自身免疫性疾病，是机体免疫系统出现异常，自身抗体或自身效应淋巴细胞攻击正常细胞导致的自身组织器官损伤性疾病。自身免疫性疾病有100多种，位于心血管疾病和肿瘤之后的第三类主要疾病。B细胞作为自身免疫性疾病最重要的效应细胞之一，靶向B细胞相关靶点药物的开发是各大药企热衷的治疗领域之一。BAFF靶点介绍B细胞激活因子BAFF（也称为TNFSF13B、CD257）作为一种关键的B细胞生存因子，属于肿瘤坏死因子（TNF）配体家族成员，有可溶型和膜结合型两种形式。BAFF在包括单核细胞、树突细胞和骨髓基质细胞在内的各种细胞类型上均有表达，其受体有3种：TNFRSF13B/TACI（跨膜激活因子和钙调节因子、亲环蛋白配体作用因子）， TNFRSF17/BCMA（B细胞成熟抗原），TNFRSF13C/BAFFR（B细胞激活因子受体）。BAFF通过与其受体的结合在支持B细胞的存活和增殖、调节类别转换重组以及自身免疫性B细胞的选择等方面发挥关键作用；此外，有研究发现BAFF也能促进T细胞的活化、增殖和分化。图1. BAFF与其受体的互作[1]BAFF参与了人类许多自身免疫性疾病的发病机制，在系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症（MS）、IgA肾病、Sjögren’s综合征和类风湿关节炎等患者的血清中检测到BAFF的浓度水平升高。其中，系统性红斑狼疮（SLE）是一种临床表现为多系统损害症状的慢性系统性自身免疫疾病，它的发病机制复杂，包括自身反应性T细胞与B细胞的增殖活化，多种自身致病性抗体的产生，细胞因子分泌及其受体表达异常等。目前，用于治疗SLE的上市药物只有两种，分别是贝利尤单抗（Belimumab）和泰它西普（Telitacicept）。图2. 系统性红斑狼疮的免疫发病机制（注：BAFF又称为BLyS）[2]贝利尤单抗贝利尤单抗（Belimumab，商品名：倍力腾）是一种特异性识别和抑制BAFF生物活性的人源性单克隆抗体，能显著降低循环B细胞水平。B细胞耐受性的丧失在SLE的发生和维持中起着关键的病理作用，靶向B细胞的产生、相互作用和功能性治疗被认为是一种有前途的新策略。贝利尤单抗是当前唯一同时获得FDA和CDE批准的新药。12000年10月，HGS和Cambridge Antibody Technology(CAT)达成合作，共同开发针对BLyS的单克隆抗体。最终在2003年得到了以高亲和力结合BLyS的人源单抗“LymphoStat B”，即后来的Belimumab。22006年8月，HGS和GlaxoSmithKline（GSK）达成了一项共同开发和商业化Belimumab的协议。根据协议，GSK协助HGS进行Belimumab的临床试验，两家公司平分临床试验的成本及之后产品销售获得的利润。32019年7月，贝利尤单抗在中国获批上市，全球首个且目前唯一治疗SLE的生物制剂Belimumab在华获批，开启了SLE临床治疗的新篇章。 42020年12月，贝利尤单抗正式获得国家药品监督管理局批准，通过谈判纳入了2020版国家医保目录，用于治疗儿童SLE，意味着贝利尤单抗成为中国覆盖5岁及以上儿童及成人SLE治疗的生物制剂。图3. 贝利尤单抗产品图（来源于百度图片搜索）泰它西普泰它西普（Telitacicept，商品名：泰爱）是一种TACI-Fc融合蛋白，由人跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用因子（TACI）受体的胞外域以及人免疫球蛋白G（IgG）的可结晶片段（Fc）域构成。泰它西普靶向两类对B淋巴细胞发育至关重要的细胞信号分子：B淋巴细胞刺激因子（BLyS）和增殖诱导配体（APRIL），能够有效降低B细胞介导的自身免疫应答，达到治疗自身免疫疾病的目的。泰它西普目前仅被CDE批准用于治疗8分以上的SLE患者。12010年荣昌生物向国家药监局申报临床试验，并于2011年获得I期临床试验批件。22012年在北京协和医院完成I期临床试验，2013年获国家食品药品监督管理总局Ⅱ、Ⅲ期临床试验批件。32019年11月，泰它西普的新药上市申请正式获得CDE承办受理，并于12月以具有明显治疗优势创新药纳入优先审评审批。42021年3月，泰它西普正式获得国家药品监督管理局（NMPA）批准上市，用于治疗SLE，标志着荣昌生物迎来了首个正式进入商业化阶段的产品。图4. 泰它西普产品及结构图（来源于荣昌生物官网）根据科睿唯安数据库检索发现，除了以上两种上市药物以外，还有多款相关药物处在临床研究阶段。表1.药物研究进展（部分）BioMice百奥动物自主开发了人源化B-hBAFF mice、B-hBAFFR mice 助力药物研发。B-hBAFF mice基本信息蛋白表达分析用ELISA方法对野生型(WT)小鼠和B-hBAFF小鼠进行BAFF种特异性表达分析。采集WT小鼠(+/+)和杂合子B-hBAFF小鼠(H/+)的血清，用种特异性BAFF ELISA试剂盒进行ELISA分析。小鼠BAFF在WT小鼠和杂合B-hBAFF小鼠中均可检测到，人BAFF在杂合B-hBAFF小鼠中可检测到。B-hBAFFR mice基本信息蛋白表达分析流式细胞术分析B-hBAFFR纯合小鼠中种特异性BAFFR的表达情况。分别取WT小鼠(+/+)和纯合B-hBAFFR小鼠 (H/H)的脾细胞，用种特异性抗BAFFR抗体进行流式细胞术分析。小鼠BAFFR在WT小鼠中检测到，人BAFFR只在纯合B-hBAFFR中能检测到，WT小鼠中无法检测到。更多验证数据信息，正在开展中，敬请关注。参考资料[1]. Samy E ,  Wax S ,  Huard B , et al. Targeting BAFF and APRIL in systemic lupus erythematosus and other antibody-associated diseases[J]. International Reviews of Immunology, 2017.[2]. Espinosa G ,  Cervera R . Belimumab: a BLyS-specific inhibitor for the treatment of systemic lupus erythematosus.[J]. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2012, 91(12):143.[3]. https://www.gsk.com/en-gb/search/?q=belimumab&p=5.[4]. http://www.remegen.cn/index.php?v=show&cid=68&id=113.

TIM3（T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域分子3）又称HAVCR2，属于免疫调节蛋白TIM家族的一员，在人类，TIM家族包括TIM1、TIM3和TIM4，位于染色体5q33.2上。在小鼠中，TIM家族包括TIM1到TIM8，位于染色体11B1.1上。大量证据表明，TIM家族在自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤免疫监视和免疫逃逸等免疫反应的调节中发挥着不同的作用。TIM3是一类T细胞表面抑制性分子，能够引起癌症与慢性病毒感染过程中T细胞的耗竭。与CTLA4，PD1类似，它也是目前研究最多的免疫治疗的靶点之一。TIM3作为一种负调控的免疫检查点，于2002年首次被发现，由281个氨基酸组成，并且由一个胞外区、一个单跨膜结构域和一个C-末端细胞质尾部组成。TIM3选择性地表达在分泌IFN-γ的辅助性T细胞(Th1和Th17) 、调节性T细胞(Treg) 、树突状细胞(DCs) 、单核细胞、肥大细胞、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TILs) 上，在肿瘤细胞上亦有表达，如黑色素瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤。TIM3作为重要的免疫检查点的机制主要在于TIM3标志着肿瘤浸润CD8+ PD1+ T细胞功能最失调的亚群。同时阻断TIM3和PD1通路的抗体对抑制肿瘤生长、改善肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的响应具有协同作用。[1]。  图1：TIM3可以诱导T细胞耗竭[1]TIM3有多种不同的配体，包括半乳糖凝集素9（Galectin 9）、磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)以及HMGB1，它们分别与TIM3胞外区IgV结构域的不同位点结合。当TIM3未与其配体结合时，它被招募到T细胞激活的免疫突触中，与 HLA-B相关转录产物3（BAT3）相互作用，并通过酪氨酸激酶LCK募集维持T细胞活化。可溶性凝集素半乳糖凝集素9（Galectin 9）和粘附分子癌生物抗原相关细胞粘附分子1（CEACAM1），通过酪氨酸激酶ITK触发Tyr256和Tyr263的磷酸化。磷酸化后，BAT3从TIM3中释放出来，从而使TIM3发挥其抑制功能。BAT3敲除的T细胞其共抑制受体的表达升高，并且在自身免疫的背景下表现出降低的致病性，说明BAT3通过负反馈来调节T细胞的功能。FYN与BAT3结合TIM3的同一区域。多数促进抗肿瘤免疫的TIM3靶向抗体干扰CEACAM1或PtdSer与TIM3的结合，从而维持TIM3-BAT3的相互作用[2]。 图2：TIM3的作用机制[2]TIM3靶点药物研发进展 随着技术进步和研究创新，TIM3是目前研究最多的免疫治疗的靶点之一，靶向TIM3的治疗正处于临床试验/研发阶段，国内外尚无已上市药物，但很多制药企业都有布局，临床III期两个（诺华、GSK各有一个）、临床II期5个（罗氏、百济神州、阿斯利康等）、临床I期8个（礼来、恒瑞等），主要适应症急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合症（MDS）、非小细胞肺癌等实体瘤；全球研发TIM3/PD1双特异性抗体的公司不多，研究进入临床试验的只有阿斯利康、罗氏和礼来，其余皆处于临床前。 表1. 部分在研药物临床进展数据来源于科睿唯安针对TIM3靶点机制研究和新药开发的需求，BioMice百奥动物自主研发了B-hTIM3 mice，同时也扩繁了B-hPD-1/hTIM3 mice，B-hPD-L1/hTIM3 mice，B-hCTLA4/hTIM3 mice双人源化小鼠及B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 mice等三人源化小鼠，相关模型列表见文末，助力靶向TIM3药物开发，为临床前药效评估提供了优质模型。B-hTIM3 mice基本信息蛋白表达分析通过流式细胞术对纯合B-hTIM3 小鼠进行种属特异性B-hTIM3 小鼠表达分析。收集野生型C57BL/6和纯合 B-hTIM3 小鼠的腹腔冲洗液细胞，结果显示：小鼠 TIM3 仅在野生型小鼠的非 T 和非 B 细胞中检测到，人 TIM3 仅在纯合 B-hTIM3 小鼠的非 T 和非 B 细胞可检测到。通过流式细胞术对纯合B-hTIM3 小鼠进行种属特异性 TIM3 表达分析。收集野生型C57BL/6和纯合 B-hTIM3 小鼠的脾细胞，结果显示：小鼠 TIM3 仅在野生型小鼠中检测到。人 TIM3 仅在纯合 B-hTIM3 小鼠中检测到。药效验证抗人 TIM3 抗体在B-hTIM3 小鼠中的抗肿瘤活性。(A)抗人 TIM3 抗体可抑制B-hTIM3 小鼠中的MC38肿瘤生长。将小鼠结肠癌MC38细胞皮下植入纯合B-hTIM3 小鼠（雄性，7周龄，n=5）。当肿瘤体积达到约100 mm3时，将小鼠分组，此时用抗人 TIM3 抗体处理。(B)给药期间体重变化。