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宏基因组(Metagenomics)又称为元基因组,由Handelsman等人在1998年首次提出这一概念,指特定生境中全部微小生物遗传物质的总和,包含了可培养的和不可培养的微生物基因。目前主要以生境中全部细菌和真菌基因组DNA为研究对象,研究其功能和彼此之间的关系和相互作用,从而揭示其内在机制。 随着分子生物学技术在微生物生态学研究中的广泛应用,促进了以强调微生物群落基因组为整体研究对象,研究特定生境中微生物群落结构、功能代谢、进化关系以及对环境因子的响应为主的微生物环境基因组学或称为宏基因组学技术。 以高通量测序为基础的宏基因组研究方法则可以直接对环境样品中分离的遗传物质进行深度测序,已经被证实在探索微生物生态生理特性、复杂环境微生物群落的代谢方式以及从核苷酸构建的文库中鉴定新型生物分子等方面有着不可替代的作用。

1. 测序方案千年基因拥有最成熟的大片段文库构建流程及测序方案,在HiSeq 2000/2500及454平台均能成功构建2Kb-40Kb等不同长度插入片段的大片段文库。文库:2Kb、3Kb、5Kb、8Kb、10Kb、20Kb、40Kb等不同长度插入片段的大片段文库测序平台:HiSeq 2000/2500及454平台 2. 信息分析2.1 基本信息分析采用CASAVA v1.8.2 和FastQC 软件,按illumina 标准流程进行base calling 及数据产出统计;按照标准过滤原则对将raw data 过滤成clean data;raw data 及clean data 的数据量及Q20、Q30统计;raw data 及clean data 测序质量分布图,GC/AT含量分布图。2.2 标准信息分析文库大小评估:绘制mate pair文库insert size分布图(需提供参考基因组信息或近缘物种基因组序列信息作为参考);mate pair文库PCR duplication rate统计。

1 捕获平台              人外显子组测序是以高效捕获为前提,主要针对人类基因组编码区域进行的选择性测序。目前,Macrogen主要采用以下三种外显子组捕获平台。a. Illumina TruSeq Exome Enrichment Kitb. NimbleGen SeqCap EZ c. Agilent SureSelect Human All Exon Kit2 实验方案捕获平台:推荐Agilent SureSelect Human All Exon V4,特点如下:a. 样本量要求为1.2ug;b. 捕获范围为51Mb,包括20,965条基因的334,378个外显子区域;c. 根据CCDS、RefSeq、GENECODE、miRNABase、TCGA及UCSC数据库设计探针,可有效获得外显子区及其周边区域的变异信息。测序平台:HiSeq 2000 100PE文库:shotgun数据量:建议做125×深度测序,得到约7Gb的数据量3 质量控制      30台HiSeq 2000/2500;   Illumina Genome Network亚太区唯一一家成员,同时受 Illumina Genome Network 和 Illumina CSPro 监管,严格使用原厂试剂,是Illumina平台全球最高质量的代表;HiSeq 2000平台平均大于99%碱基准确度达Q20,保证大于85%碱基准确度达Q30,平均clean data占raw data90%以上。 4 数据分析a. 基本信息分析    按标准流程进行base calling、raw data数据整理及数据质量评估。b. 标准信息分析    数据通过BWA与UCSC hg19数据库进行比对,通过SAMTOOLS检测SNP和InDel变异信息;    将SNP和InDel与最新发布的dbSNP 和千人基因组数据进行比对分析,寻找稀有变异;    变异所在基因的功能注释(GO、Pathway);    变异基因保守性预测及致病性分析(SIFT、Polyphen-2、GERP);    根据家系及疾病模式进行多样本分析。 c. 高级信息分析    根据客户的具体研究近写的个性化分析。 

   Small RNA(micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs等)是指总RNA中长度在18-30nt的RNA分子,是一类高度保守的小RNA分子,其作为生命活动中重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina能够对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究。通过Illumina对Small RNA大规模测序分析,可一次性获得物种全基因组范围内的全部small RNA信息,从而能够绘制全基因组水平的miRNA图谱,实现包括新miRNA分子的挖掘,其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类和表达谱分析等科学应用。

