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【评价原理】
炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位处，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。内毒素（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，我们将其注射到斑马鱼卵黄囊，诱导炎症介质的产生。斑马鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在卵黄囊。
采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到斑马鱼卵黄囊的中性粒细胞比正常斑马鱼明显增多。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎组。其中正常对照组未注射LPS，模型对照组和抗炎组均注射LPS（LPS通过注射到卵黄囊的方式摄入到斑马鱼体内）。抗炎药组在注射LPS之前摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸之类的抗炎药。
服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。
【结果展示】
图1. 斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞表型图
黄色虚线区域为卵黄囊，绿色颗粒为中性粒细胞
可以看到，服用/注射抗炎药组卵黄囊内中性粒细胞比模型对照组明显，未出现中性粒细胞大量募集情况。
以IL-6、IL-10基因为例，提供柱状图。
图2. 斑马鱼IL-6基因相对表达量
与模型对照组比较，**p < 0.01
可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-6基因表达明显下调。
图3. 斑马鱼IL-10基因相对表达量
与模型对照组比较，***p < 0.001
可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-10基因表达明显下调。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射抗炎药组卵黄囊内中性粒细胞数量比正常对照组略多，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。
2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。
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【评价原理】
斑马鱼作为一种理想的人类血液毒性模型，是以其造血系统与人类造血系统在进化上高度保守性尾前提的。通过与人类造血类似的信号传导通路，斑马鱼形成了以包括红系、髓系、淋系及巨核系为主的造血系统。斑马鱼可建立多种血液系统毒性模型，主要包括红细胞、白细胞、出凝血障碍性毒性三大类，因此主要与斑马鱼中性粒细胞、巨噬细胞、红细胞和血流量相关。由于斑马鱼具有身体积小、实验周期短等优点，可以用作评估血液毒性的一种便捷模型。
转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼中性粒细胞自身发出荧光，可以直接在荧光显微镜下观察中性粒细胞个数；黑色素等位基因突变斑马鱼通体透明，经过巨噬细胞染色后可以直接在显微镜下观察巨噬细胞数量；利用邻联茴香胺将斑马鱼心脏红细胞染色，在显微镜下可以直接观察红细胞数量（信号强度）。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组(供试品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内)。
处理结束后，(1)通过荧光显微镜观察并统计斑马鱼中性粒细胞数量；(2)通过染色斑马鱼巨噬观察巨噬细胞细胞数量；(3)通过邻联茴香胺染色心脏部位红细胞，在显微镜下观察心脏红细胞染色强度。
【结果展示】
图1.斑马鱼中性粒细胞表型图
（绿色小点为中性粒细胞）
可以看到，供试品组中性粒细胞个数较正常对照组明显减少。
图2.斑马鱼巨噬细胞表型图
（红色小点为巨噬细胞）
可以看到，供试品组巨噬细胞数量较正常对照组明显减少。
图3.斑马鱼红细胞抑制表型图
（蓝色虚线框内为分析区域,分析红细胞染色强度）
可以看到，供试品组心脏红细胞染色强度较正常对照组明显降低。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，供试品组的中性粒细胞数量、巨噬细胞数量明显减少，红细胞染色强度明显降低。
2.本实验证实了此供试品诱发血液毒性。
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【评价原理】
随着电子产品的广泛使用，用眼的时间和强度已远超过去，用眼过度引起一系列视力问题。研究表明，高度近视、视网膜疾病、白内障、眼干燥关节综合征均与眼细胞凋亡相关。斑马鱼的眼部血管结构跟人非常相似，斑马鱼视网膜结构也跟人高度相似。用霉酚酸吗啉乙酯可以诱发斑马鱼眼细胞凋亡，模拟人的眼部疾病。
