【评价原理】

斑马鱼的骨骼看似与人类差别明显，实际上它的生长发育过程和调控机制与哺乳动物高度相似。而且斑马鱼骨骼发育迅速，适合快速建立骨骼疾病模型。在大量摄入糖皮质激素（以泼尼松为例）后，斑马鱼会出现继发性骨质疏松。

骨密度几乎由骨骼中钙含量来反映，应用特异性地结合钙的荧光染料染色（呈绿色），用其荧光强度可反映骨密度。斑马鱼骨骼染色后经荧光显微镜采集到的荧光强度能够客观反映骨密度。

【实验方案】

我们将测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用强健骨骼产品组。其中正常对照组未加入泼尼松，模型对照组与服用强健骨骼产品组加入了等量的泼尼松（泼尼松通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用强健骨骼产品组在加入泼尼松的同时加入碳酸钙、维生素D3之类的强健骨骼产品。

服用一段时间强健骨骼产品后，我们对斑马鱼整体做钙黄绿素染色，观察脊椎骨荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脊椎骨表型图

黄色虚线区域为脊椎骨

可以看到，服用强健骨骼产品的脊椎骨骨密度与正常对照组比较相似，没有明显的骨质疏松。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用强健骨骼产品组的骨密度与未经泼尼松处理的正常对照组相似，并未出现模型对照组的骨质疏松的情况。

2.本实验证实了碳酸钙、维生素D3具有显著的强健骨骼功效。

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雌激素是一类固醇激素，目前已成为一种新兴的污染物。一些无良商家为片面追求功效而在护肤产品中违规添加，导致很多女性因使用了此类护肤品而出现“激素脸”，表现为面部翻红、发痒、干燥脱皮，甚至烂脸流脓。

环特生物应用诺贝尔奖技术——荧光蛋白基因转移技术，可实现对化妆品中雌激素类化学物质的直观、精确和高效的检测评价。

【评价原理】

通过转基因标记表达的绿色荧光蛋白含量来反映雌激素含量，绿色荧光蛋白特异性地在肝脏进行表达，一旦供试品中含有雌激素类化学物质，转基因斑马鱼暴露后肝脏部位会出现特异性绿色荧光，可用绿色荧光量化供试品中的雌激素含量，从而达到评价效果。

【实验方案】

我们将受试的斑马鱼分为两组，分别为正常对照组和供试品组。在相同的温、湿度条件下培育一段时间后，在显微镜下对肝脏部位的绿色荧光进行量化分析。

【结果展示】

 图1. 雌激素处理后斑马鱼荧光表型图

可以看到，用供试品处理后的斑马鱼在肝脏部位显示明显的绿色荧光。

【评价结论】

1、经过各组斑马鱼的对比实验，雌激素处理组斑马鱼的肝脏部位出现明显的绿色荧光，与正常对照组存在明显的差别；

2、本实验说明供试品中存在雌激素类有害物质。

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【评价原理】

斑马鱼的鳔从器官进化、组织结构以及生物学等多个层面都类似于哺乳动物的肺泡。

病毒性肺炎：注射给予聚肌胞——poly（i:c）建立斑马鱼病毒性肺炎模型。poly（i:c）的双链RNA结构非常类似于病毒或病毒复制过程中形成的双链RNA，所以poly（i:c）类似某些病毒，具有很强的干扰素诱生作用。

通过使用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼和转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，在荧光显微镜下可以直接观察斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞，并分时间点视频记录巨噬细胞和中性粒细胞溢出血管情况，使用实时荧光定量PCR仪可获得基因表达水平，通过制作组织病理切片观察斑马鱼鱼鳔部位的病理结构变化。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中，模型对照组与抗炎药组都注射了等量的聚肌胞——poly（i:c）建立病毒性肺炎模型。抗炎药组在注射了poly（i:c）的同时摄入吲哚美辛之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们在荧光显微镜下拍摄斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞的数量，并分时间点视频记录巨噬细胞和中性粒细胞溢出血管情况，用实时荧光定量PCR仪检测TNF-α、IL-1β值，同时制作成病理切片观察鱼鳔部位的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼中性粒表型图

