尽管调节T细胞（Treg）对维持机体免疫耐受避免自身免疫疾病很重要，但它们也抑制了肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的抗肿瘤免疫反应。TME中Treg细胞数量增加、Teff/Treg比例降低与许多癌症的不良预后相关。因此，Treg清除、控制Treg细胞活性与浸润是有潜力的肿瘤免疫疗法。图. Treg靶向的抗肿瘤疗法[1]1去除瘤内Treg细胞a)    通过靶向IL-2受体CD25 (IL-2RA)来实现Treg清除，如Dadizumab治疗脑胶质瘤。但这种疗法的治疗窗口较小。因为CD25既是Treg也是Teff细胞活化后上调的分子。靶向CD25的Treg清除也会伴随Teff的清除。罗氏正在开发新型IL-2非阻断CD25抗体（RG6292），在不影响Teff细胞上的IL-2信号的前提下特异性清除Treg。b)    通过靶向CTLA-4来实现Treg清除。BMS正在开发第二代CTLA-4抑制剂BMS-986218，对Yervoy进行Fc改造以增强ADCC作用清除Treg。c)    靶向TME中Treg的其他表面标志物：ICOS、OX40、GITR、LAG-3、CCR4（mogamulizumab，去岩藻糖的CCR4单抗，通过增强ADCC作用清除Treg）、CCR8、TNFR2。d)    通过鉴定TME Treg marker来实现特异性TME中Treg的清除，而不影响其他正常组织中的Treg。如普米斯生物的双抗CCR8 x CTLA-4。2阻止Treg细胞浸润Treg在趋化因子的作用下迁移至TME，如CCL28-CCR10，CCL1-CCR8，CCL22-CCR4（mogamulizumab）的相互作用。通过中和抗体封闭分泌型CCL1或CCL22；阻断CCR4和CCR8可有效阻止Treg细胞迁移。3使瘤内Treg对免疫检查点阻断剂敏感免疫检查点抑制剂PD-(L)1疗法总体上只能使约20%的病人获得较好的响应，原因之一便是TME内存在异常活化的Treg细胞。由于Treg表达抑制型受体TIGIT、LAG3、CTLA-4、PD-1、TIM-3等，使得Treg具有高度免疫抑制活性。通过抑制型受体的联合阻断[2]可有效降低Treg的免疫抑制能力。4靶向T细胞的共刺激信号a)    GITR激活可促进Teff功能、抑制Treg功能；GITR激动剂DTA-1可使瘤内Treg减少50%以上。b)    OX40与配体结合后可增加Teff和记忆T细胞的存活和扩增，同时降低Treg的免疫抑制活性；OX40激活剂OX86在B16F10小鼠黑色素瘤模型中可诱导TME中Treg深度耗竭并增加CD8+ Teff细胞的浸润。c)    ICOS拮抗剂MEDI-570、激动剂JTX-2011（vopratelimab）可在不影响外周Treg频率的情况下降低小鼠瘤内Treg的频率。5靶向Treg分泌的抑制型细胞因子a)   抑制TGF-b：直接结合成熟的TGFb：M7824；作用于GARP：DS1055a去岩藻糖的GARP抗体，可消耗TME中的Treg；作用于整合素αVβ8b)    抑制IL-10c)    IL-35拮抗剂6改变Treg脆性NRP-1的缺失和IFNg的表达可破坏Treg细胞的免疫抑制功能。NRP1+ Treg在多种人类癌症中富集。NRP-1拮抗剂Fc（AAG）-TPP11可选择性抑制TME中NRP1+ Treg的功能和稳定性，而不影响外周Treg[3]。7靶向Treg代谢a)    Teff依赖糖酵解，而瘤内低糖、缺氧、酸性环境抑制Teff的功能。但TME内Treg利用乳酸替代途径来维持其抑制功能。二甲双胍可对Treg代谢重编程至糖酵解，从而减弱Treg的免疫抑制功能。b)    癌细胞加速的糖酵解消耗TME中的葡萄糖并增加乳酸和脂肪酸含量。脂肪酸代谢也促进Treg细胞发育。抑制脂质合成和代谢信号的SREBP可释放TME中的Treg抑制[4]。c)    TME内的IDO和腺苷可促进Treg增殖和抑制功能。IDO抑制剂、CD39/CD73/A2AR抑制剂可抑制Treg活性。为了更好的研究、开发Treg疗法，百奥动物开发了一系列Treg靶点人源化小鼠，助力相关药物的临床前药效评估。B-hCTLA4/hCCR8 mice 品系名称：C57BL/6-Ctla4tm1(CTLA4) Ccr8tm1(CCR8) /Bcgen通用名：B-hCTLA4/hCCR8 mice背景：C57BL/6货号：112251hCTLA-4蛋白的瘤内T细胞表达分析hCTLA-4的流式表达分析。小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植至纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠（雌性，7周龄，n=3）。当肿瘤生长至400-700 mm3时对其进行流式检测。人CTLA-4仅在纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠的T细胞中检测出来。hCCR8蛋白的瘤内T细胞表达分析CCR8的流式表达分析。小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植至纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠（雌性，7周龄，n=3）。当肿瘤生长至400-700 mm3时对其进行流式检测。人CCR8仅在纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠的T细胞中检测出来。B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2 mice 品系名称：C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)Cd274tm1(CD274)Tnfrsf1btm1(TNFRSF1B)/Bcgen通用名：B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2 mice背景：C57BL/6货号：130849抗人PD-1抗体和抗人TNFR2抗体联合治疗抗人PD-1和抗人TNFR2抗体联用可抑制B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠中hPD-L1 MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌hPD-L1 MC38细胞皮下移植至纯合B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠（雌性，6-7周龄，n=5）。当肿瘤体积达到约100 mm3时对小鼠进行分组给药。帕博丽珠单抗（PD-1抗体）和抗人TNFR2抗体的给药剂量和频次如图所示。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。所有抗体均为自制。可以看出，两药联用比单药均有更强的肿瘤抑制作用，证明B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠是验证hPD-1抗体和hTNFR2抗体体内药效的有力临床前模型。B-hIL2RA mice品系名称：C57BL/6-Cd25tm1(CD25)/Bcgen通用名：B-hIL2RA mice背景：C57BL/6货号：110066抗人IL-2RA抗体体内药效抗人IL-2RA抗体可抑制B-hIL2RA小鼠中MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植至纯合B-hIL2RA小鼠（雌性，6-7周龄，n=8）。抗人IL-2RA抗体（211At-7G7/B6 和 M-A251）的给药剂量和频次如图所示。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。可以看出，B-hIL2RA小鼠是验证hIL-2RA抗体体内药效的有力临床前模型。