长链非编码 RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度大于200 nt且不编码蛋白质的RNAs(不含rRNA),以带polyA 尾和不带polyA 尾两种形式广泛存在于各种生物体内,具有跨物种的低保守性、组织特异性表达和丰度低等特点。lncRNA的种类远远超过cRNA,保守估计哺乳动物基因组序列中4%-9%的序列产生lncRNA 转录本,而相应的cRNA 的比例仅是1%-5%。起初lncRNA 被认为是基因组转录的“噪音”,不具有生物学功能。但是近年来的研究表明,lncRNA参与了多种重要的调控过程,如X 染色体沉默,基因组印记以及染色质修饰等。目前,lncRNA 已成为继小RNA(microRNA、piRNA、siRNA等)之后功能基因组学领域的热门研究,但绝大部分lncRNA的功能目前仍不清楚。应用高通量测序,研究人员能够快速获得与疾病或者特定生物学过程相关的lncRNA 并进行深入研究。

         Long-Read测序技术最早由Moleculo公司开发,2012年底Illumina收购Moleculo后对该技术进行优化,兼具长读长与高通量的优势,应用HiSeq平台测序即可实现长达10Kb的读长。与Mate Pair文库只能获得reads两端的序列相比,Illumina Long-Read测序通过打断、扩增、添加特定的Index、测序、信息分析等过程,可获得长reads的全部序列信息。应用领域动植物基因组de novo测序及组装;宏基因组测序及组装;开展人类全基因组分相,以鉴定共同遗传的等位基因、单体型信息。

     全基因组de novo测序是对没有参考基因组序列或者是不依赖于已有的参考基因组序列的物种进行基因组测序及组装,最终得到该物种的基因组序列。一个物种的全基因组序列是揭示该物种生命本质的基本依据和重要线索,对重要功能基因的挖掘、遗传育种及进化研究具有重要意义。随着高通量测序技术的不断发展,越来越多物种的基因组序列已得到解析。 产品优势:1. 长读长能够更好地跨越基因组高重复序列、转座子区域以及大的拷贝数变异区域和结构变异区,从而实现对高杂合及高重复基因组的完美     组装;2. 更长的Contig N50/Scaffold N50/Assembly,Contig N50提高200%;3. 更少的Contigs和Scaffolds数量,Contigs数量减少50%;4. 更全面的基因组结构信息、功能基因信息等。 

一、测序方案测序平台:HiSeq X Ten文库类型:shotgun文库数据量:建议90Gb以上 二、信息分析1. 基本信息分析数据产出统计,包括reads数目、总数据量、Q20、Q30、GC%、碱基质量分布、序列长度分布等。 2. 标准信息分析(1)与参考基因组进行比对并统计比对效率;(2)样本测序序列随机性评估,分析reads在染色体各部位的分布情况;(3)SNP/InDel检出及注释;(4)变异基因的GO及KEGG注释;(5)CNV检出及注释;(6)SV检出;(7)多样本单碱基变异整合分析(需要多个样本);(8)体细胞变异分析,包含SNP、InDel、CNV、SV(适用于成对的肿瘤样本)。 3. 高级信息分析根据客户的具体研究目的所开展的更深层次的分析。

甲基化是基因表达的主要调控方式之一,研究染色体DNA的甲基化情况是了解基因调控的基础。用标准bisulfite方法处理DNA后,未甲基化的胞嘧啶C会脱氨基形成尿嘧啶U。经过PCR扩增,尿嘧啶U替换为胸腺嘧啶T,而发生甲基化的胞嘧啶C保持不变。通过Bisulfite处理序列与参考序列的比对,可对全基因组甲基化情况进行定量分析。

1 测序策略研究目的:获得更多和更长的转录本信息平台:Roche 454 & 454+文库:shotgun数据量:一般为混合样本,建议测1R 研究目的:不同样本间的基因差异表达平台:Illumina HiSeq 2000 100PE 或 Roche 454 & 454+文库:shotgun数据量:一般为单一组织样本,HiSeq 2000平台至少5G数据,454 & 454+平台建议先测1/2R 2 质量控制        4台Roche 454 & 454+,30台HiSeq 2000/2500;  严格使用Roche 454原厂试剂,保证90%碱基准确度达Q40; Macrogen与Roche保持密切的信息分析合作研究,已共同发表多篇国际高影响力的文章;Illumina Genome Network亚太区唯一一家成员,同时受 Illumina Genome Network 和 Illumina CSPro 监管,严格使用原厂试剂,是Illumina平台全球最高质量的代表;HiSeq 2000平台平均大于99%碱基准确度达Q20,保证大于85%碱基准确度达Q30,平均clean data占raw data90%以上。