实验试剂 PBS，0.5%Triton X-100(DPBS配)，3%H2 O2 ，封闭血清 (5%正常二抗血清DPBS液)，一抗(PBS配，滴度1：200，湿盒)，二抗工作液(湿盒)，C液(湿盒)，DAB显色液，苏木素，树胶实验设备 20mm盖玻片，90mm培养皿，电子显微镜实验步骤 1. 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2×104 /ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。2. PBS清洗标本 3次各 1 min。3. 冰丙酮固定 15 min。4. 空气干燥 5min。5. PBS清洗标本 3次各 2 min。6. 0.5%Triton X-100(DPBS配) 孵育 1次 20 min。7. PBS清洗标本 3次各 2 min。8. 3%H2 O2 孵育 15 min。9. DPBS清洗标本 3次各 2 min。10. 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液)20min。11. 一抗孵育(PBS配，滴度1：200，湿盒)4℃过夜或37℃ 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液12. PBS清洗标本 3次各 5 min。13. 二抗工作液孵育(湿盒) 37℃，30 min。14. PBS清洗标本 3次各 5 min。15. C液(湿盒) 37℃，30 min。16. PBS清洗标本 3次各 5 min。17. DAB显色(避光，镜下观察至棕色)约3~10min。18. 蒸馏水洗 2次 1 min。19. 苏木素复染 0.5~1min。20. 自来水洗 30min。21. 树胶封片。注意事项 1. 良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意：   1) 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片；   2) 接种的细胞密度适中，以2×104 /ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2. 冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4℃冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。3. 冲洗时只须轻轻振荡培养皿，(不可用吸管太用力吹，易脱片)。4. 加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜。5. Triton X-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。 

SYBR Green染料法相对定量SYBR Green染料法：荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。我们公司供利用荧光定量PCR的方法对样品中的基因表达情况进行相对定量或绝对定量分析的技术服务。相对定量 (mRNA表达量分析)：基因表达的研究一般采用相对定量的方法。相对定量法必须对样品的目的基因和内参基因同时分别进行定量，然后求出对于内参基因的目的基因的相对量。通过对样品间的目的基因的相对量进行比较，可以对不同样品间的mRNA进行表达量分析。内参基因通常选用表达量相对恒定的Housekeeping Gene，如：GAPDH、β-actin等。通过同时对内参基因的实时检测，可以对样品之间由于起始细胞数不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量误差进行校正，达到在严格意义上对样品之间的mRNA表达量进行分析之目的。

实时荧光定量PCR的化学原理1、染料法：SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I不能发出荧光，一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。2、探针法：TaqMan 探针法是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。PCR实验流程一、引物设计二、RNA提取三、CDNA逆转录四、PCR扩增五、数据导出和分析客户需要提供；基本检测信息：1、样本类型（组织、血液、细胞、DNA、RNA、cDNA）及种属；实验的目的（靶基因的mRNA、MicroRNA或lncRNA定量、单核苷酸多态性分析、甲基化检测）；需要检测基因的中英文名称。2、样本量：PCR检测样本根据不同组织中DNA和RNA丰度高低，所需要的样本量也不同，一般组织样本不低于50mg、细胞样本不低于10^5，全血样本不少于300ul就可以检测多个基因；（建议动物组织或临床样本每组不低于6例，细胞样本建议做三复孔（提取逆转录后扩增时同一样本加三个平行孔），便于统计分析）实验周期：PCR实验周期为10个工作日实验外包:1.基因组学：基因芯片、SNP检测、DNA甲基化检测、生物信息学分析2.转录组学：microRNA芯片、LncRNA芯片、表达谱芯片、RNA-seq3.蛋白质组学：2D-DIGE、SILAC、iTRAQ、TMT、Label-free、MRM4.基因检测：DNA/RNA提取、RT-PCR、Real-timePCR5.蛋白质检测：Western blot、Co-ip  EMSA、CHIP、免疫荧光、ELISA6.病理检测：HE染色、特殊染色、组织切片、免疫组化、流式细胞分选7.代谢组学：GC-MS、LC-MS、NMR8.细胞及动物模型：原代细胞、细胞模型、动物模型构建9.SCI论文：SCI论文评估建议、SCI论文设计咨询、SCI论文统计资料处理、SCI论文实验操作咨询、SCI论文编修翻译等

碱性磷酸酶染色（NAP）在临床的应用基本属于常规筛查的染色法。原理（偶氮偶联法）：血细胞内的碱性磷酸酶在pH 9.4～9.6的条件下将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。

一、油红O染色服务介绍油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪呈橘红色，常利用油红O染色显示组织内的脂肪。二、油红O染色服务内容1、样本固定 加10%中性甲醛固定30min，固定细胞膜；2、加入油红工作液，染色10min左右，加的体积覆盖住板底即可；3、脱色，用75%酒精漂洗，除去多余的染料；4、甘油明胶封片(封片后可长期保存)；5、显微镜观察三、油红O染色服务说明1、组织样本：石蜡切片：甲醛固定的组织样本4度运输；冰冻切片：新鲜组织样本，干冰运输；2、细胞样本：25T细胞培养瓶，灌满培养基新鲜运输或提供细胞冻存管，干冰运输；3、若客户已包埋好蜡块或制备好切片，可以提供；4、 若另有疑问欢迎向本公司咨询，我们将竭诚为您服务。 四、质量承诺1、真实的原始实验数据；2、权威的实验报告；3、详细的实验步骤。4、清晰的原始图片。5、实验结果的详情分析；五、实验结果展示