如图A所示，抗人 TIM3 抗体可有效抑制B-hTIM3 小鼠的肿瘤生长，表明B-hTIM3 小鼠为抗人 TIM3 抗体的体内评价提供了有力的临床前模型。数值表示为平均值±SEM。抗人 TIM3 抗体在B-hTIM3 小鼠中的抗肿瘤活性。(A)抗人 TIM3 抗体可抑制B-hTIM3 小鼠中的MC38肿瘤生长。将小鼠结肠癌MC38细胞皮下植入纯合B-hTIM3 小鼠（雌性，4周龄，n=5）。当肿瘤体积达到约100 mm3时，将小鼠分组，此时用抗人 TIM3 抗体处理。(B)给药期间体重变化。如图A所示，抗人 TIM3 抗体可有效抑制B-hTIM3 小鼠的肿瘤生长，表明B-hTIM3 小鼠为抗人 TIM3 抗体的体内评价提供了有力的临床前模型。B-hCTLA-4/hTIM3 mice蛋白表达分析通过流式细胞术对纯合B-hCTLA4/hTIM3 小鼠进行种属特异性 TIM3 表达分析。收集野生型C57BL/6和纯合 B-hCTLA4/hTIM3(H/H) 小鼠的脾细胞，结果显示：小鼠 TIM3 在野生型小鼠中可检测到。人 TIM3 仅在纯合 B-hCTLA4/hTIM3 小鼠中可检测到，但在 WT 小鼠中未检测到。通过流式细胞术对纯合B-hCTLA4/hTIM3 小鼠进行种属特异性CTLA4 表达分析。收集野生型C57BL/6和纯合 B-hCTLA4/hTIM3(H/H) 小鼠的脾细胞，结果显示：小鼠 CTLA4 在野生型小鼠中可检测到。人CTLA4仅在纯合 B-hCTLA4/hTIM3 小鼠中可检测到，但在 WT 小鼠中未检测到。B-hPD-1/hTIM3 mice药效验证抗人TIM3抗体联合抗人PD-1抗体在B-hPD-1/hTIM3 小鼠中的抗肿瘤药效。(A)抗人TIM3 抗体联合抗人PD-1抗体抑制B-hPD-1/hTIM3 小鼠MC38肿瘤生长。小鼠结肠癌MC38细胞(5×105)皮下植入纯合B-hPD-1/hTIM3小鼠中（雌性，6-8周龄，n=6）。当肿瘤体积达到大约150±50 mm3时，小鼠被分组，然后用抗人 TIM3 抗体联合抗人PD -1抗体Keytruda给药。(B)治疗期间体重变化。如图A所示，抗人TIM3抗体与抗人PD-1抗体联合使用比单独使用组对肿瘤生长具有更强的抑制作用，说明B-hPD-1/hTIM3小鼠为评价人TIM3抗体与人PD-1抗体联合治疗的体内评估提供了一个强有力的临床前模型。B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 mice药效验证抗人PD-L1抗体（内部合成）联合抗人TIM3抗体在B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 小鼠中的抗肿瘤药效。(A) 纯合B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 小鼠（雌性，7-8周龄，n=6）皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞。当肿瘤体积达到约100 mm3时对小鼠进行分组，分组后给抗人PD-L1抗体和抗人 TIM3 抗体进行治疗，剂量和时间表如图 A 所示。(B) 给药期间的体重变化。如图 A 所示，抗人 PD-L1 抗体和抗人 TIM3 抗体联合给药组的抑制作用强于单药组，抗人 PD-L1 抗体联合抗人 TIM3 抗体可抑制 B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 小鼠中的肿瘤细胞生长。结果证明 B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 小鼠可为体内评价抗人PD-L1 和抗人TIM3抗体药效提供有力的临床前研究模型。抗人PD-1抗体（内部合成）联合抗人TIM3抗体在B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 小鼠中的抗肿瘤药效。(A) 纯合B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 小鼠（雌性，7-8周龄，n=6）皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞。当肿瘤体积达到约100 mm3时对小鼠进行分组，分组后给抗人PD-1抗体和抗人 TIM3 抗体进行治疗，剂量和时间表如图 A 所示。(B) 给药期间的体重变化。如图 A 所示，抗人 PD-1 抗体和抗人 TIM3 抗体联合给药组的抑制作用强于单药组，抗人 PD-1 抗体联合抗人 TIM3 抗体可抑制 B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 小鼠中的肿瘤细胞生长。结果证明 B-hPD-1/hPD-L1/hTIM3 小鼠可为体内评价抗人PD-1 和抗人TIM3抗体药效提供有力的临床前研究模型。参考资料[1] Solinas, C., et al., Significance of TIM3 expression in cancer: From biology to the clinic. Semin Oncol, 2019. 46(4-5): p. 372-379.[2] Wolf, Y., A.C. Anderson, and V.K. Kuchroo, TIM3 comes of age as an inhibitory receptor. Nat Rev Immunol, 2020. 20(3): p. 173-185.TIM3靶点相关模型列表

2006年3月，TeGenero公司的CD28超级激动剂单抗TGN1412治疗风湿性关节炎/白血病的1期临床试验中，6名志愿者遭受细胞因子释放综合征并伴有多器官功能衰竭，全身极度肿胀成为“大象人”，万幸的是最终脱离生命危险，该事件直接导致TeGenero破产。16年前的黑天鹅事件也给CD28药物开发蒙上了一层阴影。后续TGN1412并未被就此放弃，莫斯科抗体公司TheraMab顺利接盘并更名为TAB08，有报道称1期临床NCT03006029、NCT01990157不良事件保持在一个可接受的水平（短暂的发热与IL-6有关），然而试验如今已经因“行政原因”终止，这款CD28单抗最终也没能迎来涅槃重生[1]。如此看来，再次沉沦的CD28的未来当真就是砂砾宿命了吗？2017年，Science上发表了一篇题为Rescue of exhausted CD8 Tcells by PD-1 targeted therapies is CD28-dependent的文章，证明了CD28/B7共刺激途径对有效的PD-1疗法至关重要。至此，CD28再次回到研究者的视线中。2019年11月，赛诺菲在Nature Cancer发表了一款CD28/CD3/CD38三抗的研究进展。该三抗在CD3分子亲和力的选择上，采用了中等亲和力的抗体（KD～20nM）平衡了杀伤有效性以及细胞因子大量释放的安全性问题[2]。2020年1月，再生元在Science Translational Medicine发表论文，指出CD28双抗可以增强CD3的抗肿瘤疗效。在动物实验中，共刺激型CD28双抗明显增强了CD3双抗的疗效，且没有细胞因子风暴的风险。2020年6月24日，再生元再次在ScienceTranslational Medicine杂志上发表论文，证实了肿瘤特异性抗原(TSA) x CD28双特异性抗体可以与更广泛的抗PD-1抗体协同作用，增强癌症治疗效果，诱导长效抗肿瘤免疫力，且不会诱发细胞因子风暴，具有很好的耐受性。今年2月，赛诺菲的研发团队在Nature发表了一篇HER2×CD3×CD28三抗的研究进展。研究表明，在原代人CD3+T细胞重组的免疫缺陷NSG小鼠体内，该三抗使CD8 T细胞中颗粒酶的表达增加了6.8倍。相关肿瘤药效实验结果表明，剂量低至10μg/kg时，HER2×CD3×CD28三抗依然能够诱导肿瘤消退。近期，惠和生物靶向CD3×CD28×CD19三特异性抗体CC312的IND申请获得美国FDA默示许可，进入临床研发阶段，CC312是国内首个，也是全球第三个基于CD28共刺激信号的三特异性抗体。随着赛诺菲、再生元等牵头的研究推进，CD28被强势拉回公众视野，更多的潜力有待开发！CD28相关信号通路CD28是T细胞激活最重要的参与者之一，是增强MHC-TCR的主激活信号的主要辅助信号。CD28和CTLA-4具有高度的同源性，具有相同的配体CD80和CD86（B7-1和B7-2），CD28负责传递激活信号，活化T细胞，而CTLA-4负责传递抑制信号给T细胞，让T细胞不会杀伤其它细胞，包括肿瘤细胞。CTLA-4与配体的亲和力要高于CD28，因此会竞争阻断CD28的T细胞激活作用。在T细胞辅助激活的过程中，CD86优先表达，在与CD28结合上，CD86表现出优于CD80的结合能力，有利于T细胞激活。在T细胞激活的过程中，CD28扮演着“加油”角色，CTLA-4扮演着“前刹车”角色，PD-1则扮演着“后刹车”角色[3]。CD28、CTLA-4、PD-1/PD-L1信号通路[4]CD28靶点部分开发进展CD28作为一个老靶点，不仅机制清晰，而且针对不同临床适应症，既可开发拮抗剂也可开发激动剂，理应前景无限，但由于其研发历程的跌宕起伏，目前只有少量抗体药物开发管线。其临床药物开发上主要集中在3个方面：CD28关联靶点融合蛋白药物；单抗药物；多特异性抗体药物。（数据来源科睿唯安及公开信息整理）CD28系列人源化动物模型对于CD28相关药物的研究，再生元和赛诺菲已经做出了很好的表率，进一步的数据也许会让CD28再次火热起来。相关动物模型对于CD28靶向调节剂开发可谓至关重要，BioMice 百奥动物自主研发的CD28系列人源化鼠是评估CD28相关抗体药物的优质临床前实验动物模型。B-hCD28 小鼠验证数据蛋白表达分析流式细胞术分析B-hCD28纯合小鼠CD28的表达取抗CD3ε抗体刺激野生型小鼠和纯合B-hCD28小鼠的脾细胞，用种属特异性抗CD28抗体进行流式分析。小鼠CD28在野生型小鼠中检测到。人CD28仅在纯合B-hCD28小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。抗人CD28抗体的体内药效抗人CD28抗体在B-hCD28小鼠体内的抗肿瘤活性实验结果表明，两种抗人CD28抗体在B-hCD28小鼠体内均能有效控制肿瘤生长，表明B-hCD28小鼠为抗人CD28抗体的体内评价提供了一个优质的临床前模型。抗人PD-L1xCD28双特异性抗体的体内药效抗PD-L1和抗CD28 (PD-L1xCD28)双特异性抗体(BsAb)在B-hCD28小鼠中的抗肿瘤活性结果表明，抗人PD-L1xCD28 BsAbs能够有效控制B-hCD28小鼠的肿瘤生长，表明B-hCD28小鼠为抗人PD-L1xCD28 BsAbs的体内评价提供了一个优质的临床前模型。B-hCD3E/hCD28小鼠验证数据蛋白表达分析流式细胞术分析B-hCD3E/hCD28纯合小鼠CD3E的表达取野生型小鼠和纯合B-hCD3E/hCD28小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD3E抗体进行流式细胞术分析。小鼠CD3E在野生型小鼠中检测到。人CD3E仅在纯合B-hCD3E/hCD28小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。流式细胞术分析B-hCD3E/hCD28纯合小鼠CD28的表达取野生型小鼠和纯合B-hCD3E/hCD28小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD28抗体进行流式细胞术分析。小鼠CD28在野生型小鼠中检测到。人CD28仅在纯合B-hCD3E/hCD28小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。