【评价原理】

斑马鱼的鳔从器官进化、组织结构以及生物学等多个层面都类似于哺乳动物的肺泡。

病毒性肺炎：注射给予聚肌胞——poly（i:c）建立斑马鱼病毒性肺炎模型。poly（i:c）的双链RNA结构非常类似于病毒或病毒复制过程中形成的双链RNA，所以poly（i:c）类似某些病毒，具有很强的干扰素诱生作用。

通过使用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼和转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，在荧光显微镜下可以直接观察斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞，并分时间点视频记录巨噬细胞和中性粒细胞溢出血管情况，使用实时荧光定量PCR仪可获得基因表达水平，通过制作组织病理切片观察斑马鱼鱼鳔部位的病理结构变化。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中，模型对照组与抗炎药组都注射了等量的聚肌胞——poly（i:c）建立病毒性肺炎模型。抗炎药组在注射了poly（i:c）的同时摄入吲哚美辛之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们在荧光显微镜下拍摄斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞的数量，并分时间点视频记录巨噬细胞和中性粒细胞溢出血管情况，用实时荧光定量PCR仪检测TNF-α、IL-1β值，同时制作成病理切片观察鱼鳔部位的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼中性粒表型图

黄色虚线区域为鱼鳔，绿色荧光颗粒为中性粒细胞

可以看到，抗炎药组斑马鱼鱼鳔位置处的中性粒细胞聚集情况明显改善。

图2. 斑马鱼巨噬细胞表型图

黄色虚线区域为鱼鳔，绿色荧光为巨噬细胞

可以看到，抗炎药组斑马鱼鱼鳔位置处的巨噬细胞聚集情况明显改善。

图3. TNF-α基因表达水平

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，抗炎药组能显著抑制斑马鱼的炎症基因TNF-α表达水平。

图4. IL-1β基因表达水平

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，抗炎药组能显著抑制斑马鱼的炎症基因IL-1β表达水平。

图5. 鱼鳔部位病理切片

从病理切片中能看出来，抗炎药组斑马鱼鱼鳔病理结构与正常对照组相似，未出现模型对照组渗入的炎性细胞明显增多的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗炎药组与模型对照组比较，能显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞的聚集，能显著抑制炎症基因表达水平，能改善炎性浸润情况。

2.本实验证实了吲哚美辛具有显著的病毒性肺炎防治作用。

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【评价原理】

斑马鱼作为一种理想的人类血液毒性模型，是以其造血系统与人类造血系统在进化上高度保守性尾前提的。通过与人类造血类似的信号传导通路，斑马鱼形成了以包括红系、髓系、淋系及巨核系为主的造血系统。斑马鱼可建立多种血液系统毒性模型，主要包括红细胞、白细胞、出凝血障碍性毒性三大类，因此主要与斑马鱼中性粒细胞、巨噬细胞、红细胞和血流量相关。由于斑马鱼具有身体积小、实验周期短等优点，可以用作评估血液毒性的一种便捷模型。

转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼中性粒细胞自身发出荧光，可以直接在荧光显微镜下观察中性粒细胞个数；黑色素等位基因突变斑马鱼通体透明，经过巨噬细胞染色后可以直接在显微镜下观察巨噬细胞数量；利用邻联茴香胺将斑马鱼心脏红细胞染色，在显微镜下可以直接观察红细胞数量（信号强度）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组(供试品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内)。

处理结束后，(1)通过荧光显微镜观察并统计斑马鱼中性粒细胞数量；(2)通过染色斑马鱼巨噬观察巨噬细胞细胞数量；(3)通过邻联茴香胺染色心脏部位红细胞，在显微镜下观察心脏红细胞染色强度。

【结果展示】

图1.斑马鱼中性粒细胞表型图

（绿色小点为中性粒细胞）

可以看到，供试品组中性粒细胞个数较正常对照组明显减少。

图2.斑马鱼巨噬细胞表型图

（红色小点为巨噬细胞）

可以看到，供试品组巨噬细胞数量较正常对照组明显减少。

图3.斑马鱼红细胞抑制表型图

（蓝色虚线框内为分析区域,分析红细胞染色强度）

可以看到，供试品组心脏红细胞染色强度较正常对照组明显降低。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，供试品组的中性粒细胞数量、巨噬细胞数量明显减少，红细胞染色强度明显降低。