B-hGARP mice品系名称：C57BL/6-Lrrc32tm1(LRRC32)/Bcgen通用名：B-hGARP mice背景：C57BL/6货号：110102抗鼠PD-1抗体和抗人GARP/latent-TGFb1抗体联合治疗抗鼠PD-1抗体和抗人GARP/latent-TGFb1抗体联用可抑制B-hGARP小鼠中MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌MC38细胞（5x105）皮下移植至纯合B-hGARP小鼠（雌性，7周龄，n=6）。当肿瘤体积达到50-70 mm3时对小鼠进行分组给药。抗鼠PD-1抗体和抗人GARP/latent-TGFb1抗体（自制）的给药剂量和频次如图所示。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。可以看出，两药联用比单药均有更强的肿瘤抑制作用，证明B-hGARP小鼠是验证hGARP抗体体内药效的有力临床前模型。B-hPD-1/hCD39 mice品系名称：C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)Entpd1tm3(ENTPD1)/Bcgen通用名：B-hPD-1/hCD39 mice背景：C57BL/6货号：121179抗人CD39抗体和抗人PD-1抗体联合治疗抗人CD39和抗人PD-1抗体联用可抑制B-hPD-1/hCD39小鼠中MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌B-hPD-L1 MC38细胞（5x105）皮下移植至纯合B-hPD-1/hCD39小鼠（雌性，7-8周龄，n=6）。当肿瘤体积达到100-150 mm3时对小鼠进行分组给药-帕博丽珠单抗（PD-1抗体）和抗人CD39抗体（SRF367A）。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。所有抗体均为自制。可以看出，两药联用比单药均有更强的肿瘤抑制作用，证明B-hPD-1/hCD39小鼠是验证hCD39抗体和hPD-1抗体体内药效的有力临床前模型。部分Treg靶点相关品系参考文献1.     Shan, Feng et al. “Therapeutic targeting of regulatory T cells in cancer.” Trends in cancer vol. 8,11 (2022): 944-961. doi:10.1016/j.trecan.2022.06.0082.     Tawbi, Hussein A et al. “Relatlimab and Nivolumab versus Nivolumab in Untreated Advanced Melanoma.” The New England journal of medicine vol. 386,1 (2022): 24-34. doi:10.1056/NEJMoa21099703.     Jung, Keunok et al. “A Neuropilin-1 Antagonist Exerts Antitumor Immunity by Inhibiting the Suppressive Function of Intratumoral Regulatory T Cells.” Cancer immunology research vol. 8,1 (2020): 46-56. doi:10.1158/2326-6066.CIR-19-01434.   Lim, Seon Ah et al. “Lipid signalling enforces functional specialization of Treg cells in tumours.” Nature vol. 591,7849 (2021): 306-311. doi:10.1038/s41586-021-03235-6

2022年3月8日，国家药品监督管理局（NMPA）正式批准依马利尤单抗（Emapalumab）注射液（商品名：伽蜜芬）在国内上市，适用于难治性、复发性或进展性、或对常规疗法不耐受的原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）成人和儿童（新生儿及以上）患者，开启了HLH靶向治疗的新篇章。01噬血细胞综合征噬血细胞综合征（HPS）又称噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH），是一种遗传性或获得性免疫调节功能异常导致的严重炎症反应综合征，由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞异常激活、增殖和分泌大量炎性细胞因子引起，以发热、血细胞减少、肝脾肿大及肝、脾、淋巴结和骨髓组织发现噬血现象为主要临床特征[1]。目前广泛应用的标准诱导治疗方案是HLH-1994或HLH-2004方案，主流还是力推HLH-94方案。HLH-94方案有三个关键药物，地塞米松、VP-16、环孢菌素A，联合使用丙种球蛋白可能有一定的加强效果。遗憾的是，现有的诱导缓解治疗方案并不能充分满足原发性HLH患者的治疗需求，当前HLH治疗仍面临困局，那么破局之道在何方？随着对HLH发病机制的进一步挖掘，全新的HLH治疗靶点——IFN-γ浮出了水面。02IFN-γ及其诱导的HLH发病机制干扰素(IFNs)是具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节特性的多效细胞因子，是免疫反应的中心协调因子。IFN-γ最初是基于其体外抗病毒活性被鉴定出来的。它的受体由两个亚基组成，IFNGR1和IFNGR2。IFNGR1的主要功能是与配体结合，，而IFNGR2通过Janus激酶（JAKs）以及信号转导子和转录激活子（STATs）在信号转导中起主要作用，但在这一过程中，两个受体亚基都是必需的。有趣的是，只有IFNGR1有STAT1的核定位信号。图1: IFNGR的结构和IFN-γ诱导的信号通路[2]IFN-γ在调节先天和适应性免疫反应中发挥着重要作用。在炎症环境中，IFN-γ触发免疫反应的激活，并刺激病原体的消除；它还可以防止免疫系统的过度激活和组织损伤。在肿瘤微环境(TME)中，IFN-γ通过调节T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞（APCs）、肿瘤细胞、血管和淋巴系统来维持促肿瘤和抗肿瘤免疫的平衡[2]。图2: 肿瘤微环境中的IFN-γ应答者HLH的发病机制尚未被完全阐明，但学界目前认为，细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞（NK）的功能受损，是原发性HLH的主要病因。在正常情况下，细胞毒性T细胞和NK细胞通过免疫接触方式，向被病毒感染的靶细胞或癌细胞释放细胞毒性颗粒，颗粒中包含的穿孔素在靶细胞表面造成孔隙，使细胞毒性颗粒内容物（颗粒酶和其他蛋白酶）进入靶细胞内，诱导靶细胞的凋亡。但在HLH患者体内，由于基因突变、免疫缺陷、感染、恶性肿瘤或风湿性疾病等触发因素的影响，细胞毒性颗粒释放受阻，导致细胞毒作用功能受损，出现抗原清除障碍，T细胞与靶细胞结合后，会持续产生IFN-γ等大量促炎性细胞因子，从而持续刺激巨噬细胞和组织细胞过度活化，进一步释放更多的炎性细胞因子，诱发持续性、失控的高炎症反应，即为细胞因子风暴，导致急性全身性炎症反应甚至继发性器官功能障碍（如肝、肾、肺功能障碍），进而引起多器官功能衰竭，最终导致患者死亡[3-4]。图3：HLH发病机制示意图[3]（A：正常的免疫清除功能；B：HLH发病时异常的免疫清除功能）而在HLH的发生发展，尤其是细胞因子风暴的发生过程中，IFN-γ起到了关键作用。有研究显示，HLH患者体内的IFN-γ水平明显升高，且IFN-γ的过度生成与HLH的血液学特征表现有关。