B-hCD3EDG/hCD28 小鼠验证数据蛋白表达分析流式细胞术分析B-hCD3EDG/hCD28纯合小鼠CD3E的表达取野生型小鼠和纯合B-hCD3EDG/hCD28小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD3E抗体进行流式分析。小鼠CD3E在野生型小鼠中检测到。人CD3E仅在纯合B-hCD3EDG/hCD28小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。流式细胞术分析B-hCD3EDG/hCD28纯合小鼠CD28的表达取野生型小鼠和纯合B-hCD3EDG/hCD28小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD28抗体进行流式细胞术分析。小鼠CD28在野生型小鼠中检测到。人CD28仅在纯合B-hCD3EDG/hCD28小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。B-hCD28/hTROP2小鼠验证数据蛋白表达分析流式细胞术分析B-hCD28/hTROP2纯合小鼠CD28的表达取野生型小鼠和纯合B-hCD28/hTROP2小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD28抗体进行流式细胞术分析。小鼠CD28在野生型小鼠中检测到。人CD28仅在纯合B-hCD28/hTROP2小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。Western blot分析TROP2在B-hCD28/hTROP2纯合小鼠中的表达取野生型小鼠和纯合B-hCD28/hTROP2小鼠的皮肤组织，用抗TROP2抗体进行western blot分析。小鼠TROP2在野生型小鼠中检测到。人TROP2仅在纯合B-hCD28/hTROP2小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。B-hCD28/hB7-H3小鼠验证数据蛋白表达分析流式细胞术分析B-hCD28/hB7-H3纯合小鼠CD28的表达取野生型小鼠和纯合B-hCD28/hB7-H3小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD28抗体进行流式细胞术分析。小鼠CD28在野生型小鼠中检测到。人CD28仅在纯合B-hCD28/hB7-H3小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。Western blot分析B-hCD28/hB7-H3纯合小鼠B7-H3的表达采集野生型小鼠和纯合B-hCD28/hB7-H3小鼠附睾，用抗B7-H3抗体进行western blot分析。由于抗体的交叉反应，野生型小鼠和纯合B-hCD28/hB7-H3小鼠均可检测到B7-H3。B-hCD28/hCD20小鼠验证数据蛋白表达分析流式细胞术分析B-hCD28/hCD20纯合小鼠CD28的表达取野生型小鼠和纯合B-hCD28/hCD20小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD28抗体进行流式细胞术分析。小鼠CD28在野生型小鼠中检测到。人CD28仅在纯合B-hCD28/hCD20小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。流式细胞术检测B-hCD28/hCD20纯合小鼠CD20的表达取野生型小鼠和纯合B-hCD28/hCD20 小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD20抗体进行流式细胞术分析。小鼠CD20在野生型小鼠中检测到。人CD20仅在纯合B-hCD28/hCD20小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。B-hSIRPA/hCD47/hCD3E/hCD28小鼠验证数据蛋白表达分析流式细胞术分析B-hSIRPA/hCD47/hCD3E/hCD28纯合小鼠CD3E、CD28、SIRPA、CD47的表达取野生型小鼠和纯合B-hSIRPA/hCD47/hCD3E/hCD28小鼠脾细胞，分别用种特异性抗CD3E、CD28、SIRPA、CD47抗体进行流式细胞术分析。由于抗体的交叉反应，野生型小鼠和B-hSIRPA/hCD47/hCD3E/hCD28小鼠均可检测到小鼠SIRPA，人SIRPA仅在纯合B-hSIRPA/hCD47/hCD3E/hCD28小鼠中检测到，而在野生型小鼠中未检测到；小鼠CD3E、CD28、CD47在野生型小鼠中检测到，人CD3E、CD28、CD47仅在纯合B-hSIRPA/hCD47/hCD3E/hCD28小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。CD28靶点相关模型列表       想要了解更多人源化小鼠，欢迎扫描下方二维码查看或者来电咨询。 参考资料：[1] https://mp.weixin.qq.com/s/6tuPYtTIr_gNQrb0N7o7_w[2] Sanofi R&D Investor Event[3] Dimitris Skokos et al. A class of costimulatoryCD28-bispecific antibodies that enhance the antitumor activity ofCD3-bispecific antibodies. Sci. Transl. Med. 2020[4]https://oncologypro.esmo.org/education-library/esmo-handbooks/immuno-oncology/immune-synapse

MSLN基因编码一种前体蛋白，经蛋白水解处理生成两种蛋白产物，主要位于正常间皮细胞表面，两种蛋白产物为巨核细胞增强因子（megakaryocyte potentiating,MPF）和间皮素（Mesothelin,MSLN）。巨核细胞增强因子作为细胞因子可刺激骨髓巨核细胞集落形成。间皮素在正常组织中，仅表达在间皮细胞，但在间皮瘤（mesothelioma）、卵巢癌（ovarian cancer）、胰腺癌（pancreatic cancer）、胆管癌（cholangiocarcinoma）等肿瘤中均有高表达。因此间皮素是很有前途的肿瘤特异性治疗候选药物靶点。图1.间皮素的结构和功能[1]MSLN通过ERK和PI3K/Akt通路促进肿瘤细胞存活和增殖；通过MMP-7的活性促进侵袭性和转移过程。通过与表达MUC16的细胞相互作用，也可以促进转移。然而，MSLN与EMT和血管生成相关的基本机制在PDAC中仍然有待阐明。MSLN在80%到90%的PDAC中过度表达，使该靶点成为PDAC患者治疗的一个有吸引力的候选。图2.MSLN在胰腺导管腺癌(PDAC)进展中的作用[2]MSLN与胰腺癌细胞表面的MUC16结合，激活了p38 MAPK依赖性途径，进而上调了MMP-7的合成，导致侵袭和迁移潜力增加。在胰腺癌细胞不表达MUC16的情况下，MSLN能够通过激活ERK依赖性途径上调MMP-7的表达。图3. MSLN-MUC16结合诱导胰腺癌细胞MMP-7的分子通路[3]目前靶向MSLN治疗实体瘤的药物主要有：单克隆抗体药物，携带蛋白毒素的单克隆抗体药物，携带低分子量细胞毒性药物的单克隆抗体药物，靶向MSLN的CAR-T细胞药物，以及可以诱导T细胞针对MSLN产生免疫应答的疫苗。图4. 临床试验中靶向MSLN的方法[4]最新研究进展据不完全统计，目前MSLN靶点处于在研阶段的相关药物有56个，目前进行相关药物研发的企业包括拜耳，Atara Biotherapeutics，诺华在研，亘喜生物，荣昌生物等。目前已有诸多国内外企业在该领域进行了布局。部分处于临床及以上阶段的药物情况统计见下表：数据来源于科睿唯安及公开信息整理针对MSLN靶点机制研究和新药开发的需求，BioMice百奥动物自主研发了B-hMSLN mice和B-hMSLN ID8、B-hMSLN MC38细胞系，助力靶向MSLN药物开发，为临床前药效评估提供了优质模型。B-hMSLN mice基本信息蛋白表达分析利用western blot检测野生型小鼠和B-hMSLN小鼠中种属特异性MSLN的表达。取野生型小鼠（+/+）和杂合B-hMSLN小鼠(H/+)的肺部裂解液，用抗MSLN抗体进行western blot分析。结果显示，小鼠MSLN在杂合B-hMSLN小鼠(H/+)和野生型小鼠(+/+)中均可检测到。人MSLN只在B-hMSLN小鼠(H/+)中可检测到。免疫组化（IHC）方法检测MSLN表达IHC显示在B-hMSLN小鼠肺部组织中有代表性间皮素表达。用人MSLN特异性抗体（A，B）和抗兔IgG抗体（C）特异的抗体对组织进行染色。结果显示，在纯合B-hMSLN小鼠中，细胞膜上显示人MSLN阳性（数据来源于合作方）。B-hMSLN ID8基本信息蛋白表达分析通过流式细胞术对纯合B-hMSLN ID8小鼠细胞中MSLN的表达进行分析。用物种特异性抗MSLN抗体对B-hMSLN ID8培养物的单细胞悬浮液进行染色。在B-hMSLN ID8小鼠细胞的表面检测到人MSLN。B-hMSLN ID8细胞的2-A11克隆被用于体内实验。肿瘤生长曲线&体重变化B-hMSLN ID8小鼠细胞的皮下同种移植肿瘤生长。将B-hMSLN ID8细胞（5x106）和野生型ID8细胞（1x106）皮下植入C57BL/6N小鼠（雌性，6周龄，n=8）。(A)平均肿瘤体积±SEM， (B)体重(平均值±SEM)，每周测量两次肿瘤体积和体重，体积以mm3表示，使用公式，V=0.5×长径×短径2。如图A所示，B-hMSLN ID8细胞能够在小鼠体内建立肿瘤，可用于药效研究。肿瘤体积&重量测量肿瘤细胞的蛋白表达分析将B-hMSLN ID8细胞皮下移植到C57BL/6小鼠体内（n=8），在接种后21天，收集肿瘤细胞并通过流式细胞术检测人MSLN的表达。如图所示，人MSLN在肿瘤细胞表面高表达。因此，B-hMSLN ID8小鼠细胞可用于新型MSLN疗法的体内药效研究。B-hMSLN MC38基本信息蛋白表达分析通过流式细胞术对B-hMSLN MC38小鼠进行种属特异性MSLN 表达分析。对 B-hMSLN MC38 培养物的单细胞悬液用种属特异性抗 MSLN 抗体进行染色。结果显示：在B-hMSLN MC38小鼠细胞表面检测到人MSLN，小鼠MSLN不表达。因此 B-hMSLN MC38细胞的1-A03克隆可用于体内实验。肿瘤生长曲线&体重变化B-hMSLN MC38小鼠细胞的皮下同种移植肿瘤生长。B-hMSLN MC38 细胞 (1x106) 和野生型 MC38 细胞 (5x105) 被皮下植入 C57BL/6 小鼠 (雌性, 6 周龄, n=8)。每周两次测量肿瘤体积和体重。(A) 平均肿瘤体积 ± SEM， (B) 体重 (平均值±SEM)。体积以 mm3 表示，使用公式：V=0.5 × 长径 × 短径2。如图 A 所示，B-hMSLN MC38 小鼠细胞能够在体内建立肿瘤，并可用于药效研究。参考文献[1] Mesothelin：An Immunotherapeutic Targetbeyond Solid Tumors． Cancers （Basel）． 2022 Mar；14（6）：1550．[2] Montemagno C, et al. Int J Mol Sci. 2020 Jun 6;21(11):4067.[3] Chen SH, et al. Sci Rep. 2013;3:1870.[4] Montemagno C, et al. Int J Mol Sci. 2020 Jun 6;21(11):4067.

