斑马鱼神经丘（斑马鱼体表侧线器的末稍器官），造成神经丘细胞死亡，斑鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在神经丘周围，吞噬死亡的细胞 。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞比正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中正常对照组未摄入硫酸铜，模型对照组和服用/注射抗炎药组均摄入硫酸铜（硫酸铜通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用/注射抗炎药组在摄入硫酸铜之前摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体表侧线上中性粒细胞表型图

黄色箭头所指为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组侧线上中性粒细胞与正常对照组相似，未出现中性粒细胞募集情况。

以IL-1β基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼IL-1β基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-1β基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗炎药组侧线上中性粒细胞数量与正常对照组数量相当，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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暴露于生活环境中的皮肤，接触到有毒有害物质后可能引起一定程度的皮肤炎症，出现皮肤红肿、瘙痒等现象。一些医美类化妆品除具有常规护肤功效外还能起到抗炎舒缓作用。通过斑马鱼技术能有效评价化妆品及其原料抗炎舒缓功效。

【评价原理】

化妆品对皮肤的刺激表型主要表现为皮肤炎症，炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通

透性亢进和水肿。

十二烷基磺酸钠（SLS）是人体皮肤刺激物模型斑贴试验常见的阳性对照物，SLS刺激后能诱发表皮炎症细胞浸润，刺激物进入斑马鱼体内，诱导炎症反应，中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表皮迁移并聚集。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组（供试品通过溶解到标准稀释水中的方式接触到斑马鱼皮肤）。

正常对照组不做处理，模型对照组仅用SLS处理，供试品组在用SLS的同时添加受试化妆品。孵育一段时间后，我们将斑马鱼整体放到荧光显微镜下拍照，以皮肤表面中性粒

细胞数量评价供试品的抗炎舒缓功效。

【结果展示】

图1 斑马鱼皮肤中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为计算区域，绿色荧光点为中性粒细胞

可以看到，供试品组斑马鱼的中性粒细胞数目比模型对照组少，与正常对照组相似。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，水溶给予供试品组的斑马鱼中性粒细胞数目比模型对照组少，与正常对照组相似。。

2.本实验证实了该供试品具有抗炎舒缓功效。

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【评价原理】

贫血是外周血红细胞减少。斑马鱼在受精后24 h出现血液循环，可以直接在显微镜下观察到血细胞。造血过程在脊椎动物的进化过程中保守。苯肼作用于红细胞膜，加速膜表面亮氨酸、赖氨酸、组氨酸的水解，同时降低红细胞变形能力，增强红细胞黏附到细胞外基质的能力从而破坏循环血中的成熟红细胞。

经过红细胞特异性染色（呈红色），患有贫血的斑马鱼心脏的血红细胞比正常斑马鱼心脏的血红细胞模型减少，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和补血剂组。其中正常对照组未摄入苯肼，模型对照组与补血剂组都加入了等量的苯肼（苯肼通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用补血剂组在加入苯肼的同时摄入氯生血宁片之类的补血剂。

服用一段时间补血剂后，我们对斑马鱼整体做红细胞特异性染色，观察心脏血红细胞变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼心脏红细胞表型图

绿色虚线区域为心脏红细胞

可以看到，服用预防血栓药物组的心脏情况与未加入苯肼的正常对照组比较相似，没有明显的红细胞减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用补血剂组的心脏红细胞情况与未摄入苯肼的正常对照组比较相似，没有明显的红细胞减少。

2.本实验证实了生血宁片具有补血功效。

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【评价原理】

中枢神经损伤常表现为偏瘫、失语、智力障碍或昏迷，甚至死亡。斑马鱼是一种与人类同源性较高的脊椎动物，大脑具有典型脊椎动物脑部形态学特征，髓鞘结构特征和少突胶质细胞分化过程与哺乳动物高度一致。而且斑马鱼生长发育周期短，神经系统简单，有利于开展中枢神经保护剂的研究。霉酚酸吗啉乙酯可以抑制斑马鱼神经元轴突的生长，干扰神经及细胞的迁移和导致发育畸形，使神经元细胞凋亡。

经过特异性荧光染色（凋亡细胞呈绿色），中枢神经损伤的斑马鱼在脑和脊髓部位会布满凋亡细胞，比正常斑马鱼多很多，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用中枢神经保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用中枢神经保护剂组都摄入了等量的霉酚酸吗啉乙酯（霉酚酸吗啉乙酯通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用中枢神经保护剂组在摄入霉酚酸吗啉乙酯的同时摄入还原型谷胱甘肽、养血清脑颗粒和安宫牛黄丸之类的中枢神经保护剂。

服用中枢神经保护剂一段时间后，我们对斑马鱼整体进行特异性荧光染色，观察中枢神经细胞的凋亡情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼中枢神经保护表型图

黄色虚线区域为中枢神经，绿色光点为凋亡细胞

可以看到，服用中枢神经保护剂组的中枢神经情况与正常对照组比较相似，没有明显的细胞凋亡。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用中枢神经保护剂组的中枢神经情况与正常对照组相似，并未出现模型对照组大量凋亡细胞的情况。

2.本实验证实了还原型谷胱甘肽、养血清脑颗粒和安宫牛黄丸具有明显保护中枢神经作用。

【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位处，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。内毒素（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，我们将其注射到斑马鱼卵黄囊，诱导炎症介质的产生。斑马鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在卵黄囊。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到斑马鱼卵黄囊的中性粒细胞比正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎组。其中正常对照组未注射LPS，模型对照组和抗炎组均注射LPS（LPS通过注射到卵黄囊的方式摄入到斑马鱼体内）。抗炎药组在注射LPS之前摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为卵黄囊，绿色颗粒为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组卵黄囊内中性粒细胞比模型对照组明显，未出现中性粒细胞大量募集情况。