针对IFN-γ这个“风暴眼”信号通路，百奥动物自主开发了4个IFN-γ及其受体基因人源化的小鼠模型，包括：B-hIFNGR1 mice、B-hIFNGR2 mice、B-hIFNGR1/hIFNG mice、B-hIFNGR1/hIFNG/hIFNGR2 mice，助力HLH领域创新药物的临床前研究。03B-hIFNGR1 mice验证数据mRNA和蛋白表达分析通过RT-PCR和流式细胞术分析B-hIFNGR1小鼠中IFNGR1的表达。(A)mRNA的表达检测。人IFNGR1的mRNA仅在纯合B-hIFNGR1小鼠的脾细胞中检测到。(B)从野生型小鼠和B-hIFNGR1小鼠中收集腹腔冲洗液来源的巨噬细胞，用种属特异性抗IFNGR1抗体进行流式细胞术分析。人IFNGR1在B-hIFNGR1小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中检测不到。04B-hIFNGR2 mice验证数据mRNA和蛋白表达分析利用RT-PCR和western blot的方法分析野生鼠和纯合B-hIFNGR2小鼠中IFNGR2的mRNA和蛋白的表达。(A) mRNA的表达检测。小鼠Ifngr2 的mRNA仅在野生鼠(+/+)的小肠中检测到。人IFNGR2的mRNA仅在纯合B-hIFNGR2小鼠(H/H)中检测到。(B)蛋白的表达检测。收集野生鼠和纯合B-hIFNGR2小鼠的骨骼肌，用同时结合人和小鼠IFNGR2的抗体进行western blotting分析。结果表明，在纯合B-hIFNGR2小鼠中可以检测到IFNGR2蛋白的表达。05B-hIFNGR1/hIFNG mice验证数据蛋白表达分析B-hIFNGR1/IFNG小鼠IFNG和IFNGR1的表达分析。(A) IFNG表达分析。用抗CD3ε抗体刺激野生型小鼠(+/+)和纯合B-hIFNGR1/hIFNG小鼠(H/H,H/H) 2 h后采集血清，使用ELISA检测IFNG的表达。小鼠IFNG仅在野生鼠中检测到，人IFNG仅在纯合B-hIFNGR1/hIFNG小鼠中检测到。(B) IFNGR1表达分析。采集野生型小鼠和纯合B-hIFNGR1/hIFNG小鼠腹腔冲洗液来源的巨噬细胞，用抗IFNGR1抗体进行流式细胞术分析。人IFNGR1在B-hIFNGR1/hIFNG小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中检测不到。06IFN-γ信号通路相关人源化小鼠模型参考资料：[1] 中国医师协会血液科医师分会, 中华医学会儿科学分会血液学组, 噬血细胞综合征中国专家联盟. 中国噬血细胞综合征诊断与治疗指南（2022年版）[J]. 中华医学杂志, 2022, 102(20): 1492-1499.[2] Gocher AM, Workman CJ, Vignali DAA. Interferon-gamma: teammate or opponent in the tumour microenvironment? Nat Rev Immunol 2022; 22(3):158-172.[3] 张垚, 汤勇民. 儿童噬血综合征的研究进展[J]. 中国小儿血液与肿瘤杂志. 2020; 02: 112-117.[4] Fajgenbaum DC, June CH. Cytokine storm[J]. N Engl J Med. 2020 Dec 3;383(23):2255-2273.

“瘙痒是一种能引起强烈搔抓渴望的不快的感觉。“关于瘙痒的定义是300多年前由德国医生塞缪尔·哈芬莱弗(Samuel Hafenreffer)第一次提出的，一直沿用至今。许多炎症性疾病，如特应性皮炎、过敏性鼻炎、支气管哮喘等常常伴随强烈瘙痒。N细胞因子细胞因子是免疫反应中的重要因子；近几年的单细胞测序分析表明，痒觉响应的初级感觉神经元中也有许多亚群表达各类细胞因子受体。近20年来神经免疫领域的研究也证实，细胞因子及其受体是触发慢性痒的重要因素之一。神经元瘙痒受体的激活和下游信号传导[1]白介素-31(interleukin-31,IL-31)与特应性皮炎和瘙痒有关，主要由TH2型T细胞产生。IL-31受体由IL-31RA和OSMRb组成，表达于周围感觉神经、皮肤角质细胞和免疫细胞。相应的，IL-31R与IL-31相互作用，会导致瘙痒、皮肤屏障受损和炎症，以及其他炎性因子的分泌。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)，是一种与IL-7互为远距离旁系同源的，归属于短链四α螺旋束Ⅰ型IL-2家族的多效性细胞因子。研究表明 TSLP可以通过 TRPA1 阳性神经元上的 TSLP 受体直接促进瘙痒，反过来，抓挠会诱导表皮角质细胞进一步表达 TSLP，持续性搔抓行为则会加重痒的感觉，形成“越抓越痒、越痒越抓”的恶性循环（the vicious itch-scratch cycle）。白细胞介素4 (interleukin-4, IL4)主要由T细胞、自然杀伤T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞产生。受体在多种痒觉相关伤害感受神经元中均有表达，且与氯喹、组胺、TSLP反应性神经元重合。当IL4受体被激活，JAK(Janus kinase)信号通路与TRPV1和TRPA1共同作用，引起神经元内钙离子浓度升高，诱发瘙痒行为。为了更好的研究和开发瘙痒相关疾病疗法，百奥动物开发了一系列瘙痒相关靶点人源化小鼠，助力相关药物的临床前药效评估。B-hIL31/hIL31RA/hOSMR micehIL31诱导B-hIL31/hIL31RA/hOSMR小鼠瘙痒及IL-31抗体药效在第0、3、7、10天分别给与纯合B-hIL31/hIL31RA/hOSMR小鼠(雌性，n=3)注射hIL-31，并记录hIL-31注射后3h小鼠的抓痕计数。以注射hIL-31前记录抓痕计数作为基线。如图所示，hIL-31在纯合B-hIL31/hIL31RA/hOSMR小鼠中成功诱导瘙痒。一种靶向IL-31信号的抗体作为阳性对照，在我们的模型中显示出显著的止痒效果(经客户验证)。B-hTSLP/hTSLPR miceOxazolone诱导特应性皮炎样皮损抗人TSLP抗体对Oxazolone诱导特应性皮炎小鼠模型的药效各组小鼠均采用抗hTSLP抗体tezepelumab(内部合成)治疗。(A)各组耳表皮厚度统计分析。第18天开始，耳表皮开始脱皮。因此，从第18天开始，耳表皮厚度逐渐减少，如图所示。(B)治疗期间体重变化。(C)血清总IgE水平。第26天采集血清，ELISA法测定总IgE水平。(n = 8)。B-hTSLP/hTSLPR小鼠特应性皮炎模型耳皮肤H&E染色。(A)H&E染色。(B)耳表皮皮肤厚度。(C)耳表皮皮肤嗜酸性粒细胞浸润评分。(D)耳表皮皮肤总分。与同型对照组相比，地塞米松或tezepelumab（内部合成）治疗组耳厚和耳皮肤嗜酸性粒细胞浸润评分显著降低，表明B-hTSLP/hTSLPR小鼠为体内评价抗人TSLP抗体提供了强有力的临床前模型。B-hIL4/hIL4RA miceOxazolone诱导特应性皮炎样皮损抗人IL4RA抗体对Oxazolone诱导特应性皮炎小鼠模型的药效各组小鼠均使用杜匹单抗（内部合成）治疗。剂量在图例中显示。(A)治疗期间体重变化。(B)各组耳表皮厚度统计分析。第18天开始，耳表皮开始脱皮。因此，从第18天开始，耳部厚度逐渐减小，如图所示。(C)血清总IgE水平。第26天采用ELISA法检测总IgE水平。耳厚和血清总IgE浓度与抗体剂量呈负相关。(n = 5)。B-hIL4/IL4RA小鼠特应性皮炎模型耳皮肤H&E染色。(A)H&E染色。(B)耳表皮皮肤嗜酸性粒细胞浸润评分(n=5)。给药后耳皮肤嗜酸性粒细胞浸润分数显著降低，表明B-hIL4/hIL4RA小鼠为体内评估抗人IL4RA抗体提供了强有力的临床前模型。瘙痒相关人源化小鼠模型参考文献[1] Dong X, Dong X. Peripheral and Central Mechanisms of Itch. Neuron. 2018 May2;98(3):482-494. doi: 10.1016/j.neuron.2018.03.023. PMID: 29723501; PMCID:PMC6022762.