2.本实验证实了此供试品诱发血液毒性。

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【评价原理】

斑马鱼胚胎视力发育迅速，受精后发育4天的幼鱼就已经依赖视觉线索进行捕食和躲避行为。斑马鱼不仅在角膜、晶状体、脉络膜、视网膜以及血管化和神经支配等结构上和人类的眼睛有明显的相似性，而且还有保守的基因表达、细胞构成和组织结构，因此为研究食品及保健品的眼部毒性提供了一个极好的模型。

我们评价斑马鱼眼毒性有4个指标：1.眼睛大小；2.眼部细胞凋亡；3.眼部血管面积；4.眼部病理切片。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组，供试品组（保健食品通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间眼保护剂后，我们在解剖显微镜下观察眼睛大小；整体做凋亡细胞特异性染色，观察眼部细胞凋亡；通过荧光显微镜观察眼部血管面积，同时制作成病理切片观察眼部的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼眼睛表型图

箭头指示区域为眼

可以看到，保健食品组眼睛相较于正常对照组明显减小。

图2. 斑马鱼眼细胞凋亡表型图

黄色虚线区域为眼，绿色小点为凋亡细胞

可以看到，保健食品组的凋亡细胞较正常对照组明显增多。

图3. 斑马鱼眼部血管面积

黄色虚线标记血管面积

可以看到，保健食品组眼睛血管面积相较于正常对照组明显增加。

图4. 眼部凋亡细胞病理切片

可以看到，保健食品组出现较多的凋亡细胞，表现为细胞固缩、染色质边集，视网膜结构异于正常对照组。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，保健食品组斑马鱼眼睛明显变小，凋亡细胞明显增多，眼部血管面积明显增多，在病理切片中出现较多的凋亡细胞，表现为细胞固缩、染色质边集，视网膜结构异常。

2.本实验证实了保健食品的眼毒性。

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【评价原理】

肠道消化是食物在消化道中分解的过程，包括机械性消化（通过消化道肌肉搜索将食物与消化液混合并向消化道远端推送）和化学性消化（通过消化腺分泌的消化酶将大分子分解为小分子物质的过程）。肠道内的消化液包括胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶等。在受精后的26-126 h，斑马鱼肠道的管腔形成，内胚层分化出连续的有功能的肠道上皮。斑马鱼肠道肌肉发达，可分为两层平滑肌，有利于食物的蠕动消化。

通过特异性的检测试剂盒检测OD值，可以量化斑马鱼体内胰脂肪酶和胰蛋白酶含量。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成二组，分别是正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内），加入相应的胰脂肪酶和胰蛋白酶特异性检测试剂。

服用供试品后，我们使用酶标仪对斑马鱼进行OD值的检测。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胰脂肪酶和胰蛋白酶OD值

可以看到，服用供试品组的胰脂肪酶和胰蛋白酶的OD值与正常对照组比较，有显著性提高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组与正常对照组比较胰脂肪酶和胰蛋白酶含量均有明显的升高。

2.本实验证实了供试品具有促进肠道消化功能的作用，主要表现为增加胰脂肪酶和胰蛋白酶的含量。

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化妆品中刺激性物质作用于机体后可能引发机体产生刺激、过敏等一系列的反应，其中主要的是刺激反应，可导致水肿、红斑、瘙痒、疼痛等症状。

化妆品对皮肤的刺激表型主要表现为皮肤炎症，炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进和水肿。

【评价原理】

刺激物进入斑马鱼体内，诱导炎症反应，中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表皮迁移并聚集。通过在荧光显微镜下对斑马鱼皮肤表面的中性粒细胞进行计数，从而反映受试物刺激性强度。

【实验方案】

将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和化妆品组（供试品通过溶解到标准稀释水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

使用化妆品一段时间后，将斑马鱼整体放到荧光显微镜下拍照，以皮肤表面中性粒细胞数量评价化妆品的刺激性。

【结果展示】

图1. 斑马鱼皮肤中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为计算区域

可以看到，化妆品组斑马鱼皮肤表面中性粒细胞数量显著上升。

【评价结论】

1、经过各组斑马鱼的对比实验，化妆品组的斑马鱼皮肤表面中性粒细胞数量明显增多，与正常对照组存在明显的差别。

2、本实验证实了该化妆品对斑马鱼有刺激性。

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【评价原理】

斑马鱼的骨骼看似与人类差别明显，实际上它的生长发育过程和调控机制与哺乳动物高度相似。而且斑马鱼骨骼发育迅速，适合快速建立骨骼疾病模型。在大量摄入糖皮质激素（以泼尼松为例）后，斑马鱼会出现继发性骨质疏松。

骨密度几乎由骨骼中钙含量来反映，应用特异性地结合钙的荧光染料染色（呈绿色），用其荧光强度可反映骨密度。斑马鱼骨骼染色后经荧光显微镜采集到的荧光强度能够客观反映骨密度。