以IL-6、IL-10基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼IL-6基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-6基因表达明显下调。

图3. 斑马鱼IL-10基因相对表达量

与模型对照组比较，***p < 0.001

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-10基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射抗炎药组卵黄囊内中性粒细胞数量比正常对照组略多，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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【评价原理】

斑马鱼作为一种理想的人类血液毒性模型，是以其造血系统与人类造血系统在进化上高度保守性尾前提的。通过与人类造血类似的信号传导通路，斑马鱼形成了以包括红系、髓系、淋系及巨核系为主的造血系统。斑马鱼可建立多种血液系统毒性模型，主要包括红细胞、白细胞、出凝血障碍性毒性三大类，因此主要与斑马鱼中性粒细胞、巨噬细胞、红细胞和血流量相关。由于斑马鱼具有身体积小、实验周期短等优点，可以用作评估血液毒性的一种便捷模型。

转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼中性粒细胞自身发出荧光，可以直接在荧光显微镜下观察中性粒细胞个数；黑色素等位基因突变斑马鱼通体透明，经过巨噬细胞染色后可以直接在显微镜下观察巨噬细胞数量；利用邻联茴香胺将斑马鱼心脏红细胞染色，在显微镜下可以直接观察红细胞数量（信号强度）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组(供试品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内)。

处理结束后，(1)通过荧光显微镜观察并统计斑马鱼中性粒细胞数量；(2)通过染色斑马鱼巨噬观察巨噬细胞细胞数量；(3)通过邻联茴香胺染色心脏部位红细胞，在显微镜下观察心脏红细胞染色强度。

【结果展示】

图1.斑马鱼中性粒细胞表型图

（绿色小点为中性粒细胞）

可以看到，供试品组中性粒细胞个数较正常对照组明显减少。

图2.斑马鱼巨噬细胞表型图

（红色小点为巨噬细胞）

可以看到，供试品组巨噬细胞数量较正常对照组明显减少。

图3.斑马鱼红细胞抑制表型图

（蓝色虚线框内为分析区域,分析红细胞染色强度）

可以看到，供试品组心脏红细胞染色强度较正常对照组明显降低。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，供试品组的中性粒细胞数量、巨噬细胞数量明显减少，红细胞染色强度明显降低。

2.本实验证实了此供试品诱发血液毒性。

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【评价原理】

随着电子产品的广泛使用，用眼的时间和强度已远超过去，用眼过度引起一系列视力问题。研究表明，高度近视、视网膜疾病、白内障、眼干燥关节综合征均与眼细胞凋亡相关。斑马鱼的眼部血管结构跟人非常相似，斑马鱼视网膜结构也跟人高度相似。用霉酚酸吗啉乙酯可以诱发斑马鱼眼细胞凋亡，模拟人的眼部疾病。

用特异性荧光染色（呈绿色），患有眼疾的斑马鱼眼细胞凋亡较正常斑马鱼明显增多，在荧光显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和药物组。其中正常对照组未摄入霉酚酸吗啉乙酯，模型对照组与服用眼保护剂组都摄入了等量的霉酚酸吗啉乙酯（霉酚酸吗啉乙酯通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。眼保护剂组在摄入霉酚酸吗啉乙酯的同时摄入蓝莓叶黄素酯之类的眼保护剂。

服用一段时间眼保护剂后，我们对斑马鱼整体做凋亡细胞特异性染色，观察细胞凋亡，同时制作成病理切片观察眼部的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼眼细胞凋亡表型图

黄色虚线区域为眼，绿色小点为凋亡细胞

可以看到，模型对照组的凋亡细胞较正常对照组明显增多，而眼保护剂组凋亡细胞与正常细胞相似。

图2. 眼部凋亡细胞病理切片

红色箭头指向凋亡细胞

从病理切片中也能看出来，模型对照组出现较多的凋亡细胞，表现为细胞固缩、染色质边集，而眼保护剂组细胞和正常斑马鱼中形态相似。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，眼保护剂组斑马鱼眼细胞与正常对照组相似，并未出现模型对照组的大面积细胞凋亡情况。

2.本实验证实了蓝莓叶黄素酯具有保护视力功效。

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急性毒性试验是了解外源化学物对机体产生急性毒性的根本依据，也是毒理学安全性评价的一步工作，斑马鱼早期发育阶段的胚胎期是其对外界环境敏感的阶段。斑马鱼的急性胚胎毒性对于化妆品的安全性评价具有重要的实际意义。

【评价原理】

将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的受试物溶液，一定时间段后记录斑马鱼胚胎的死亡率，确定50%试验鱼胚胎死亡的受试物浓度，用LC50表示。

【实验方案】

配制一定浓度系列的受试物溶液，在斑马鱼发育初期（4hpf-6hpf）分别水溶加入受试物，同时设置正常对照组，孵育48h后分别观察每组斑马鱼的发育状况，以卵凝结、体节异常、尾部未分离等判定胚胎死亡。记录每组斑马鱼胚胎的死亡率，绘制“浓度-死亡率”效应曲线，计算LC50值。

【结果展示】

1、斑马鱼胚胎死亡判定

图1.斑马鱼胚胎死亡表型图

2、LC50值：“浓度-死亡率”效应曲线

图2. 斑马鱼胚胎“浓度-死亡率”效应曲线

【评价结论】

经过48小时的实验，斑马鱼胚胎随着受试物浓度的增加逐渐出现死亡特征，LC50值为31.5μg/ml。

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