随着全球人口不断增长与老龄化的加剧，恶性肿瘤已成为威胁人类健康的主要因素，其疾病死亡率一直高居首位。近年来，免疫治疗在抗肿瘤治疗中的作用备受关注，基于免疫治疗的新药开发和标志物探索，成为了当前肿瘤研究的热点，这也对临床前研究中动物模型的建立和使用提出了更高的要求。21世纪以后，人类的生物医学研究主要受限于生物体的复杂性，这使得临床前利用模式动物对抗肿瘤药物的研究评价显得尤为重要。但由于人与小鼠的物种差异和免疫排斥特性，简单的基因改造手段无法在小鼠身上创造出一个和人类免疫系统相似的免疫环境。如小鼠同种异体移植瘤模型、基因工程小鼠、人源性细胞系移植瘤模型、人源性肿瘤组织移植瘤模型等动物模型均缺乏人免疫系统及肿瘤免疫微环境，极大地限制了免疫机制及免疫治疗的转化研究。因此，既可以模拟人肿瘤特征又同时存在“人源化”免疫系统的免疫重建小鼠模型就成为了免疫肿瘤研发中的优质模型。目前应用于临床前的免疫系统人源化小鼠模型主要有三类，一类是将成熟的人外周血单个核细胞（hPBMC）通过腹腔或者尾静脉注入免疫缺陷小鼠体内重建人的免疫系统，即hPBMC型；另一类是将人CD34+造血干细胞（HSC）通过腹腔或者尾静脉注入免疫缺陷小鼠，同样实现了人类免疫系统的重建，即HSC（CD34+）型；还有一类是移植胎儿胸腺和胎肝到经过辐照的重度免疫缺陷小鼠肾包膜下，同时接种人的骨髓造血干细胞进行免疫重建，即BLT模型。本文将重点介绍HSC免疫系统重建的小鼠模型。三种方式免疫重建小鼠[1]HSC具有高度自我更新和多向分化潜能，是各种免疫细胞的共同祖先。HSC的分化依赖于骨髓和胸腺造血微环境，部分分裂增殖以维持数量相对恒定，部分增殖分化成表面标志为CD34+/CD38+的定向干细胞，包括淋巴系祖细胞（CLP）和髓系祖细胞（CMP）。CLP继续分化为T细胞、B细胞和NK细胞。CMP进一步分化为单核-巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、红细胞和血小板。HSC发育为成熟免疫细胞的每一阶段均需多种细胞因子的参与。造血干细胞的发育[2]免疫重建模型构建的第一步是要构建免疫缺陷小鼠模型。我们使用的B-NDG小鼠为百奥赛图自主研发的，缺乏成熟的T、B、NK细胞的重度免疫缺陷小鼠模型，是目前国际公认的免疫缺陷程度高、适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。第二步即是在B-NDG及B-NDG衍生小鼠的基础上移植入人的免疫细胞、造血干细胞等，构建免疫系统重建小鼠，以能够更好的模拟人的免疫系统，进行免疫学研究和免疫药物评价。免疫重建小鼠模型可用于研究肿瘤在肿瘤微环境中的生长情况以及肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。具体可应用于血液疾病、肿瘤免疫、造血和免疫学、人类疾病感染模型，以及免疫抑制剂、双特异性抗体等药物药效评价、ADCC效应功能等的研究。那我们是如何使用B-NDG小鼠建立HSC免疫重建模型，构建后的模型数据又是如何呢？将1.5×105 CD34+ HSC 细胞接种到辐射后的B-NDG免疫缺陷小鼠体内，会使HSC发育成T、B、NK细胞等，从而建立了人的固有免疫系统和淋巴细胞。HSC免疫重建模型相对来说，发生移植物抗宿主病（GvHD）的时间较晚，小鼠的生存期较长。那么拿到HSC（CD34+）型的模式小鼠又能做些什么呢？下面我们来看一组数据，如图所示，在B-NDG小鼠上进行CD34+免疫重建，静脉注射5×105 Raji-Fluc细胞，5天后再给小鼠静脉注射人源PD-1抗体，2天后可见抗体对肿瘤细胞有明显的抑制作用。说明HSC（CD34+）重建的B-NDG小鼠是CDX药效试验的有效模型。此外，我们也可以利用此模型进行双特异性抗体药效评价或者免疫检查点药物和其他药物联用，比如PD-L1抗体与CD47抗体联合用药，这不仅能达到验证人的抗体药效作用，同时由于使用的是人源细胞系或PDX样本，且免疫系统环境高度人源化，实验结果具有更高的可靠性和参考价值。但这种重建方法也存在一些局限性，例如小鼠体内缺乏人的细胞因子，人类干细胞在小鼠体内发育受限等。于是研究人员也尝试通过基因工程敲入人的细胞因子基因来代替小鼠的基因，可以使组织、细胞中人类细胞因子适当表达[3]。huHSC-B-NDG hIL15 miceIL15(interleukin 15)是一种编码白细胞介素家族蛋白的多效细胞因子，在先天性和适应性细胞稳态以及外周免疫功能中发挥重要作用。IL15支持先天淋巴样细胞的发育，通过对IL15转基因小鼠和IL15敲除小鼠的研究表明，IL15在NK细胞、自然杀伤性T细胞（NKT）和记忆性CD8+T细胞的发育中起着至关重要的作用。