上半年，宝船生物与百奥赛图合作研发的TNFR2非阻断型全人抗体药物（代号BC011）的实验数据已在2022年美国癌症研究协会（AACR）年会上公布。 BC011是一款新型TNFR2非阻断治疗抗体，来源于RenMab人源化IgG小鼠。通过在TNFR2人源化的肿瘤同源小鼠模型中进行无差别、高通量的体内有效性筛选，从大量候选抗体中筛选出了BC011。BC011能够促进CD8+T细胞增殖，耗竭Treg细胞，从而增加肿瘤微环境中效应T细胞的比例。 TNFR2靶点概览TNFRSF1B（TNF receptor superfamily member 1b）为TNF受体超家族成员，也称为TNFR2，在某些免疫细胞亚群（如CD4+和CD8+ T细胞）、内皮细胞、小胶质细胞和特异性神经元亚群、少突胶质细胞、心肌细胞和人间充质干细胞上表达。在多种肿瘤细胞中也有高表达，如黑色素瘤、肠癌和卵巢癌等。在肿瘤微环境中，TNFR2在Treg细胞中高表达，具有很好的特异性，是免疫逃逸和肿瘤增殖的潜在驱动力。TNFR2是I型跨膜糖蛋白，由461个氨基酸组成，其中前256个氨基酸形成包含四个富含半胱氨酸基序的胞外结构，31个氨基酸形成跨膜结构域，后174个氨基酸形成具有TRAF2结合位点的胞内结构。图1. TNFR2结构[1]TNFR1(p55，TNFRSF1A)和TNFR2(p75，TNFRSF1B)是同源关系最近的两个蛋白，他们分别激活两个独立的细胞内信号通路进行基因转录。TNFR1几乎在身体的所有细胞上都有表达，包括整个淋巴系统。从功能上讲，TNF主要依赖TNFR1进行凋亡，依赖TNFR2进行与T细胞存活相关的功能--TNFR2信号通过核转录因子NF-κB促进pro-survival基因的转录。图2. TNFR2信号在肿瘤中的作用机制[2]许多实验表明TNFR2抑制剂一方面可以有效阻断TNF跟TNFR2的结合，抑制Treg的增殖和功能，也可以靶向杀伤TNFR2高表达的肿瘤细胞，跟PD-(L)1抑制剂在体内都有非常好的协同效果；然而针对自身免疫病，TNFR2激活剂可进一步活化Treg细胞，抑制Teff细胞，下调免疫细胞的过度活化。因此，TNFR2作为肿瘤和自身免疫病的新一代治疗靶点，为肿瘤和自免疾病治疗提供了一种全新的策略。图3. 激动剂与抑制剂作用示意图[3]TNFR2靶点药物在研进展TNFR2作为肿瘤和自身免疫病治疗的潜力靶点，目前在研项目较少，绝大多数仍处于临床前阶段，速度最快的也仅推进至Ⅰ期临床。BioInvent全面布局了TNFR2抑制剂与TNFR2激动剂，其中TNFR2抑制剂BI-1808已处于临床Ⅰ期，除了单药疗法外，与PD-1抑制剂联用方案是药物重要的开发策略。聚焦国内，维立志博的TNFR2抗体药物LBL-019于9月29日临床试验申请获CDE受理，临床进展居前。此外，百济神州于2021年2月由Boston Immune（BITT）引入TNFR2抗体BITR2101，计划探索与替雷利珠单抗的联用方案。数据来源于科睿唯安相关动物模型对于TNFR2靶向调节剂的开发可谓至关重要，BioMice百奥动物自主研发的TNFR2系列人源化小鼠是评估TNFR2相关抗体药物的优质临床前实验动物模型。B-hTNFR2 mice蛋白表达分析通过流式细胞术对野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠中TNFR2蛋白表达进行分析。用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠，收集脾细胞，并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示：在C57BL/6小鼠B、T和Treg细胞表面检测到mTNFR2，在B-hTNFR2纯合鼠B、T和Treg细胞表面检测到hTNFR2。TNFR2人源化不影响脾脏、淋巴结中白细胞各亚群比例（数据未展示）。TNFR2抗体与B-hTNFR2纯合鼠T细胞结合分析 从B-hTNFR2小鼠（n=3）中分离出脾细胞。通过流式细胞术测试TNFR2抗体与脾细胞的结合。从anti-mCD3ε(0.2或1μg/mL)和anti-mCD28(1μg/mL)体内刺激的B-hTNFR2小鼠分离出脾细胞。如图所示，与同型对照抗体(hIgG)相比，hTNFR2 Ab2与B-hTNFR2纯合鼠的T细胞是结合的。在anti-mCD3ε(0.2μg /mL)刺激条件下，mTNFα增强了hTNFR2 Ab2与B-hTNFR2纯合鼠的T细胞结合，这表明mTNFα/hTNFR2信号通路在B-hTNFR2纯合鼠中是可行的。TNFR2抗体药效验证抗人TNFR2抗体在B-hTNFR2小鼠中的抗肿瘤活性。B-hTNFR2小鼠(雌性，6-7周龄，n=8)皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞(5E5)。当肿瘤体积达到约100 mm3时，对小鼠进行分组，然后使用抗人TNFR2抗体进行治疗。如图A所示，抗人TNFR2抗体能够有效控制B-hTNFR2小鼠的肿瘤生长，且呈剂量依赖性，证实B-hTNFR2小鼠模型是体内TNFR2抗体药理功效研究的有力工具。(hTNFR2 Ab2由客户提供)B-hTNFA/hTNFR2 mice抗人TNFR2抗体的体内有效性抗人TNFR2抗体在B-hTNFA/hTNFR2小鼠中的抗肿瘤活性。B-hTNFA/hTNFR2 小鼠(雌性，7周龄)皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞(5E5)。当肿瘤体积达到约100 mm3时，对小鼠进行分组，然后使用抗人TNFR2抗体进行治疗。如图A所示，抗人TNFR2抗体能够有效控制B-hTNFA/hTNFR2 小鼠的肿瘤生长，证实B-hTNFA/hTNFR2 小鼠模型是体内TNFR2抗体药理功效研究的有力工具。B-hTNFR2/hTNFR1 mice蛋白表达分析通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1 小鼠中TNFR2的蛋白表达。用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1(H/H)小鼠，收集野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1 小鼠的脾细胞，并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠TNFR2仅在野生小鼠中检测到，人TNFR2仅在纯合B-hTNFR2/hTNFR1小鼠中检测到。通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1 小鼠中TNFR1的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hTNFR2/hTNFR1(H/H) 小鼠的脾细胞和血液，并用种属特异性抗TNFR1抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠TNFR1仅在野生小鼠中检测到，人TNFR1仅在纯合B-hTNFR2/hTNFR1小鼠中检测到。B-hCTLA4/hTNFR2 mice蛋白表达分析通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCTLA4/hTNFR2 小鼠中CTLA4的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCTLA4/hTNFR2 小鼠的脾脏，并用种属特异性抗CD152(CTLA4)抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠CTLA4仅在野生小鼠中检测到，人CTLA4仅在纯合B-hCTLA4/hTNFR2小鼠中检测到。通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCTLA4/hTNFR2小鼠中TNFR2的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCTLA4/hTNFR2小鼠的脾脏，并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠TNFR2仅在野生小鼠中检测到，人TNFR2仅在纯合B-hCTLA4/hTNFR2小鼠中检测到。B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2 mice抗人PD-1和抗人TNFR2抗体联合治疗抗人PD-1抗体联合抗人TNFR2抗体在B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠中的抗肿瘤活性。B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠(雌性，6-7周龄，n=5)皮下接种hPD-L1 MC38细胞。当肿瘤体积达到约100 mm3时，对小鼠进行分组，然后使用抗人PD-1抗体和人hTNFR2抗体进行治疗。如图A所示，PD-1和hTNFR2抗体联合给药组的抑制作用强于单独给药组，证明B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠为评价hTNFR2抗体和hPD-1抗体联合给药疗效提供了有力的体内临床前模型。B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1 mice抗人TNFR2抗体的体内有效性抗人TNFR2抗体在B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1小鼠中的抗肿瘤活性。B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1 小鼠(雌性，8周龄，n=6)皮下接种鼠结肠癌 MC38 细胞。根据体重差异对小鼠进行分组，此时用客户提供的抗 TNFR2 Ab1 处理。如图 A 所示，抗人 TNFR2 抗体可有效控制 B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1 小鼠的肿瘤生长，且呈剂量依赖性，证明 B-hTNFA/hTNFR2/hTNFR1 小鼠为体内评价抗人 TNFR2 抗体提供了有力的临床前模型。TNFR2靶点相关模型列表参考文献[1] Medler, J.; Kucka, K.;Wajant, H. Tumor Necrosis Factor Receptor 2 (TNFR2): An Emerging Target in Cancer Therapy. Cancers 2022, 14, 2603. https://doi.org/ 10.3390/cancers14112603[2] Hiroyuki Takahash, Gumpei Yoshimatsu, Denise Louise Faustman. The Roles of TNFR2 Signaling in Cancer Cells and the Tumor Microenvironment and the Potency of TNFR2 Targeted Therapy. Cells. 2022;11(12):1952.[3] éva S. Vanamee, Faustman D L . TNFR2: A Novel Target for Cancer Immunotherapy. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2017.09.007