黄色虚线区域为鱼鳔，绿色荧光颗粒为中性粒细胞

可以看到，抗炎药组斑马鱼鱼鳔位置处的中性粒细胞聚集情况明显改善。

图2. 斑马鱼巨噬细胞表型图

黄色虚线区域为鱼鳔，绿色荧光为巨噬细胞

可以看到，抗炎药组斑马鱼鱼鳔位置处的巨噬细胞聚集情况明显改善。

图3. TNF-α基因表达水平

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，抗炎药组能显著抑制斑马鱼的炎症基因TNF-α表达水平。

图4. IL-1β基因表达水平

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，抗炎药组能显著抑制斑马鱼的炎症基因IL-1β表达水平。

图5. 鱼鳔部位病理切片

从病理切片中能看出来，抗炎药组斑马鱼鱼鳔病理结构与正常对照组相似，未出现模型对照组渗入的炎性细胞明显增多的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗炎药组与模型对照组比较，能显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞的聚集，能显著抑制炎症基因表达水平，能改善炎性浸润情况。

2.本实验证实了吲哚美辛具有显著的病毒性肺炎防治作用。

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【评价原理】

神经毒性通常指某些药物影响机体的神经传导，导致神经传导中断或减弱，从而影响机体的正常功能。斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，神经系统形成过程和发育机制与人类高度相似，在6 hpf（受精后6小时）神经系统开始发育，受精6天后所有神经系统发育完成。斑马鱼在短时间内形成整个神经系统，为神经毒性的评价带来了有利的条件。而且斑马鱼对药物神经毒性的预测准确性高，同时兼具快速、高效、经济的优点。

我们评价斑马鱼神经毒性有3个指标：1.行为学；2.中枢神经凋亡细胞荧光信号强度；3. 外周运动神经长度。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们观察斑马鱼的运动行为，通过荧光染色观察中枢神经凋亡细胞，也可以利用转基因运动神经绿色荧光NBT品系斑马鱼观察外周运动神经长度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼神经毒性运动轨迹图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼运动明显减少。

图2. 斑马鱼光暗刺激下每分钟运动速度表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼对光暗刺激不敏感。

图3. 斑马鱼中枢神经凋亡细胞表型图

黄色虚线框内为中枢神经分析区域，绿色荧光小点为凋亡细胞

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼中枢神经细胞凋亡明显增加。

图4. 斑马鱼外周运动神经表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼外周运动神经明显缩短。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼运动明显减少且对光暗刺激不敏感，中枢神经细胞凋亡增加且外周运动神经缩短，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有神经毒性。

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过敏反应通常会引起许多皮肤症状，比如皮肤发红、发痒，严重的患者还会出现刺痛或者面部出现红斑、风团、丘疹或丘疱疹等症状。敏感性肌肤的人群选用化妆品时，需要特别关注化妆品的致敏性。通过斑马鱼技术可以有效评价化妆品及其原料的致敏性。

【评价原理】

过敏反应的主要原因是过敏原/致敏因子诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放多种活性介质进而诱发各种过敏症状。其中类胰蛋白酶是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是临床上检验人体是否过敏的重要指标。斑马鱼产生过敏反应时，同样会诱导肥大细胞分泌类胰蛋白酶。因此，通过检测斑马鱼整体类胰蛋白酶水平可以判断化妆品及其原料的致敏性。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成若干组组，包含正常对照组和化妆品组。其中正常对照组未加入化妆品，化妆品组分别加入不同剂量（化妆品通过溶解到标准稀释水中的方式添加到实验体系中）的样品。

处理24 h后，利用酶标仪检测各组吸光度值（OD值），以类胰蛋白酶的表达水平评价化妆品致敏作用。

此外，可以通过斑马鱼病理切片，用PAS染色后观察肠道壁上肥大细胞的状况反映化妆品的致敏性。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 斑马鱼类胰蛋白酶含量（吸光度值）

与正常对照组比较，*p < 0.05，***p < 0.001

可以看到，化妆品中剂量和高剂量组类胰蛋白酶含量与正常对照组比较明显升高，具有致敏性，低剂量组无致敏性。

图2. 斑马鱼体内肥大细胞染色典型图（箭头指示为肥大细胞）

从经过PAS染色的病理切片中也能看出来，化妆品组斑马鱼的肠道壁上的肥大细胞与正常对照组相比数量明显增加。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，化妆品中、高剂量组斑马鱼类胰蛋白酶含量和肠道壁上的肥大细胞数量与正常对照组相比数量明显增加。