移植人造血干细胞（HSCs）的小鼠模型表明，人IL15是移植后人NK细胞发育所必需的细胞因子。人NK细胞发育示意图[4]百奥动物开发了B-NDG hIL15小鼠，将人IL15基因的编码序列（CDS）插入小鼠IL15基因的5’UTR后，使小鼠表达人的IL15，但不表达鼠的IL15。该小鼠具有B-NDG小鼠背景，同时表达人IL15，将人HSCs移植到B-NDG hIL15小鼠，不管是成体鼠还是新生鼠，与B-NDG小鼠相比，人NK细胞的重建率都有明显提高。B-NDG hIL15小鼠可以用来研究人NK细胞的发育与功能、评价依赖NK细胞发挥作用特别是具有ADCC功能的抗体药效的有力工具。在B-NDG hIL15小鼠中移植CD34+ HSCs增强人NK细胞的重建（成体鼠）雌性6周龄的B-NDG小鼠（n=17）和B-NDG hIL15小鼠（n=19）分别经1.6Gy照射后，通过尾静脉注射人HSCs (1.5E5)，在不同的时间点取外周血检测各类型人免疫细胞的重建水平。结果显示：与B-NDG小鼠相比，B-NDG hIL15小鼠中重建的人NK细胞比例显著性增高，从重建2周到14周都能比较稳定地维持较高比例。利用人HSCs重建人免疫系统的B-NDG hIL15小鼠肿瘤模型能有效验证抗人CLDN18.2抗体的药效（成体鼠）5周龄的B-NDG hIL15小鼠经1.2 Gy照射后，通过尾静脉注射人HSCs (1.5E5)， 6周后皮下注射人CLDN18.2过表达的人肺癌B-hCLDN18.2 A549细胞（1E7），7天开始腹腔注射抗人CLDN18.2抗体（zolbetuximab，内部合成），每周取外周血检测人NK细胞和T细胞的重建水平，实验终点时取肿瘤组织检测浸润的人NK细胞和T细胞水平。结果显示：在重建人免疫系统的B-NDG hIL15小鼠肺癌模型中，抗人CLDN18.2抗体能有效抑制肿瘤的生长，肿瘤抑制率是36.2%；外周血及肿瘤组织中都能检测到较高水平的人NK细胞；外周血及肿瘤组织中也能检测到人T细胞，但人T细胞的重建较人NK细胞重建较慢，在外周血中的人T细胞水平维持逐渐升高的趋势。若想减少CD34+ HSC细胞数量的使用，可以使用新生鼠进行免疫重建实验。新生鼠免疫重建实验新生鼠与成体鼠HSC免疫重建对比使用新生鼠移植人CD34+ HSCs重建人免疫系统的方法与特点在新生的B-NDG hIL15小鼠中移植人CD34+ HSCs能重建功能性人NK细胞出生后24-48h的B-NDG小鼠（n=10）和B-NDG hIL15小鼠（n=10）分别经1.0、0.9 Gy辐射后，通过颞静脉注射人CD34+ HSCs (3E4)，在不同的时间点取外周血检测各类型人免疫细胞的重建水平。结果显示：与B-NDG小鼠相比，B-NDG hIL15小鼠中重建的人NK细胞比例显著性增高，从重建6周到18周都能比较稳定地维持较高比例。此外，通过将不同种类的肿瘤细胞系移植入免疫重建的小鼠的体内构建的CDX模型，我们可以最大限度地利用小鼠模型模拟人体内免疫系统的响应情况，为研究肿瘤在人体内的生长状态提供了最优模型。百奥动物开发了一系列免疫系统重建的小鼠模型，huHSC-B-NDG hIL15 mice目前保持大量稳定现货供应，欲购从速！百奥赛图自主开发的B-NDG系列小鼠，其成熟的T、B和NK细胞全部缺失，是目前公认的免疫缺陷程度高、非常适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，在此基础上百奥动物开发了一系列二代鼠，详情可访问百奥动物官网了解，如有需要请随时与我们联系！参考文献：[1] De La Rochere P, etc. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends Immunol. 2018 Sep;39(9):748-763.[2] Reya T, etc. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 2001 Nov 1;414(6859):105-11. [3] Rongvaux A, etc. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol. 2014 Apr;32(4):364-72. [4] Fehniger, etc. Interleukin 15: biology and relevance to human disease. Blood 97, 14-32.