GARP（LRRC32）是I型跨膜蛋白，其中胞外区有两组10 LRRs (leucine-rich repeats) 区，通过富含脯氨酸的结构域（proline domain）连接。非活性状态（Latent）TGF-β 通过其LAP上的半胱氨酸与GARP形成二硫键的连接（图1A）。图1. GARP的结构（A）和功能（B）[1]GARP对TGF-β的成熟和活化起作用（图1B）。TGF-β最开始以同源二聚体的方式合成，被蛋白酶切割后形成非活性状态的TGF-β。GARP可以增强酶切及latent TGF-β的形成。在细胞膜表面，GARP/latent TGF-β复合物与整合素互作，进而释放成熟的TGF-β。成熟的TGF-β可与细胞表面的TGF-β受体互作引发下游信号通路。 GARP在活化的Treg细胞上选择性表达，调控TGF-β的分泌。TGF-β具有广泛的细胞活性。在肿瘤内部，TGF-βs，尤其是TGF-β1，会刺激基质细胞增生、新血管形成、癌细胞转移及抑制免疫细胞浸润。新研究发现，TGF-β是免疫检查点抑制剂在肿瘤微环境中耐药的主要原因。基于此，GARP/TGF-β是Treg细胞具有免疫抑制功能的核心机理之一。抑制Treg细胞表面的GARP功能，或靶向清除GARP+ Treg细胞，是此靶点的主要的成药机制。目前，针对GARP没有上市药物。处于临床阶段的GARP药物有以下三款。药物成药形式靶点研发公司开发阶段1DS-1055a单抗GARP第一三共Phase   I2ABBV-151单抗GARP/TGF-β1AbbviePhase   I3HLX-60单抗GARP复宏汉霖Phase   IDS-1055a是一款去岩藻糖的IgG1抗体，具有增强的ADCC效应，主要通过去除GARP+调节性T细胞（Treg）来发挥抗肿瘤作用[2]。目前正在实体瘤患者中开展I期临床试验（NCT04419532）。 ABBV-151是一款GARP/TGF-β1 IgG4抗体抑制剂，阻止TGF-β1的释放，从而减小TGF-β1的免疫抑制作用[3]。2018年，argenx将ARGX-115独家授权给AbbVie（ABBV-151）。目前ABBV-151正在进行单药及与PD-1单抗（ABBV-181）联用于实体瘤患者的I期临床试验(NCT03821935)。 HLX-60是一款GARP单抗，可阻断TGF-β1的释放，从而减小TGF-β1的免疫抑制作用；同时，还可以引发ADCC效应，清除GARP+ Treg。2022年8月26日，HLX-60与PD-1单抗联用于实体瘤患者的I期临床试验于澳大利亚获批[4]。百奥赛图自主研发了GARP人源化小鼠B-hGARP，用于靶向GARP的药物药效研究，助力新药研发。B-hGARP mice人GARP的种属特异性表达图2. RT-PCR分析纯合B-hGARP小鼠的种属特异性GARP mRNA的表达。鼠GARP mRNA只在野生型小鼠中检测到，人GARP mRNA只在纯合B-hGARP小鼠中检测到。图3. 利用流式细胞仪分析纯合B-hGARP小鼠的种属特异性GARP蛋白的表达。取野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H)的脾组织，用种属特异的抗GARP抗体进行流式分析。鼠GARP只在野生型小鼠中检测到，人GARP只在纯合B-hGARP小鼠中检测到。GARP人源化不影响白细胞各亚群比例图4. 脾脏白细胞亚群的流式分析。分离野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H) （n=3, 6周龄）的脾细胞并进行白细胞亚群流式分析。（A）代表性单活CD45+细胞的流式分析；（B）图A的统计分析。B-hGARP小鼠的T, B, NK, DC和单核/巨噬细胞的比例与野生型小鼠相似，证明人源化GARP不影响脾脏中这些细胞集群总体的发育、分化和分布。数值：平均值 ± SEM。图5. 脾脏T细胞亚群的流式分析。分离野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H)（n=3, 6周龄）的脾细胞并进行T细胞亚群流式分析。（A）代表性CD3+ T细胞的流式图分析；（B）图A的统计分析。B-hGARP小鼠的CD4+, CD8+ 和Treg细胞的比例与野生型小鼠相似，证明人源化GARP不影响脾脏中这些T细胞集群总体的发育、分化和分布。数值：平均值 ± SEM。人源化GARP同样也不影响血液中白细胞亚群和T细胞亚群总体的发育、分化和分布。（数据未展示）GARP人源化不影响小鼠血常规图6. B-hGARP小鼠血常规检测。采集野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H)（n=6, 6周龄）的血液进行血常规分析（CBC, complete blood cell count），所有检测项目均没有发现区别，说明GARP人源化并没有改变血细胞组成。数值：平均值 ± SEM。GARP人源化不影响小鼠血生化图7. B-hGARP小鼠血生化检测。采集野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H)（n=6，6周龄）的血清进行血生化分析，所有检测项目均没有发现区别。说明GARP人源化并没有改变血生化。数值：平均值 ± SEM。B-hGARP小鼠模型用于药效分析图8. mPD-1单抗和hGARP/latent-TGFβ1单抗联用在B-hGARP鼠中的抗肿瘤活性。（A）mPD-1单抗和自制hGARP/latent-TGFβ1单抗（ABBV-151）联用可抑制B-hGARP鼠中MC38肿瘤的生长。鼠结肠癌细胞系MC38（5E5）皮下植入纯合B-hGARP鼠（n=6，7周龄）中。当肿瘤长到50~70 mm3的时候对鼠进行分组，同时用mPD-1单抗和hGARP/latent-TGFβ1单抗联用治疗，治疗的剂量和时间如图所示。（B）治疗期间的体重变化。数值：平均值 ± SEM。图8A显示，mPD-1单抗和hGARP/latent-TGF-β1单抗联用可有效控制B-hGARP中肿瘤的生长，证明B-hGARP是一个强大的临床前模型，可用于抗人GARP抗体的体内药效评估。除B-hGARP小鼠外，在研品系还有B-hGARP/hTGF-β1双靶点人源化小鼠，敬请期待。参考资料[1] Metelli, Alessandra et al. “Immunoregulatory functions and the therapeutic implications of GARP-TGF-β in inflammation and cancer.” Journal of hematology & oncology vol. 11,1 24. 20 Feb. 2018, doi:10.1186/s13045-018-0570-z[2] Satoh, Kazuki et al. “Novel anti-GARP antibody DS-1055a augments anti-tumor immunity by depleting highly suppressive GARP+ regulatory T cells.” International immunology vol. 33,8 (2021): 435-446. doi:10.1093/intimm/dxab027[3] Cuende, Julia, et al. "Monoclonal antibodies against GARP/TGF-β1 complexes inhibit the immunosuppressive activity of human regulatory T cells in vivo." Science translational medicine 7.284 (2015): 284ra56-284ra56.[4] 复宏汉霖官网：https://www.henlius.com/en/NewsDetails-3737-26.html

银屑病（Psoriasis）是一种慢性复发性炎症性皮肤病，最常见的症状是红色发炎的皮疹或红斑，通常覆有银色鳞屑，严重影响患者的生活质量。在中国，银屑病的估计患病率为0.47%，影响超过700万患者；全球来看，至少有1.25亿人受此疾病困扰。银屑病可分为斑块型（最常见类型，占80-90%）、点滴型、脓疱型（局限性、泛发性-GPP，罕见且严重）、银屑病性关节炎等类型。自2004年起，每年的10月29日为世界银屑病日。银屑病是一种由多种致病因子（遗传、环境因素等）刺激引起的T细胞介导的针对皮肤的自身免疫病，不具有传染性。机制上，以往认为Th1通路是银屑病发病的主要原因，代表性细胞因子有TNFα、IL-12、IL-23。第一代治疗银屑病的生物制剂围绕TNFα展开，相继上市了融合蛋白、单抗等多个药物，目前仍占据着银屑病市场的主要份额。然而，TNFα抑制剂使用过程中常常会出现严重的不良反应，并且有40%的患者治疗效果不佳，再伴随着一系列生物类似药的上市，导致TNFα抑制剂面临困境和巨大的内部竞争。后来人们认识到Th17是银屑病发病的关键驱动因素。IL-17/IL-23是致病的主要因素。IL-17由Th17细胞分泌，促进其他细胞因子传递，并直接促进活化的角质细胞产生更多趋化因子。由于IL-17与银屑病发病的关联最为直接，所以抑制IL-17的药物以起效快著称。IL-23位于Th17细胞的上游，靶向IL-23的药物以其长效性闻名，但并不能完全抑制IL-17，因为除了Th17细胞外，还有其他细胞有可能产生IL-17。图1. 多种细胞因子在银屑病发病机制中的作用及其上下游关系[1] 图2. 靶向IL-23/IL-17通路的银屑病药物[2]主要银屑病上市药物 整理自科睿维安数据库这些上市药物中，不乏销售额亮眼的药物。其中，Ustekinumab单抗是第一款靶向IL-23的上市药，在获批银屑病后不断扩大适应症范围，销售额2019年已经达到66亿美元，全球排名第12，增速非常快。Secukinumab是第一款靶向IL-17的药物，全球销售额从2017年的21亿美元增长至2020年的40亿美元。同为IL-17抑制剂，礼来的ixekizumab在2020年的销售额亦增长至18亿美元。 目前，针对这些细胞因子，国内已有多款产品上市或在临床试验阶段，代表公司有恒瑞、智翔金泰、丽珠/康鑫合生、康方生物、君实生物、三生国健、荃信生物、海正药业等。 为了更好的帮助药企和生物技术公司研发银屑病药物，百奥动物研发了多种炎性细胞因子相关的人源化小鼠模型，用于候选药物的临床前体内药效检测。B-hIL17A mice品系名称：C57BL/6-Il17atm1(IL17A)/Bcgen常用名：B-hIL17A mice背景：C57BL/6货号：110053靶点别名：IL17A, CTLA-8, CTLA8, IL-17, IL-17A, IL17, ILA17, interleukin 17A 1.    IL17A蛋白的种属特异性表达用ELISA方法检测野生型小鼠 (+/+)和纯合B-hIL17A小鼠(H/H)中的IL17A表达情况。结果显示小鼠IL-17A蛋白仅在野生型小鼠 (+/+)中表达，而人IL-17A蛋白仅在纯合B-hIL17A小鼠(H/H)中表达。2.    B-hIL17A银屑病模型可用于抗人IL-17A抗体的体内药效评估               Ixekizumab在B-hIL17A 的IMQ银屑病模型里呈现剂量依赖的药效。