【实验方案】

我们将测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用强健骨骼产品组。其中正常对照组未加入泼尼松，模型对照组与服用强健骨骼产品组加入了等量的泼尼松（泼尼松通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用强健骨骼产品组在加入泼尼松的同时加入碳酸钙、维生素D3之类的强健骨骼产品。

服用一段时间强健骨骼产品后，我们对斑马鱼整体做钙黄绿素染色，观察脊椎骨荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脊椎骨表型图

黄色虚线区域为脊椎骨

可以看到，服用强健骨骼产品的脊椎骨骨密度与正常对照组比较相似，没有明显的骨质疏松。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用强健骨骼产品组的骨密度与未经泼尼松处理的正常对照组相似，并未出现模型对照组的骨质疏松的情况。

2.本实验证实了碳酸钙、维生素D3具有显著的强健骨骼功效。

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【评价原理】

斑马鱼与人类的基因相似率高达87%, 与哺乳类动物相比, 斑马鱼的信号传导以及生理结构和功能方面都非常相似。斑马鱼能够对药物在体内的分布情况、吸收情况、代谢以及排泄等生理动态方面提供准确的信息, 尤其对小分子所引起的内分泌紊乱、再生毒性、行为缺陷、致畸、心血管毒性、肝毒性等毒性反应与人具有高度相似性。因此，使用斑马鱼作为药物早期的安全性评价是非常可靠的。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。通过环特生物剂量换算公式，将人每日推荐服用剂量换算为斑马鱼使用浓度进行安全性评价。

服用一段时间供试品后，我们观察斑马鱼各组织脏器的表型。

【结果展示】

图1. 斑马鱼毒性表型图

J：下颌；E:眼；H：心脏；L：肝脏；In：胃肠道；Y：卵黄囊

可以看到，服用人每日推荐服用剂量的供试品组未见明显异常。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用人每日推荐服用剂量的供试品组未诱发斑马鱼明显的毒性表型，与正常对照组斑马鱼相似。

2.本实验证实了在短期服用时，该供试品以人每日推荐服用剂量使用并未诱发安全性风险。

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【评价原理】

斑马鱼与人类的基因相似率高达87%, 与哺乳类动物相比, 斑马鱼的信号传导以及生理结构和功能方面都非常相似。斑马鱼能够对药物在体内的分布情况、吸收情况、代谢以及排泄等生理动态方面提供准确的信息, 尤其对小分子所引起的内分泌紊乱、再生毒性、行为缺陷、致畸、心血管毒性、肝毒性等毒性反应与人具有高度相似性。因此，使用斑马鱼作为药物早期的安全性评价是非常可靠的。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内）。通过环特生物剂量换算公式，将人每日推荐服用剂量换算为斑马鱼使用浓度进行安全性评价,梯度设置浓度进行安全性评价。

服用一段时间供试品后，我们观察斑马鱼各组织脏器的表型。

【结果展示】

图1. 斑马鱼毒性表型图

J：下颌；E:眼；H：心脏；L：肝脏；In：胃肠道；Y：卵黄囊

可以看到，服用2倍及以下人每日推荐服用剂量的供试品组未见明显异常，服用3倍人每日推荐服用剂量的供试品组诱发斑马鱼肝脏变性和卵黄囊吸收延迟。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用2倍及以下人每日推荐服用剂量的供试品未诱发斑马鱼明显毒性表型，与正常对照组斑马鱼类似；服用3倍人每日推荐服用剂量的供试品诱发斑马鱼明显的肝脏毒性表型。

2.本实验证实了在短期服用中，该供试品应限量使用，否则会出现安全性风险。

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【评价原理】

斑马鱼的听觉外侧系统由内耳和侧线两个关键的感觉结构组成，斑马鱼具有典型的内耳结构，内耳的毛细胞和侧线的毛细胞在结构功能及分子水平上与哺乳动物的内耳毛细胞非常相似，包括对耳毒性药物的相似反应。

经过DASPEI特异性荧光染色（呈绿色），听力损伤的斑马鱼比正常斑马鱼毛细胞明显减少或缺失（荧光减弱或者消失）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体做毛细胞特异性染色，观察毛细胞的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼“浓度-死亡率”效应曲线

供试品最大非致死浓度（MNLC）和LC10

图2. 斑马鱼毛细胞表型图

绿色荧光点为听细胞聚集的神经丘

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼毛细胞减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼毛细胞明显减少，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有听毒性。

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