肿瘤治疗药物是全球最大和增长最快的药物细分市场，近年来，疫苗开发也已经成为癌症这一重大疾病新治疗选择的一个热门研究方向。相比全球疫苗市场，全球肿瘤疫苗市场规模增长更快，2019年为46亿美元，预计到2024年将达到101亿美元，复合年增长率为17.28%。01肿瘤疫苗简介疫苗是指含有抗原、能够诱导人体产生特异性主动免疫的制剂，它可以保护机体免受感染源、毒素，以及感染源引起的抗原性物质的损伤。肿瘤疫苗作为肿瘤治疗的新方向，已成为当今肿瘤研究的热点话题。肿瘤疫苗（又称癌症疫苗）通常是含有肿瘤特异性抗原（TSA）或肿瘤相关抗原（TAA）的肿瘤细胞或碎片或片段，可分为肿瘤预防性疫苗（如HPV疫苗）和肿瘤治疗性疫苗（如新抗原mRNA疫苗），主要由肿瘤抗原、制剂、免疫佐剂和递送载体4个关键成分组成。进入人体后，癌症疫苗可激活患者自身免疫系统，诱发特异性免疫反应，克服免疫抑制状态，提高对特定肿瘤的抵抗，是一种主动免疫治疗方法。对于已经发生癌症的患者来说，治疗性疫苗或可延长他们的生存期，成为救命稻草。肿瘤疫苗作为一种新兴的治疗手段，究竟“优秀”在何处呢？肿瘤疫苗组成因素[1]首先，治疗性肿瘤疫苗可通过主动免疫方式诱导全身性的特异性抗瘤效应，与手术治疗、放射治疗相比，作用范围更广泛，特别适用于多发病灶性肿瘤、广泛转移性瘤或非实体性肿瘤(如白血病)；其次，肿瘤疫苗可调动机体自身的力量达到抗肿瘤作用，与放射治疗、化学药物治疗相比不良反应小、特异性高。尽管各种治疗性肿瘤疫苗的设计思想各不相同，诱导免疫应答的方式不同，抗瘤效应各有特点，但不论采用何种方法制备，都是围绕如何提高肿瘤抗原的免疫原性以及如何打破肿瘤免疫耐受这一最关键的核心问题展开的。一种理想的肿瘤疫苗不但能够诱导主动性免疫，刺激荷瘤宿主产生有效的免疫应答，同时还应当是安全的和无不良反应的；不仅能特异性地消除扩散的肿瘤细胞，而且更为重要的是，还能提供保护性的预防肿瘤复发的长期免疫记忆功能。02肿瘤疫苗是如何发挥作用的？肿瘤疫苗通过利用肿瘤细胞相关抗原，来唤醒人体针对癌症的免疫系统功能。目标是预防和治疗癌症，或防止癌症的复发。而肿瘤疫苗想在人体中发挥作用，离不开人类MHC（即HLA复合体）的抗原呈递过程。肿瘤疫苗的作用过程为：通过皮下/肌肉注射使抗原进入机体内，被DC细胞摄取。DC细胞通过淋巴管的归巢进入淋巴结，在淋巴结中存在有大量初始T细胞。通过与APC细胞表面的MHC I/II 类分子结合，初始T细胞被激活为CD8或CD4阳性T细胞。激活的T细胞通过血液循环进入肿瘤部位，从而实现对肿瘤细胞的杀伤。T细胞激活与肿瘤细胞杀伤机制[2]03百奥赛图可提供肿瘤疫苗相关临床前安全性及药效评价在进行临床试验之前，疫苗与治疗性药物一样，也需要进行临床前动物安全性评价。临床前动物安全性评价的主要目的是通过相关动物来考察疫苗的安全性，包括对免疫器官和其他毒性靶器官的影响、毒性的可逆性，以及与临床相关的参数，预测其在大规模人群中使用时可能出现的不良反应，降低临床试验受试者和临床使用者承担的风险，并为临床试验方案的制定提供依据。百奥赛图具有完善的临床前药效评价平台，能够从小鼠免疫，肿瘤药效，免疫原性评估提供肿瘤疫苗临床前评价一站式服务，评估抗肿瘤免疫反应。百奥赛图服务能力概览肿瘤药效稳定的肿瘤模型减小对试验设计和疫苗评价的影响，治疗给药与rechallenge实验检测疫苗有效性。 细胞免疫1. 可采用ICS、ELISA、Luminex、MSD等方法检测细胞因子。2. ELISPOT检测T细胞免疫反应Positive Control：加入工作浓度的阳性刺激物；Negative Control：细胞浓度跟实验孔保持一致，不加阳性刺激物；Background：加入不含细胞的培养基，不加阳性刺激物。3. 可用FACS方法检测T/B/NK细胞以及各T细胞亚群比例小鼠肿瘤模型TILS检测与细胞分型生物标记物免疫细胞及小鼠体内标记物4. 此外，我们还能提供体外T细胞杀伤、四聚体检测等服务。体液免疫百奥赛图能够定制化进行肿瘤特异性抗体检测的ELISA方法开发和方法学验证。04百奥赛图上市多款HLA人源化小鼠我们使用HLA人源化小鼠细胞能呈递和识别与人类呈递的表位相似或相同的肽表位。百奥赛图已上市多款HLA人源化小鼠，可助力疫苗领域的研发。下面以B-HLA-A2.1 mice的数据为例：IFN-γ ELISA实验检测B-HLA-A2.1小鼠疫苗诱导的免疫应答。将9-10周龄雌性 B-HLA-A2.1小鼠分为 PBS 组，Group2和Group 3 (n=2)共三组 ，在小鼠双腿内侧肌肉接种 PBS 或疫苗。最后一次免疫三周后处死小鼠。取小鼠脾细胞，用单肽或与靶标无关的多肽作为阴性对照(NC)或anti-mCD3作为阳性对照刺激，然后测定 IFN-γ 的分泌量。各组间体重无显著差异(数据未显示)。(A) 显示用阴性对照、肽疫苗或阳性对照刺激后的免疫小鼠脾细胞。(B) IFN-γ分泌量。结果表明，B-HLA-2.1小鼠为疫苗的体内评价提供了一个强有力的临床前模型。其他相关品系详细信息，可访问百奥动物官网查询或咨询BD。参考资料：[1] Hu Z, Ott PA, Wu CJ. Towards personalized, tumour-specific, therapeutic vaccines for cancer. Nat Rev Immunol. 2018 Mar;18(3):168-182.[2] Hollingsworth RE, Jansen K. Turning the corner on therapeutic cancer vaccines. NPJ Vaccines. 2019 Feb 8;4:7.

免疫系统人源化小鼠是研究人造血和免疫功能的有力工具。在B-NDG小鼠或B-NDG hIL15小鼠中移植人CD34+ HSCs后，可以很好地重建人淋系细胞包括T细胞、B细胞和NK细胞，用于各类淋系细胞的作用机制研究及药效评价。但在这些人源化小鼠模型中，人髓系细胞包括单核/巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞和红细胞等重建不足，主要原因是促进各类髓系细胞重建的细胞因子在人和鼠之间的交叉反应不足。已有的数据表明：人细胞因子IL3、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 和人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF) 在小鼠中的表达可以促进树突状细胞、单核/巨噬细胞的发育与分化；人血小板生成素(THPO)能促进功能性人造血干细胞维持其多向分化潜能并促进其在小鼠骨髓中的长期植入。‍成熟血细胞的寿命是有限的，需要不断更新。造血从骨髓中一小部分多能造血干细胞的增殖和分化开始。造血程序异常会破坏体内平衡，并促使骨髓、血液或外周淋巴器官中中间祖细胞或成熟细胞的积累，从而导致各种恶性肿瘤。图1.造血作用机制[1]IL31981年Ihle等发现ConA刺激小鼠脾细胞的培养上清中含有一种因子，能提高裸鼠脾脏淋巴细胞成熟标志物20-α-羟固醇氢酸阳性率。这个因子被称为白细胞介素3 (IL-3)；因其功能可刺激多功能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化，又称为多重集落刺激因子（multi-CSF）。