用特异性荧光染色（呈绿色），患有眼疾的斑马鱼眼细胞凋亡较正常斑马鱼明显增多，在荧光显微镜下可以观察到。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和药物组。其中正常对照组未摄入霉酚酸吗啉乙酯，模型对照组与服用眼保护剂组都摄入了等量的霉酚酸吗啉乙酯（霉酚酸吗啉乙酯通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。眼保护剂组在摄入霉酚酸吗啉乙酯的同时摄入蓝莓叶黄素酯之类的眼保护剂。
服用一段时间眼保护剂后，我们对斑马鱼整体做凋亡细胞特异性染色，观察细胞凋亡，同时制作成病理切片观察眼部的病理结构变化。
【结果展示】
图1. 斑马鱼眼细胞凋亡表型图
黄色虚线区域为眼，绿色小点为凋亡细胞
可以看到，模型对照组的凋亡细胞较正常对照组明显增多，而眼保护剂组凋亡细胞与正常细胞相似。
图2. 眼部凋亡细胞病理切片
红色箭头指向凋亡细胞
从病理切片中也能看出来，模型对照组出现较多的凋亡细胞，表现为细胞固缩、染色质边集，而眼保护剂组细胞和正常斑马鱼中形态相似。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，眼保护剂组斑马鱼眼细胞与正常对照组相似，并未出现模型对照组的大面积细胞凋亡情况。
2.本实验证实了蓝莓叶黄素酯具有保护视力功效。
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急性毒性试验是了解外源化学物对机体产生急性毒性的根本依据，也是毒理学安全性评价的一步工作，斑马鱼早期发育阶段的胚胎期是其对外界环境敏感的阶段。斑马鱼的急性胚胎毒性对于化妆品的安全性评价具有重要的实际意义。
【评价原理】
将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的受试物溶液，一定时间段后记录斑马鱼胚胎的死亡率，确定50%试验鱼胚胎死亡的受试物浓度，用LC50表示。
【实验方案】
配制一定浓度系列的受试物溶液，在斑马鱼发育初期（4hpf-6hpf）分别水溶加入受试物，同时设置正常对照组，孵育48h后分别观察每组斑马鱼的发育状况，以卵凝结、体节异常、尾部未分离等判定胚胎死亡。记录每组斑马鱼胚胎的死亡率，绘制“浓度-死亡率”效应曲线，计算LC50值。
【结果展示】
1、斑马鱼胚胎死亡判定
图1.斑马鱼胚胎死亡表型图
2、LC50值：“浓度-死亡率”效应曲线
图2. 斑马鱼胚胎“浓度-死亡率”效应曲线
【评价结论】
经过48小时的实验，斑马鱼胚胎随着受试物浓度的增加逐渐出现死亡特征，LC50值为31.5μg/ml。
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【评价原理】
斑马鱼的听觉外侧系统由内耳和侧线两个关键的感觉结构组成，斑马鱼具有典型的内耳结构，内耳的毛细胞和侧线的毛细胞在结构功能及分子水平上与哺乳动物的内耳毛细胞非常相似，包括对耳毒性药物的相似反应。
经过DASPEI特异性荧光染色（呈绿色），听力损伤的斑马鱼比正常斑马鱼毛细胞明显减少或缺失（荧光减弱或者消失）。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。
服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体做毛细胞特异性染色，观察毛细胞的变化。
【结果展示】
图1. 斑马鱼“浓度-死亡率”效应曲线
供试品最大非致死浓度（MNLC）和LC10
图2. 斑马鱼毛细胞表型图
绿色荧光点为听细胞聚集的神经丘
可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼毛细胞减少。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼毛细胞明显减少，与正常对照组存在明显的差别。
2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有听毒性。
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【评价原理】
斑马鱼胚胎视力发育迅速，受精后发育4天的幼鱼就已经依赖视觉线索进行捕食和躲避行为。斑马鱼不仅在角膜、晶状体、脉络膜、视网膜以及血管化和神经支配等结构上和人类的眼睛有明显的相似性，而且还有保守的基因表达、细胞构成和组织结构，因此为研究食品及保健品的眼部毒性提供了一个极好的模型。
我们评价斑马鱼眼毒性有4个指标：1.眼睛大小；2.眼部细胞凋亡；3.眼部血管面积；4.眼部病理切片。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组，供试品组（保健食品通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内）。
服用一段时间眼保护剂后，我们在解剖显微镜下观察眼睛大小；整体做凋亡细胞特异性染色，观察眼部细胞凋亡；通过荧光显微镜观察眼部血管面积，同时制作成病理切片观察眼部的病理结构变化。
【结果展示】
图1. 斑马鱼眼睛表型图
箭头指示区域为眼
可以看到，保健食品组眼睛相较于正常对照组明显减小。
图2. 斑马鱼眼细胞凋亡表型图
黄色虚线区域为眼，绿色小点为凋亡细胞