2.本实验证实了该化妆品具有明显的致敏作用。

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【评价原理】

脑出血是指非外伤性脑实质内部血管破裂引发的脑内出血病症，占全部脑卒中的20%～30%，急性期病死率为30%～40%。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 ( HMGCR) 是他汀类药物发挥抑制作用的直接作用点, HMGCR功能被抑制会影响血管的完整性和稳定性，诱发脑出血。由于斑马鱼大脑具有典型脊椎动物脑部形态学特征，血管与神经系统在分子信号通路上与人和哺乳动物的同源性达到85%以上。在大量摄入辛伐他汀后，斑马鱼脑部也会出现脑出血的情况，患有脑出血的斑马鱼的脑部会出现明显的片状出血，而正常斑马鱼没有；由于脑出血斑马鱼的心搏输出量和血流速度也会降低，利用血流分析仪可明显观察到。脑出血可直接造成反应迟钝、运动功能障碍，可通过行为分析软件观察斑马鱼的行为轨迹。

我们评价斑马鱼脑出血有4个指标：1.脑出血发生率；2.心搏输出量；3. 血流速度；4. 行为学（运动改善）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用脑血管保护剂组。其中正常对照组未摄入辛伐他汀，模型对照组与服用脑血管保护剂组都摄入了等量的辛伐他汀（辛伐他汀通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用脑血管保护剂组在摄入辛伐他汀的同时摄入淫羊藿苷之类的脑血管保护剂。

服用脑血管保护剂一段时间后，我们对斑马鱼脑部出血、心搏输出、血流速度和行为学（运动改善）情况进行观察。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脑出血表型图

黄色虚线区域为脑出血区域

可以看到，服用脑血管保护剂组的斑马鱼头部情况与正常对照组比较相似，没有明显的脑出血现象。

图2. 斑马鱼心搏输出量

与模型对照组比较，*** p< 0.001

可以看到，服用脑血管保护剂组的斑马鱼心搏输出量与模型对照组比较明显增加。

图3. 斑马鱼血流速度

与模型对照组比较，*** p< 0.001

可以看到，服用脑血管保护剂组的斑马鱼血流速度与模型对照组比较明显增加。

图4 .斑马鱼运动轨迹图

（黑线：斑马鱼慢速运动轨迹；绿线：中速运动；红线：快速运动）

可以看到，模型对照组斑马鱼总运动距离较正常对照组明显减少，而服用脑血管保护剂组斑马鱼运动功能得到明显改善。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用脑血管保护剂组的斑马鱼脑部情况与未摄入辛伐他汀的正常对照组相似，并未出现模型对照组明显的脑出血的情况；服用脑血管保护剂组的与模型对照组比较，心搏输出量明显增多、血流速度明显加快、运动功能得到明显改善。

2.本实验证实了淫羊藿苷具有显著的防治脑出血作用。

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【评价原理】

斑马鱼肾脏的肾小球具有与高等脊椎动物肾脏同样的细胞组成，同样的血液滤过、肾小管重吸收功能，一旦肾功能损伤或缺失，斑马鱼就会因无法调节渗透压而产生严重的水肿，同时可能导致肾小球滤过功能下降。

因此，我们可以用两种方法评价肾脏毒性：1. 肾性水肿发生率。由于斑马鱼通体透明，肾性水肿可以明显的被观察到。2. 肾小球滤过率。我们可以对斑马鱼注射一种荧光标记物，一段时间后，正常斑马鱼可将荧光标记物排出体外，而肾小球滤过功能损伤的斑马鱼则不能，通过荧光标记物排泄的情况可以反应斑马鱼肾脏的功能。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼表型进行观察评价，统计肾性水肿发生情况

【结果展示】

图1. 斑马鱼肾脏毒性表型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼出现了明显的肾性水肿的表型。

图2. 斑马鱼肾小球滤过率典型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼荧光强度明显强于正常对照组，标记物排泄明显减少，肾小球滤过率下降，肾脏功能受损。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼有明显的肾性水肿和肾小球滤过率明显下降，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验说明该供试品对斑马鱼有肾脏毒性。