10周龄B-hIL17A小鼠(H/H)去毛后，连续8天在后背皮肤上涂抹Imiquimod (IMQ)。同时，每组小鼠（雌性，10周龄，n=5）接受对照或不同剂量的ixekizumab（自制，低剂量为3mg/kg，高剂量为10mg/kg）治疗，每天记录小鼠的体重和皮肤炎症评分。并于实验终点（endpoint）收集皮肤进行分析。（A）药物治疗6天时，小鼠背部皮肤表型；（B）给药期间的小鼠体重变化；（C-E）背部皮肤的红疹评分、鳞屑评分以及综合评分。结果显示，ixekizumab可以减轻小鼠银屑病模型的临床表型。数值为平均值 ± SEM。对实验终点收集的皮肤进行苏木精-伊红染色(H&E)，分析。（A）背部皮肤的H&E染色结果示意图；（B）背部皮肤病理评分；（C）小鼠表皮厚度。结果显示，ixekizumab可以减少角质细胞扩增和炎性细胞的浸润，缓解小鼠银屑病模型的皮肤炎症。数值为平均值 ± SEM。Secukinumab在B-hIL17A的IMQ银屑病模型里呈现剂量依赖的药效。B-hIL17A小鼠(H/H)去毛后，连续5天在后背皮肤上涂抹IMQ。同时，每组小鼠（雌性，8周龄，n=6）接受对照或不同剂量的secukinumab（商业化药品，低剂量为10mg/kg，高剂量为30mg/kg）治疗，每天记录小鼠的体重和皮肤炎症评分。并于实验终点收集皮肤进行分析。（A）银屑病造模（B）第0天和5天时，小鼠背部皮肤表型；（C）给药期间的小鼠体重变化；（D-F）背部皮肤的红疹评分、鳞屑评分以及综合评分。结果显示，secukinumab可以减轻小鼠银屑病模型的临床表型。数值为平均值 ± SEM。对实验终点收集的皮肤进行苏木精-伊红染色(H&E)，分析。（A）背部皮肤的H&E染色结果示意图；（B）背部皮肤病理评分；（C）小鼠表皮厚度。结果显示，secukinumab可以减少角质细胞扩增和炎性细胞的浸润，缓解小鼠银屑病模型的皮肤炎症。数值为平均值 ± SEM。B-hIL17A/hIL17F mice品系名称：C57BL/6-Il17atm1(IL17A) Il17ftm1(IL17F)/Bcgen常用名：B-hIL17A/hIL17F mice背景：C57BL/6货号：120554靶点别名：IL17A, interleukin 17A, CTLA-8, CTLA8, IL-17, IL-17A, IL17, ILA17; IL17F, interleukin 17F, CANDF6, IL-17F, ML-1, ML1 1.     IL17A和IL17F蛋白的种属特异性表达用ELISA方法检测野生型小鼠 (+/+)和纯合B-hIL17A/hIL17F小鼠(H/H)中IL17A和IL17F的表达情况，结果显示小鼠IL17A和IL17F蛋白仅在野生型小鼠 (+/+)中表达，而人IL-17A和IL17F蛋白仅在纯合B-hIL17A/hIL17F小鼠 (H/H)中表达。2.    B-hIL17A/hIL17F银屑病模型可用于抗人IL-17A/IL-17F抗体的体内药效评估Bimekizumab在B-hIL17A/hIL17F 的IMQ银屑病模型里呈现剂量依赖的药效。B-hIL17A小鼠(H/H)去毛后，连续8天在后背皮肤上涂抹IMQ。同时，每组小鼠（雌性，10周龄，n=5）接受对照或不同剂量的bimekizumab（自制，低剂量1mg/kg，高剂量3mg/kg）治疗，每天记录小鼠的体重和皮肤炎症评分。并于实验终点收集皮肤进行分析。（A）6天治疗结束后，小鼠背部皮肤表型；（B）给药期间的小鼠体重变化；（C-E）背部皮肤的红疹评分、鳞屑评分以及综合评分。结果显示，bimekizumab可以减轻小鼠银屑病模型的临床表型。数值为平均值 ± SEM。对实验终点收集的皮肤进行苏木精-伊红染色(H&E)，分析。（A）背部皮肤的H&E染色结果示意图；（B）背部皮肤病理评分；（C）小鼠表皮厚度。结果显示，bimekizumab可以减少角质细胞扩增和炎性细胞的浸润，缓解小鼠银屑病模型的皮肤炎症。数值为平均值 ± SEM。 B-hIL17RA mice品系名称：C57BL/6-Il17ratm1(IL17RA)/Bcgen常用名：B-hIL17RA mice背景：C57BL/6货号：110054靶点别名：IL17RA, CANDF5, CD217, CDw217, IL-17RA, IL17R, IMD51, hIL-17R, interleukin 17 receptor A1.     IL17RA蛋白的种属特异性表达取野生型小鼠 (+/+)和杂合B-hIL17RA小鼠(H/+)的骨髓，用流式方法检测IL17RA的表达。结果显示小鼠IL17RA在野生型小鼠 (+/+)和杂合B-hIL17RA小鼠(H/+)中表达；而人IL17RA仅在杂合B-hIL17RA小鼠(H/+)中表达。 B-hTNFA mice品系名称：C57BL/6-Tnftm1(TNF)/Bcgen常用名：B-hTNFA mice背景：C57BL/6货号：110002靶点别名：TNF (tumor necrosis factor, TNFA)1.    TNFα蛋白的种属特异性表达用ELISA方法检测野生型小鼠 (+/+)和纯合B-hTNFA小鼠(H/H)中的TNFα表达情况。结果显示小鼠TNFα蛋白仅在野生型小鼠 (+/+)中表达，而人TNFα蛋白仅在纯合B-hTNFA小鼠(H/H)中表达。B-hTNFA/hIL17A mice品系名称：C57BL/6-Tnftm1(TNF)Il17atm1(IL17A)/Bcgen常用名：B-hTNFA/hIL17A mice背景：C57BL/6货号：120548靶点别名：TNF (tumor necrosis factor, TNFA); IL17A (interleukin 17A) 1.     TNFα和IL17A蛋白的种属特异性表达用ELISA方法检测野生型小鼠(+/+)和纯合B-hTNFA/hIL17F小鼠(H/H)中TNFA和IL17A的表达情况，结果显示小鼠的TNFA和IL17A蛋白仅在野生型小鼠(+/+)中表达，而人TNFA和IL17A仅在纯合B-hTNFA/hIL17A小鼠 (H/H)中表达。2.    B-hTNFA/hIL17A银屑病模型可用于抗人TNFα x IL17A双抗的体内药效评估TNFα x IL17A双抗在B-hTNFA/hIL17A小鼠的IMQ银屑病模型里呈现剂量依赖的药效。B-hTNFA/hIL17A小鼠(H/H)去毛后，连续6天在后背皮肤上涂抹IMQ。同时，每组（雌性，10周龄，n=5）小鼠接受对照或不同剂量的TNFα x IL17A双抗（自制）治疗，每天记录小鼠的体重和皮肤炎症评分。并于实验终点收集皮肤进行分析。（A）6天治疗结束后，小鼠背部皮肤表型；（B）给药期间的小鼠体重变化；（C-E）背部皮肤的红疹评分、鳞屑评分以及综合评分。结果显示，TNFα x IL17A双抗可以减轻小鼠银屑病模型的临床表型。数值为平均值 ± SEM。对实验终点收集的皮肤进行苏木精-伊红染色(H&E)，分析。（A）背部皮肤的H&E染色结果示意图；（B）背部皮肤病理评分；（C）小鼠表皮厚度。结果显示，TNFα x IL17A双抗可以减少角质细胞扩增和炎性细胞的浸润，缓解小鼠银屑病模型的皮肤炎症。数值为平均值 ± SEM。B-hIL23A/hIL12B mice品系名称：C57BL/6-Il23atm1(IL23A)Il12btm1(IL12B)/Bcgen常用名：B-hIL23A/hIL12B mice背景：C57BL/6货号：120553靶点别名：IL23A (interleukin 23 subunit alpha), IL12B (interleukin 12B)1.    IL23蛋白的种属特异性表达 用ELISA方法检测野生型小鼠(+/+)和纯合B-hIL23A/hIL12B小鼠(H/H)中IL23A的表达情况，结果显示小鼠IL23A仅在野生型小鼠WT (+/+)中表达，而人IL-23仅在纯合B-hIL23A/hIL12B 小鼠(H/H)中表达。3.    B-hIL23A/hIL12B银屑病模型可用于抗人IL-23A抗体的体内药效评估IL23A单抗在B-hIL23A/hIL12B小鼠的IMQ银屑病模型里呈现剂量依赖的药效。B-hIL23A/hIL12B小鼠(H/H)去毛后，连续6天在后背皮肤上涂抹IMQ。同时，每组小鼠接受对照或不同剂量的IL-23A单抗治疗，每天记录小鼠的体重和皮肤炎症评分。 （A）给药期间的小鼠体重变化；（B-D）背部皮肤的红疹评分、鳞屑评分以及综合评分。结果显示，IL-23A单抗可以减轻小鼠银屑病模型的临床表型。数值为平均值 ± SEM。 B-hIL36R mice品系名称：C57BL/6-Il1rl2tm1(IL1RL2)/Bcgen常用名：B-hIL36R mice背景：C57BL/6货号：110084靶点别名：IL1RL2, IL-1Rrp2, IL-36R, IL1R-rp2, IL1RRP2, interleukin 1 receptor like 21.    IL36R蛋白表达的免疫组化分析在野生型小鼠 (+/+)和纯合B-hIL36R小鼠(H/H)建立银屑病模型后，取小鼠背部皮肤和小肠，用免疫组化方法分析IL36R的表达。由于IL36R抗体是人鼠交叉识别，所以在野生型小鼠 (+/+)和纯合B-hIL36R小鼠 (H/H)中均可以检测到IL36R的表达。箭头所指为阳性染色细胞。2.    B-hIL36R小鼠银屑病模型可用于抗人IL-36R抗体的体内药效评估Spesolimab在B-hIL36R小鼠的IMQ银屑病模型里呈现剂量依赖的药效。B-hIL36R小鼠(H/H)去毛后，连续6天在后背皮肤上涂抹IMQ。同时，每组小鼠（雌性，9周龄，n=6）接受对照或不同剂量的spesolimab（商业化药品，自制，低剂量为1mg/kg，中剂量：3mg/kg，高剂量为10mg/kg）治疗，每天记录小鼠的体重和皮肤炎症评分。并于实验终点收集皮肤进行分析。（A）银屑病造模（B）第0天和6天时，小鼠背部皮肤表型；（C）给药期间的小鼠体重变化；（D-F）背部皮肤的红疹评分、鳞屑评分以及综合评分。结果显示，spesolimab可以减轻小鼠银屑病模型的临床表型。数值为平均值 ± SEM。对实验终点收集的皮肤进行苏木精-伊红染色(H&E)，分析。（A）背部皮肤的H&E染色结果示意图；（B）背部皮肤病理评分；（C）小鼠表皮厚度。结果显示，spesolimab可以减少角质细胞扩增和炎性细胞的浸润，缓解小鼠银屑病模型的皮肤炎症。数值为平均值 ± SEM。百奥动物银屑病相关人源化小鼠模型总结除以上产品鼠外，还有B-hIL22/hIL22RA人源化小鼠正在开发中。 参考资料1. 银屑病靶点IL-17A，智翔金泰自免单抗再批临床，bioSeedin柏思荟2. Tsukazaki H, Kaito T. The Role of the IL-23/IL-17 Pathway in the Pathogenesis of Spondyloarthritis. International Journal of Molecular Sciences. 2020; 21(17):6401.3. Uppala, Ranjitha et al. "Autoinflammatory psoriasis"-genetics and biology of pustular psoriasis.” Cellular & molecular immunology vol. 18,2 (2021): 307-317. 