IL-3可刺激皮肤上皮细胞、CD4-CD8-TCRαβ细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞增殖，并阻止肥大细胞发生程序性细胞死亡等。GM-CSFGM-CSF，又称CSF-2，是一种分泌型细胞因子。GM-CSF有广泛的生理功能，主要参与髓细胞的生成和分化成熟、促进M1型巨噬细胞极化、激活中性粒细胞、参与血管形成、肿瘤进展、炎症发生等。GM-CSF的异常表达会导致过度的炎症、疼痛和组织损伤，并促进其他炎症细胞因子的产生。新冠病毒感染通常会引起淋巴细胞减少和炎症性细胞因子的释放，炎症风暴被认为是患者死亡的重要原因之一，一些医院正在尝试通过IL-6单抗应对新冠病毒引发的炎症风暴。但中科院魏海明教授等人的发现，GM-CSF在新冠病毒感染重症患者中或许更重要。M-CSF巨噬细胞集落刺激因子为M-CSF，又称为集落刺激因子-1(CSF-1)。最初发现于血清、尿或其它体液中，能刺激骨髓造血细胞巨噬细胞集落的形成。M-CSF对破骨细胞的分化与调节，单核细胞的增殖，分化及维持活性有重要作用。THPO促血小板生成素（THPO）能够促进巨核细胞形成和分化，并向外周血释放成熟的血小板，而肿瘤细胞分泌的一种细胞因子白细胞介素-6（IL-6）能够刺激肝脏分泌更多的THPO，因而提高癌症病患血浆血小板浓度。图2.肿瘤细胞利用血小板促进自身的侵袭和迁移[2]百奥动物将重度免疫缺陷小鼠B-NDG mice的IL3、GM-CSF、M-CSF、THPO基因的全长序列分别替换为相应人基因的全长编码序列，并通过二次基因编辑及相互交配的方式获得4种细胞因子人源化的的重度免疫缺陷小鼠，即B-NDG MGMT3 mice。移植人CD34+HSCs后，与B-NDG小鼠相比，B-NDG MGMT3 mice中各类人髓系细胞的重建明显增强，包括单核/巨噬细胞、树突状细胞；人淋系细胞包括CD4+ T细胞、Tregs和NK细胞的重建水平也有增加。B-NDG MGMT3 mice可用于研究造血系统的发育与分化机制、研究肿瘤、自免、感染与代谢等免疫相关疾病的致病机制与药效评价。B-NDG MGMT3 mice蛋白表达分析ELISA法检测野生型B-NDG小鼠和纯合B-NDG MGMT3小鼠中种属特异性GM-CSF、CSF1和THPO的表达。采集LPS刺激小鼠血清，进行ELISA分析(n=3)。小鼠GM-CSF、CSF1和THPO仅在B-NDG小鼠(+/+)中检测到，而在B-NDG MGMT3小鼠(H/H)中检测不到。人GM-CSF、CSF1和THPO仅在B-NDG MGMT3小鼠中检测到。由于IL3主要在活化的T细胞中表达，而B-NDG背景小鼠中没有成熟的T细胞，因此在两种小鼠中均未检测到小鼠或人IL3。利用B-NDG MGMT3 mice移植人CD34+HSCs重建人淋系和髓系细胞将人CD34+HSC(3E4)分别经面部颞静脉植入出生24-72小时的B-NDG小鼠和B-NDG MGMT3小鼠(雌雄均有，n=15)。B-NDG小鼠提前经1.0 gy辐照预处理；B-NDG MGMT3小鼠不做辐照预处理。结果显示：与B-NDG小鼠相比，B-NDG MGMT3小鼠未辐照，移植人HSCs 24周后，其生存率从移植18周开始降低，24周结实验时达到42.85%；但小鼠体重明显较大，重建过程中稳定增长。B-NDG MGMT3小鼠中重建的所有淋系及髓系人免疫细胞数量从重建12周开始显著高于在B-NDG小鼠中的重建水平。B-NDG®miceB-NDG小鼠是百奥赛图自主研发，通过在NOD scid背景上敲除IL2rg基因构建而成的重度免疫缺陷小鼠。该小鼠缺乏成熟的T、B和功能性的NK细胞，并表现出细胞因子信号转导功能缺失，其重度免疫缺陷表型使得该小鼠能够被用来进行包括人免疫细胞在内的异种细胞移植实验。该模型广泛应用于肿瘤学、肿瘤免疫学、传染病和干细胞生物学等领域的研究和药物发现。免疫缺陷系列大小鼠列表参考文献[1] Springuel L, Renauld JC, Knoops L. JAK kinase targeting in hematologic malignancies: a sinuous pathway from identification of genetic alterations towards clinical indications. Haematologica. 2015 Oct;100(10):1240-53. doi: 10.3324/haematol.2015.132142. PMID: 26432382; PMCID: PMC4591756.[2] Monika Haemmerle,Rebecca L. Stone,David G. Menter. The Platelet Lifeline to Cancer: Challenges and Opportunities. Cancer cell. VOLUME 33, ISSUE 6, P965-983, JUNE 11, 201

趋化因子(chemokines)是一类由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白，具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力，通过与G蛋白偶联跨膜受体(称为趋化因子受体，选择性地表达在靶细胞表面)相互作用来发挥其生物学效应。根据结构（氨基端（N端）半胱氨酸的排列方式），趋化因子被分为四个主要亚家族：CXC（CXCL1-17）、CC（CCL1-28）、XC（XCL1、XCL2）和CX3C（CX3CL1）四个亚族。 CC趋化因子亚族又称β趋化因子亚家族，其氨基末端有2个相近的半胱氨基结构。CC趋化因子亚族包含27种类型，依次为CCL1-CCL28（其中CCL10与CCL9相同），是一类可引起免疫细胞定向迁移至炎症部位的小分子分泌性蛋白。常见的有嗜酸性粒细胞趋化因子、单核细胞趋化蛋白及其他细胞亚群的趋化因子等。其受体有10个，分别为CCR1-CCR10。CC型趋化因子可趋化淋巴细胞、单核细胞、酸性粒细胞等细胞的游走趋化，在炎症反应、清除抗原、细菌感染等方面起着重要作用。CC趋化因子亚族列表CC趋化因子具有促癌和抗癌双重特性，主要对中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、树突细胞、NK细胞、T和B淋巴细胞等具有强大的趋化活性。比较重要的有：单核细胞趋化蛋白(MCP-1/CCL2)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP/CCL3)、RANTES/CCL5等。01CCL2在肿瘤侵袭转移中的作用  CCL2在肿瘤微环境中由肿瘤细胞和基质细胞表达，在肿瘤原发部位诱导肿瘤细胞增殖，刺激肿瘤细胞向周围细胞外基质迁移和侵袭，随后CCL2促进肿瘤细胞内渗进入循环，可能是通过招募宿主骨髓细胞来促进这一过程。一旦进入血液循环，CCL2可能会引导癌细胞沿着趋化梯度向转移部位扩散。肿瘤细胞被困在小毛细血管中会引发肿瘤细胞外渗，这种外渗进一步受到CCR2+髓系细胞和CCR2+内皮细胞的支持。最后，CCL2通过募集更多的骨髓细胞和内皮细胞促进转移部位的肿瘤生长和肿瘤定植。