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【评价原理】

斑马鱼的胃肠道在细胞功能和解剖学方面均与人类相似，由内皮细胞、结缔组织、外纵肌和环状肌组成。胚胎发育至26～126 hpf( hours post fertilization，受精后小时)，斑马鱼胃肠道的管腔形成并不断生长，形成有功能的肠道上皮。在未喂食情况下，斑马鱼胚胎受精约72 hpf，肠道首次出现不稳定的自发收缩。伴随着发育的进行，第120～144 hpf，斑马鱼大部分的卵黄囊被吸收，肠道自发的蠕动及摄食能力增强。

我们评价斑马鱼胃肠道毒性有2个指标：1.胃肠道形态的变化；2.肠蠕动功能抑制。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。摄入供试品之前提前给予食物，摄入供试品一段时间后，我们观察斑马鱼肠道表型。

服用一段时间供试品后，我们观察胃肠道形态及内容物的情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胃肠道形态表型图

可以看到，服用/注射供试品组可见明显肠褶皱缺失、肠腔异常等。

图2. 斑马鱼肠蠕动功能抑制表型图

可以看到，斑马鱼给予食物后，食物充盈肠道。服用/注射供试品组食物明显多于正常对照组，表明肠蠕动功能被抑制。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼胃肠道形态与正常对照组比较，发生了明显的变化，且肠道蠕动功能被抑制。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有胃肠道毒性。

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【评价原理】

免疫毒性是指化合物对机体免疫系统的损伤作用，包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反应性过度增强，可能包括免疫性产生，过敏反应（超敏反应或变态反应）、自身免疫反应以及不良免疫刺激等。

斑马鱼具有先天免疫系统和获得性免疫系统，与果蝇和线虫模型相比，斑马鱼的免疫系统发育的更完整。研究证实斑马鱼与哺乳动物一样，具有T细胞、B细胞、自然杀伤细胞，其免疫系统对于环境中的免疫毒性物质（包括哺乳动物）非常的敏感。

免疫毒性指标有3个：（1）应用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，观察中性粒细胞数量；（2）应用转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，观察巨噬细胞数量（荧光强度）；（3）注射红色荧光微球，巨噬细胞吞噬微球排出体外，用体内微球的数量反映巨噬细胞吞噬功能。（4）检测T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成二组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，我们对斑马鱼检测中性粒细胞和巨噬细胞计数、巨噬细胞吞噬功能和T/B相关基因（rag1和rag2）表达。

【结果展示】

（1）中性粒细胞数量 

图1. 斑马鱼中性粒细胞表型图

绿色小点为中性粒细胞

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内中性粒细胞数量比正常对照组明显减少。

（2）巨噬细胞数量

图2. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内巨噬细胞数量比正常对照组明显减少。

（3）巨噬细胞吞噬功能

图3. 斑马鱼巨噬细胞表型图

可以看到，服用供试品组的吞噬颗粒的巨噬细胞数量与正常对照组比较有明显减少，说明巨噬细胞吞噬功能下降。

（4）T/B相关基因表达（rag1和rag2）

图4. 斑马鱼rag1和rag2表达

左图为rag1基因相对表达量，右图为rag2基因相对表达量

可以看到，服用供试品组的rag1和rag2相对表达量与正常对照组比较均有减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的中性粒细胞和巨噬细胞数量与正常对照组比较均有减少，其巨噬细胞吞噬功能有所下降，且rag1和rag2相对表达量减少。

2.本实验证实了该供试品具有免疫毒性。

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【评价原理】

斑马鱼和哺乳动物的心脏有相似的功能，包括血流方向、由专门的心内膜肌肉组织驱动的高压系统、由电子系统调节的心律以及与起搏活动相关的心跳。而且斑马鱼幼鱼通体透明，血细胞在心脏和血液循环系统的堆积非常容易观察，因而利用斑马鱼模型研究心血管毒性极为方便。

我们评价斑马鱼心血管毒性有4个指标：1.心率；2.心节律；3.心包水肿面积；4.静脉瘀血面积。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼的心脏进行观察评价。

【结果展示】

图1. 斑马鱼心血管毒性表型图

红色虚线框内为心脏

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼出现明显的心包水肿。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼出现明显的心包水肿，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有心血管毒性。

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