不死的癌症类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是人类最常见的自身免疫性疾病之一，其临床症状主要表现有全身关节肿胀、疼痛和运动失调等，病情极其严重的甚至可能会导致残疾。而病理主要表现出增生性滑膜炎，软骨损伤以及骨结构的破坏。为了更好的研究人类的类风湿性关节炎，研究者在小鼠上开发出多种能模拟人类类风湿性关节炎的动物模型，而这之中胶原诱导型关节炎，能最大程度反映出人类类风湿性关节炎的临床和病理特征。Rheumatoid Arthritis百奥动物在不同品系的小鼠（C57BL/6、DBA）上都建立了稳定的胶原诱导型关节炎疾病模型（Collagen-Induced Arthritis，CIA），可用于相关药物的药效评价。类风湿性关节炎 (RA) 的病理及软骨和骨破坏的机制RA 的特征是增生性滑膜（血管翳）和 T 细胞的过度免疫反应。血管翳包括 T 细胞、滑膜成纤维细胞和巨噬细胞，可产生炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子 (TNF)-α、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6和IL-17。相关数据展示01RA/CIA 模型介绍 临床评分利用胶原（CII）在C57BL/6小鼠中诱导关节炎模型。（A）小鼠体重变化；（B）临床评分；（C）小鼠发病率。结果显示：在造模组（G2）中，小鼠的临床评分显著增加，提示关节炎模型建立成功。 病理分析C57BL/6小鼠关节炎模型建立后的病理分析。（A）病理评分；（B）病理切片H&E染色。造模组动物全部或部分关节可见皮下混合炎细胞浸润(a)，关节周围狭窄（b），踝关节和/或趾骨关节软骨和骨组织破坏（c）等关节炎病变，进一步提示关节炎模型建立成功。02C57BL/6小鼠关节炎模型用于评价甲氨蝶呤（MTX）药效 临床评分甲氨蝶呤在小鼠关节炎模型中的药效作用。（A）小鼠体重变化；（B）临床评分；（C）小鼠发病率。结果显示：在造模组（G2）中，小鼠的临床评分显著增加，表明CIA模型建立成功，同时相比于未造模组（G1），体重波动更加明显。在给于甲氨喋呤（MTX）后，治疗组（G3）的平均临床评分显著低于造模组，证明小鼠的病情得到了有效控制。另外，在发病率方面，治疗组的发病率最大值为40%，也明显低于造模组近80%的发病率，提示小分子药甲氨喋呤对该疾病具有治疗作用。 病理分析甲氨喋呤在小鼠关节炎模型中药效作用的病理分析。（A）病理评分；（B）病理切片H&E染色。病理结果显示：未造模组（G1）动物镜下未见明显异常改变，踝关节软骨表面光滑，关节腔明显（a）。造模组（G2）动物踝关节周围组织，可见皮下混合炎细胞浸润，关节滑膜炎和/或血管翳形成（c），关节软骨破坏，关节腔消失，部分骨组织融合（b）。与G2造模组相比，治疗组虽然有部分踝关节周围皮下组织水肿和炎细胞浸润（d），但其病理评分均值明显低于G2组，甲氨喋呤对动物关节炎病变具有治疗作用。03B-hIL6/hIL6R小鼠关节炎模型用于评价抗人IL6抗体sirukumab药效 临床评分抗人IL-6抗体sirukumab（内部合成）在小鼠关节炎模型中药效作用。（A）小鼠体重变化；（B）临床评分。结果显示：在模型成功建立后，治疗组（G3,G4）小鼠用sirukumab抗体进行治疗，显示出治疗作用，且表现出剂量依赖性。 病理分析抗人IL-6抗体sirukumab（内部合成）在小鼠关节炎模型中药效作用的病理分析。（A）病理切片H&E染色；（B）病理评分。结果显示：未造模组（G1）动物未见明显异常改变，踝关节软骨表面光滑，关节腔明显。造模组（G2）动物踝关节骨组织损伤（d），关节腔或关节周围腔隙消失（e），并出现血管翳（a）。与造模组相比，抗体药治疗低剂量组（G3）有部分炎细胞浸润（b）和血管翳（a）生成，并表现出滑膜增生（c）。但在抗体药治疗高剂量组（G4）,仅有部分血管翳，关节炎病变基本消失，关节腔明显，提示sirukumab对小鼠关节炎具有治疗作用。04服务项目更多药效相关服务，CAIA引起的关节炎模型，骨关节炎模型，骨质疏松模型，正在研究进行中，感兴趣的欢迎联系我们获取资料。想要获取更多百奥动物自主研发的自身免疫性疾病模型信息，请访问百奥动物官网。参考文献：1. Tateiwa, D., Yoshikawa, H. & Kaito, T. Cartilage and Bone Destruction in Arthritis: Pathogenesis and Treatment Strategy: A Literature Review. Cells 8, doi:10.3390/cells8080818 (2019).2. McInnes IB, et al. Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Nat Rev Immunol 7, 429-42 (2007).

骨质疏松症被定义为一种全身性骨骼疾病，其特征是骨量低，骨组织微结构恶化，从而导致骨脆性增加，易发生骨折[1]。骨质疏松症的基本发病机制是骨形成和骨吸收的失调。据统计，目前全世界大约2亿人患骨质疏松症，跃居各种常见病的第7位。据悉，2015～2019年全球骨质疏松症药物市场相对稳定，伴有小幅增长，2019年全球销售额为97.09亿美元。从TOP20的产品看，以RANKL抑制剂、甲状旁腺激素类似物、双膦酸盐类药物、钙剂与维生素D、选择性雌激素受体调节剂这五大类药物为主[2]。骨质疏松症新药研究进展进军骨质疏松症市场的两个新秀为地舒单抗和罗莫单抗，其中地舒单抗是首个且唯一获批的靶向RANKL单克隆抗体，通过阻断RANK和RANKL的结合来抑制破骨细胞的活性，在抑制成熟破骨细胞功能的同时，还可以抑制破骨前体细胞成熟，减少骨质吸收、促进骨重建，从而延迟和减少骨相关事件发生。值得一提的是，地舒单抗虽然获批较晚，但却是目前骨质疏松症药物市场的佼佼者。而罗莫单抗是一种人源化单克隆抗体（IgG2），可以抑制骨硬化蛋白（SOST）的活性，在加速骨形成的同时减少骨吸收，增加骨密度。除此之外，骨质疏松症治疗新靶点也在不断被挖掘，目前全球还有多款在研治疗骨质疏松症的药物，部分在研新药详情见下表：百奥动物骨质疏松症模型卵巢切除（OVX）小鼠是一种公认的人类绝经后骨质疏松症(PMOP)的体内模型。采用骨矿物质密度(BMD)测量、Micro-CT分析和组织形态学分析对卵巢切除小鼠进行评价[3,4]。百奥动物建立了稳定的卵巢切除术诱导的C57BL/6小鼠骨质疏松症模型，可用于骨质疏松症的临床前研究和药理药效学评价。骨质疏松症模型构建及验证骨质疏松症小鼠模型的构建卵巢切除诱导小鼠体重增加，子宫重量减轻卵巢切除诱导小鼠骨质流失(Micro-CT)C57BL/6小鼠在第0天切除卵巢。手术后6周，取出骨头(C)和子宫(B)进行检测。每周记录体重(A)，实验终点记录子宫重量 (B)。实验结果表明，卵巢切除术导致小鼠体重增加，子宫重量减轻且骨质流失。数值以平均值±标准误表示。卵巢切除诱导骨质疏松症的病理分析卵巢切除6周后进行病理分析。实验结果表明，接受卵巢切除手术的小鼠骨小梁面积减少。数值以平均值±标准误表示。骨质疏松症模型可提供的检测项目骨质疏松症靶点人源化小鼠模型百奥动物针对骨质疏松症相关靶点开发了系列人源化小鼠模型，助力相关药物研发进程。参考资料：[1]. Eastell R, O‘Neill TW , Hofbauer LC et al. Postmenopausal osteoporosis. Nat Rev Dis Primers. 2016, 2:16069.[2]. https://mp.weixin.qq.com/s/E7M_lJc4gjaY3cHjoMG7xA[3]. Wang HC, Zhou KF, Xiao FZ et al. Identification of circRNA-associated ceRNA network in BMSCs of OVX models for postmenopausal osteoporosis. Sci Rep. 2020, 10(1):10896.[4]. Chen K, Qiu PC, Yuan Y et al. Pseurotin A Inhibits Osteoclastogenesis and Prevents Ovariectomized-Induced Bone Loss by Suppressing Reactive Oxygen Species. Theranostics. 2019, 9(6):1634-1650.