细胞粘附是指细胞之间及细胞与细胞外基质之间的粘附。细胞粘附是维持形态结构与功能的生物现象，是细胞间信息交流的一种形式。而信息交流的可溶递质称细胞粘附分子(Cell Adhesion Molecule，CAM)。CAM是一类独立的分子结构，是通过识别与其粘附的特异性受体而发生相互间的粘附现象。细胞的生长、发育、分化及代谢状态和外界细胞因子、免疫、动脉粥样硬化、炎症介质反应等均可影响细胞粘附，细胞粘附也可能是肿瘤细胞易发生浸润、转移等现象的分子基础。样本的保存与运输复苏好的细胞，灌满培养基常温运输；冻存细胞液氮保存运输；实验外包: 1.基因组学：基因芯片、SNP检测、DNA甲基化检测、生物信息学分析2.转录组学：microRNA芯片、LncRNA芯片、表达谱芯片、RNA-seq3.蛋白质组学：2D-DIGE、SILAC、iTRAQ、TMT、Label-free、MRM4.基因检测：DNA/RNA提取、RT-PCR、Real-timePCR5.蛋白质检测：Western blot、Co-ip  EMSA、CHIP、免疫荧光、ELISA6.病理检测：HE染色、特殊染色、组织切片、免疫组化、流式细胞分选7.代谢组学：GC-MS、LC-MS、NMR8.细胞及动物模型：原代细胞、细胞模型、动物模型构建9.SCI论文：SCI论文评估建议、SCI论文设计咨询、SCI论文统计资料处理、SCI论文实验操作咨询、SCI论文编修翻译等

实验原理免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查组织内的相应抗原（或抗体）。在组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。免疫荧光技术分直接法、间接法和补体法，最常见的为间接法。实验步骤（1）石蜡切片脱蜡至水，或者制作的冰冻切片用冷丙酮在4℃固定10－20分钟；（2）抗原修复，冰冻切片无需修复；（3）用0.01M PBST漂洗3次，每次5 min；（4）滴加正常的血清室温封闭30 min；（5）加未标记的特异性抗体，4℃过夜；（6）用0.01M PBST漂洗3次，每次5 min（震荡漂洗）；（7）加荧光标记的二抗抗体，37℃湿盒避光作用30 min；（8） 0.01M PBST避光漂洗3次，每次5 min；（9）甘油缓冲液封片；（10）荧光显微镜观察。注意事项：1.荧光有衰减，寄回或者重拍都可能有荧光消失的现象，建议客户在下单时增加拍照张数。2.做石蜡包埋样本保存及运输：常温置于4%多聚甲醛固定液内保存及运输（需注意固定液的量最好是组织的10倍以上，样本需完全浸泡于固定液内并防止样本贴壁固定不良，大标本最好使用大的标本瓶/袋运输，建议在大标本上按取材包埋要求做多条平行切口，以防标本中心固定不透彻。运输过程中防止固定液渗漏）。3.做冰冻切片样本保存及运输：-80℃或液氮长期保存，干冰运输。 

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、 冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。2、 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。3、 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。4、 加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。5、 BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。6、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。10、 镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。2、 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。3、 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。4、 加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。5、 BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。6、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。10、 镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 

masson染色是指用两种或三种阴离子染料混合，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一。Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一。试剂：　　Regaud 氏苏木精：苏木精1g，95%酒精10ml，甘油10ml，蒸馏水80ml。　　将苏木精加入蒸馏水内加温溶解,冷却后加入酒精和甘油,放数日后即可应用。　　Masson丽春红酸性复红液： 丽春红0.7g，酸性复红0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml。　　0.2%冰醋酸水溶液： 冰醋酸0.2 ml，蒸馏水100 ml。　　1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水100 ml。　　苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g，蒸馏水98 ml，冰醋酸2 ml。　　1%光绿水溶液：光绿 1g，蒸馏水100 ml。　　Masson三色法步骤　　1． 石蜡切片脱蜡至水。　　2． 铬化处理或去汞盐沉淀（甲醛固定的组织此步可略）。　　3． 依次自来水和蒸馏水洗。　　4． 用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min。　　5． 充分水洗,如过染可盐酸酒精分化。　　6． 蒸馏水洗。　　7． 用Masson 丽春红酸性复红液5-10min。　　8． 以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。　　9． 1%磷钼酸水溶液分化3-5min。　　10. 不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。　　11．以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。　　12．95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。　　结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色（如光绿液染色为绿色），胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。　　体会与说明：　　1．控制好染色步骤。　　2．组织固定起着很重要的作用，根据不同的固定液可延长或缩短染色时间。　　3．0.2%冰醋酸水溶液洗，可使色调清晰鲜艳。　　4．磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用，分化时镜下控制， 肌纤维和纤维素呈红色，胶原纤维呈淡粉红色即可。

在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件 。         JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm 的理想荧光探针。线粒体膜电位较高时，JC-1在线粒体的基质中形成聚合物，可以产生红色荧光；线粒体膜电位较低时，JC-1以单体形式存在于线粒体的基质中，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化实验外包:1.基因组学：基因芯片、SNP检测、DNA甲基化检测、生物信息学分析2.转录组学：microRNA芯片、LncRNA芯片、表达谱芯片、RNA-seq3.蛋白质组学：2D-DIGE、SILAC、iTRAQ、TMT、Label-free、MRM4.基因检测：DNA/RNA提取、RT-PCR、Real-timePCR5.蛋白质检测：Western blot、Co-ip  EMSA、CHIP、免疫荧光、ELISA6.病理检测：HE染色、特殊染色、组织切片、免疫组化、流式细胞分选7.代谢组学：GC-MS、LC-MS、NMR8.细胞及动物模型：原代细胞、细胞模型、动物模型构建9.SCI论文：SCI论文评估建议、SCI论文设计咨询、SCI论文统计资料处理、SCI论文实验操作咨询、SCI论文编修翻译等