可以看到，保健食品组的凋亡细胞较正常对照组明显增多。
图3. 斑马鱼眼部血管面积
黄色虚线标记血管面积
可以看到，保健食品组眼睛血管面积相较于正常对照组明显增加。
图4. 眼部凋亡细胞病理切片
可以看到，保健食品组出现较多的凋亡细胞，表现为细胞固缩、染色质边集，视网膜结构异于正常对照组。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，保健食品组斑马鱼眼睛明显变小，凋亡细胞明显增多，眼部血管面积明显增多，在病理切片中出现较多的凋亡细胞，表现为细胞固缩、染色质边集，视网膜结构异常。
2.本实验证实了保健食品的眼毒性。
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【评价原理】
肠道消化是食物在消化道中分解的过程，包括机械性消化（通过消化道肌肉搜索将食物与消化液混合并向消化道远端推送）和化学性消化（通过消化腺分泌的消化酶将大分子分解为小分子物质的过程）。肠道内的消化液包括胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶等。在受精后的26-126 h，斑马鱼肠道的管腔形成，内胚层分化出连续的有功能的肠道上皮。斑马鱼肠道肌肉发达，可分为两层平滑肌，有利于食物的蠕动消化。
通过特异性的检测试剂盒检测OD值，可以量化斑马鱼体内胰脂肪酶和胰蛋白酶含量。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成二组，分别是正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内），加入相应的胰脂肪酶和胰蛋白酶特异性检测试剂。
服用供试品后，我们使用酶标仪对斑马鱼进行OD值的检测。
【结果展示】
图1. 斑马鱼胰脂肪酶和胰蛋白酶OD值
可以看到，服用供试品组的胰脂肪酶和胰蛋白酶的OD值与正常对照组比较，有显著性提高。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组与正常对照组比较胰脂肪酶和胰蛋白酶含量均有明显的升高。
2.本实验证实了供试品具有促进肠道消化功能的作用，主要表现为增加胰脂肪酶和胰蛋白酶的含量。
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化妆品中刺激性物质作用于机体后可能引发机体产生刺激、过敏等一系列的反应，其中主要的是刺激反应，可导致水肿、红斑、瘙痒、疼痛等症状。
化妆品对皮肤的刺激表型主要表现为皮肤炎症，炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进和水肿。
【评价原理】
刺激物进入斑马鱼体内，诱导炎症反应，中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表皮迁移并聚集。通过在荧光显微镜下对斑马鱼皮肤表面的中性粒细胞进行计数，从而反映受试物刺激性强度。
【实验方案】
将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和化妆品组（供试品通过溶解到标准稀释水中的方式摄入到斑马鱼体内）。
使用化妆品一段时间后，将斑马鱼整体放到荧光显微镜下拍照，以皮肤表面中性粒细胞数量评价化妆品的刺激性。
【结果展示】
图1. 斑马鱼皮肤中性粒细胞表型图
黄色虚线区域为计算区域
可以看到，化妆品组斑马鱼皮肤表面中性粒细胞数量显著上升。
【评价结论】
1、经过各组斑马鱼的对比实验，化妆品组的斑马鱼皮肤表面中性粒细胞数量明显增多，与正常对照组存在明显的差别。
2、本实验证实了该化妆品对斑马鱼有刺激性。
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【评价原理】
肠道消化是食物在消化道中分解的过程，包括机械性消化（通过消化道肌肉搜索将食物与消化液混合并向消化道远端推送）和化学性消化（通过消化腺分泌的消化酶将大分子分解为小分子物质的过程）。肠道内的消化液包括胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶等。在受精后的26-126 h，斑马鱼肠道的管腔形成，内胚层分化出连续的有功能的肠道上皮。斑马鱼肠道肌肉发达，可分为两层平滑肌，有利于食物的蠕动消化。
通过特异性的检测试剂盒检测OD值，可以量化斑马鱼体内胰脂肪酶和胰蛋白酶含量。
【实验方案】
我们将受测试斑马鱼分成二组，分别是正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内），加入相应的胰脂肪酶和胰蛋白酶特异性检测试剂。
服用供试品后，我们使用酶标仪对斑马鱼进行OD值的检测。
【结果展示】
图1. 斑马鱼胰脂肪酶和胰蛋白酶OD值
可以看到，服用供试品组的胰脂肪酶和胰蛋白酶的OD值与正常对照组比较，有显著性提高。
【评价结论】
1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组与正常对照组比较胰脂肪酶和胰蛋白酶含量均有明显的升高。
2.本实验证实了供试品具有促进肠道消化功能的作用，主要表现为增加胰脂肪酶和胰蛋白酶的含量。
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