CCN蛋白家族是一组细胞间基质蛋白，由CCN1-6六名成员组成。除CCN5缺乏CT模块外，CCN家族蛋白均包含4个保守的串联模块：1）胰岛素样生长因子结合蛋白模块（IGFBP）；2）血管性血友病因子C型重复模块（VWC）；3）血小板反应蛋白1型重复模块（TSP-1）；以及4）含有半胱氨酸羧基端结构的模块（CT）。典型的CCN蛋白由5个外显子编码。CCN蛋白氨基酸同源性为60%，共有38个半胱氨酸残基，这些残基在位置和数量上都严格保守。由于信号肽的存在，CCN蛋白的特点是在细胞质中表达，并以旁分泌的形式在外界环境中积累。它们的四个离散功能域决定了它们相互作用的结合配体的类型，包括不同的整合素，HSPGs、IGFs、TGFb和VEGF等，导致全长CCN蛋白具有多种生物学功能。图1 CCN蛋白结构[1]各种刺激诱导的CCN蛋白在各种细胞中被激活，可直接与细胞表面整合素、生长因子、细胞因子等ECM蛋白相互作用，这些反应诱导肌成纤维细胞的生长和衰老，导致基质重塑。图2 CCN蛋白在纤维化中的作用[2]CCN家族在生物反应和疾病中的几个主要作用：1）伤口愈合和纤维化疾病：纤维化是组织再生过程中CCN家族网络失衡的结果。促纤维化因子TGF-β通过诱导CCN1、CCN2、CCN4的表达，抑制CCN3的表达，在心脏纤维化中发挥促纤维化作用或诱导真皮成纤维细胞衰老（CCN1）；2）炎症：CCN1、CCN2、CCN4被TGF-β上调，而CCN3被相同的细胞因子以相反的方式调节；3）恶性肿瘤：肿瘤微环境（TME）增加了肿瘤的复杂性，CCN蛋白可能是一个平衡TME的潜在靶点。CCN蛋白根据肿瘤类型的不同，在肿瘤发生和发展过程中起到正向或负向作用。   表1 CCN1-6在泛癌中表达水平变化[1]大部分情况下，CCN1、CCN2、CCN4通常与促进细胞增殖和肿瘤生长有关，CCN3、CCN5、CCN6则与抑制这些过程有关。而CCN蛋白最终的生物学特性可能依赖于不同的组合，在肿瘤治疗中应作用于不同组合的CCN蛋白来重新平衡TME。下面我们将重点介绍一下促肿瘤生长的CCN1、CCN2、CCN4。CCN1/CYR61肿瘤的发生发展改变了细胞外基质的组成和物理性质。基质刚度的增加对肿瘤生长和转移有深远的影响。CCN1又称富半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich 61, CYR61），其在内皮细胞中受刚度的高度调控。在体外，刚度诱导的CCN1激活β-连环蛋白核转位和信号转导，以上调内皮细胞表面的N-钙粘蛋白水平，促进N-钙粘蛋白依赖的癌细胞-内皮相互作用。而敲除内皮细胞中的CCN1可以抑制黑色素瘤细胞与血管的结合，抑制瘤细胞通过血管转移过程。因此，靶向硬化诱导的血管改变(如CCN1)是一种潜在的、但尚未被重视的损害转移的机制。图3 肿瘤血管系统中CCN1的作用模式[3]CCN2/CTGFCCN2又称结缔组织生长因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF），是一种促纤维化介质。在大多数纤维性疾病中，生化或机械刺激诱导产生的CCN2与TGF-β协同促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化。CCN2还与恶性肿瘤的侵袭有关，CCN2由肿瘤细胞产生并作用于自身，主要抑制其侵袭性表型。但由于CCN2可以通过旁分泌的方式激活血管内皮细胞和破骨细胞祖细胞，促进血管生成和骨吸收，从而又促进了肿瘤的侵袭和转移。因此，CCN2既可以成为一个促进组织再生的潜在的治疗工具，又可以成为对抗纤维化及其相关疾病，以及肿瘤转移的重要靶点。图4 CCN2在病理纤维化中的分子作用[4]CCN4/WISP-1CCN4又称Wnt1诱导的信号通路蛋白（Wnt1-Inducible Signaling pathway Proteins, WISP-1），由肿瘤细胞和基质成纤维细胞产生和分泌(蓝色箭头)。然后，分泌的CCN4可通过旁分泌和自分泌两种机制对肿瘤细胞和血管内皮细胞发挥作用(红色箭头)。CCN4能够结合到细胞外基质蛋白(如纤维连接蛋白;绿色形状)，以及细胞膜上的整合素(蓝色形状)，从而调节细胞与细胞外基质的相互作用。图5 CCN4作为肿瘤微环境中的自分泌和旁分泌介质[5]最新研究进展CCN1:目前针对CCN1靶点开发的药物主要是小分子药物，进展最快的是Asahi Kasei等公司的Zoledronate/Zoledronic acid monohydrate，该药物已在2000年上市，用于治疗癌症，骨关节炎，疼痛等多种疾病。目前只有一种针对CCN1的抗体药物，是罗氏公司的Mab 420/MOR-420，目前处于生物测试阶段，且并未处于活跃状态。CCN2：目前针对CCN2靶点，开发药物进展最快的是FibroGen，该公司的Pamrevlumab用于抑制结缔组织生长因子（CTGF）的活性，目前正在推进临床III期试验，适应症包括：胰腺癌、杜氏肌营养不良（DMD）和特发性肺纤维化（IPF）。同时还在进行治疗急性 COVID-19 住院患者的 II 期临床试验。该药已在美国获得孤儿药资格，用于治疗特发性肺纤维化、胰腺癌和杜氏肌营养不良症。在欧盟还指定了治疗杜氏肌营养不良症的孤儿药资格。CCN4:目前尚未有该靶点的临床在研药物。B-hCCN1 mice基本信息mRNA表达分析小鼠CCN1的mRNA仅在野生小鼠(+/+)的卵巢中检测到。人CCN1的mRNA仅在纯合B-hCCN1小鼠(H/H)中检测到，在野生小鼠中未检测到。蛋白表达分析利用western blot分析纯合B-hCCN1小鼠中种属特异性CCN1的表达。取野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hCCN1小鼠(H/H)的脾组织，用抗CCN1抗体进行western blot分析。因为该抗体与人CCN1和小鼠CCN1有交叉反应，CCN1在野生小鼠和纯合B-hCCN1小鼠中均可检测到。B-hCCN2 mice基本信息：mRNA表达分析：小鼠CCN2的mRNA仅在野生小鼠(+/+)的肾脏中检测到。人CCN2的mRNA仅在纯合B-hCCN2小鼠(H/H)中检测到，在野生小鼠中未检测到。蛋白表达分析：利用western blot分析纯合B-hCCN2小鼠中种属特异性CCN2的表达。取野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hCCN2小鼠(H/H)的肾组织，用抗CCN2抗体进行western blot分析。因为该抗体与人CCN2和小鼠CCN2有交叉反应，CCN2在野生小鼠和纯合B-hCCN2小鼠中均可检测到。体内药效：抗人CCN2抗体可以抑制博来霉素诱导的B-hCCN2小鼠肺部的胶原蛋白沉积。将B-hCCN2小鼠分为3组：生理盐水对照组，博来霉素处理的纤维化组以及博来霉素处理的纤维化+Pamrevlumab治疗组。（A）Pamrevlumab治疗能够改善博来霉素诱导的B-hCCN2小鼠的体重减轻。该模型中的纤维化通过总肺羟脯氨酸（HYP）的标准测量值进行评分。（B）与生理盐水对照组相比，博来霉素的诱导增加了HYP含量，而用Pamrevlumab治疗可以降低肺HYP含量。B-hCCN4 mice基本信息：mRNA表达分析：小鼠CCN4的mRNA仅在野生小鼠(+/+)的卵巢中检测到。人CCN4的mRNA仅在纯合B-hCCN4小鼠(H/H)中检测到，在野生小鼠中未检测到。蛋白表达分析：利用western blot分析纯合B-hCCN4小鼠中种属特异性CCN4的表达。取野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hCCN4小鼠(H/H)的肾脏和脾脏组织，用抗CCN4抗体进行western blot分析。因为该抗体与人CCN4和小鼠CCN4有交叉反应，CCN4在野生小鼠和纯合B-hCCN4小鼠中均可检测到。参考文献[1] Jia Q, et al. CCN Family Proteins in Cancer: Insight Into Their Structures and Coordination Role in Tumor Microenvironment. Front Genet. 2021 Mar 23;12:649387. [2] Sun, C., et al. Emerging role of CCN family proteins in fibrosis. Journal of cellular physiology. 2021 Jun;236(6):4195-4206. [3]Reid SE, et al. Tumor matrix stiffness promotes metastatic cancer cell interaction with the endothelium. EMBO J. 2017 Aug 15;36(16):2373-2389. [4] Kubota S, et al. Cellular and molecular actions of CCN2/CTGF and its role under physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 2015 Feb;128(3):181-96. [5] Nivison MP, et al. The role of CCN4/WISP-1 in the cancerous phenotype. Cancer Manag Res. 2018 Aug 27;10:2893-2903.