[1]02CCL3在白血病骨髓微环境中的作用  在白血病BM微环境(蓝色阴影区域)中，CCL3可诱导支持白血病细胞优势增殖的多个过程:(1)正常龛细胞向白血病适应细胞的转化;(2)选择性抑制正常HSPCs;(3)从BM中动员正常HSPCs。缩写:BM，骨髓;HSPC，造血干/祖细胞。[2]03CCL20在癌症中的作用  CCL20-CCR6信号通路通过增强癌细胞的迁移和增殖直接促进癌症进展，通过免疫细胞控制重塑肿瘤微环境间接促进癌症进展。[3]靶向趋化因子及其受体治疗人类肿瘤、自身免疫性疾病和慢性炎症愈发受到重视。然而，到目前为止针对趋化因子和趋化因子受体的药物研发才刚刚起步。已获批的抗体药物有CCR4抗体（Mogamulizumab）和CXCL8（IL-8）抗体ABCream。为了推动靶向趋化因子的药物开发，百奥动物自主研发了一系列趋化因子人源化动物&细胞模型。B-hCCL2 mice蛋白表达分析ELISA法检测纯合B-hCCL2小鼠种属特异性CCL2表达分析。收集野生型小鼠和纯合B-hCCL2小鼠体内抗mCD3ε抗体刺激4h的血清，用种属特异性CCL2 ELISA试剂盒进行ELISA分析。小鼠CCL2仅在野生型小鼠中可检测到。人CCL2仅在纯合B-hCCL2小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中未检测到。B-hCCL3 mice蛋白表达分析ELISA法检测纯合B-hCCL3小鼠种属特异性CCL3表达分析。从野生型小鼠和纯合B-hCCL3小鼠中分离骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，体外用10 ng/mL LPS刺激，用种属特异性CCL3 ELISA试剂盒ELISA分析细胞培养上清液。在野生型小鼠中可检测到小鼠CCL3。人CCL3仅在纯合B-hCCL3小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中未检测到。B-hCCL20 mice蛋白表达分析ELISA法检测纯合B-hCCL20小鼠中种属特异性CCL20表达分析。收集野生型小鼠和纯合B-hCCL20小鼠胸腺研磨上清，用种属特异性CCL20 ELISA试剂盒进行ELISA分析。在野生型小鼠中可检测到小鼠CCL20。人CCL20仅在纯合B-hCCL20小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中未检测到。B-hCCL22 mice蛋白表达分析ELISA法对野生型小鼠和B-hCCL22小鼠中CCL22表达进行种属特异性分析。收集野生型小鼠和纯合B-hCCL22小鼠胸腺匀浆，用种属特异性CCL22 ELISA试剂盒进行ELISA分析。在野生型小鼠中可检测到小鼠CCL22。人CCL22 仅在纯合B-hCCL22小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中未检测到。数值表示为平均值±SEM。ND：未检出。B-hCCR8/hCCL1 mice肿瘤微环境中CCL1的检测ELISA法检测C57BL/6和B-hCCR8/hCCL1荷瘤MC38细胞小鼠肿瘤微环境中CCL1。将小鼠结肠癌MC38细胞皮下植入C57BL/6和B-hCCR8/hCCL1小鼠（n=2或3）。当肿瘤体积约为600mm3时取肿瘤组织，并通过ELISA进行分析。在纯合B-hCCR8/hCCL1小鼠中可检测到人CCL1，含量约为150 pg/mg总蛋白。不同小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的比较不同小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞分析。B-hCCR8/hCCL1小鼠Treg细胞百分比（Th细胞%）与C57BL/6小鼠和B-hCCR8小鼠相比无显著差异。B-hCCL2 MC38蛋白表达分析ELISA法对B-hCCL2 MC38细胞中CCL2的表达进行分析。在B-hCCL2 MC38细胞的上清液中检测到人CCL2，但在野生型MC38细胞中未检测到。在野生型MC38细胞上清液中未检测到小鼠Ccl2。使用B-hCCL2 MC38细胞的2-D07克隆进行体内实验。肿瘤生长曲线和体重变化B-hCCL2 MC38细胞皮下同种移植瘤生长。将B-hCCL2 MC38细胞(5x105)和野生型MC38细胞(5x105)皮下植入C57BL/6N小鼠(雌性，7周龄，n=5)。每周测量两次肿瘤体积和体重。(A)平均肿瘤体积±SEM。(B)体重(平均值±SEM)。体积用mm3表示，公式为:V=0.5×长直径×短直径2。如A图所示，B-hCCL2 MC38细胞能够在体内建立肿瘤，并可用于疗效研究。B-Tg(hCCL1) MC38肿瘤浸润淋巴细胞分析与MC38细胞相比，荷瘤B-Tg(hCCL1)MC38细胞中CD3+ T细胞、CD4+ T细胞和Treg细胞占CD45+细胞的百分比显著增加。数据表示为平均值±SEM，采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验，与其他列进行比较(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)肿瘤生长曲线和体重变化B-Tg(hCCL1) MC38细胞皮下同种移植物肿瘤生长。B-Tg(hCCL1) MC38细胞(5x105)和野生型MC38细胞(5x105)皮下植入B-hCCR8小鼠(雌性，8周龄，n=7)。每周测量两次肿瘤体积和体重。(A)平均肿瘤体积±SEM。(B)体重(平均值±SEM)。体积用mm3表示，公式V=0.5×长径×短径2。如A图所示，B-Tg(hCCL1) MC38细胞能够在体内建立肿瘤，并可用于疗效研究。B-Tg(mCcl2) MC38肿瘤生长曲线和体重变化B-Tg(mCcl2) MC38细胞皮下同种移植肿瘤生长。将B-Tg(mCcl2) MC38细胞(5x105)和野生型MC38细胞(5x105)皮下植入C57BL/6小鼠(雌性，6周龄，n=5)。每周测量两次肿瘤体积和体重。(A)平均肿瘤体积±SEM。(B)体重(平均值±SEM)。体积用mm3表示，公式为:V=0.5×长直径×短直径2。如A图所示，B-Tg(mCcl2) MC38细胞能够在体内形成肿瘤，可用于疗效研究。肿瘤中mCcl2的表达分析实验结束时采集肿瘤细胞，ELISA检测小鼠Ccl2表达。如图所示，小鼠Ccl2在肿瘤匀浆中高表达。数据表示为平均值±SEM，采用T检验进行分析并与G1进行比较。(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)参考资料1、Lim, Su et al. Oncotarget. 7 (2016).2、Baba T ,  Mukaida N . Role of macrophage inflammatory protein (MIP)-1α/CCL3 in leukemogenesis[J]. Molecular & Cellular Oncology, 2014, 1(1):-.3、Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5186