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爱思益普建立了完善的靶点验证和方法学构建开发平台，助力基于新靶点的研究和化合物筛选。 对于全新靶点，爱思益普建立了从头合成的蛋白表达能力，结合SPR（Biacore 8K等）平台，提供完整的新靶点验证筛选能力。研究内容1. 蛋白纯化• 蛋白表达系统(E.coli, Sf9昆虫细胞,哺乳动物细胞)• 蛋白标签(His, GST, FLAG, Avi, MBP, Fc-fusion)• 蛋白鉴定(SDS Page, Brandford test, LC-MS analysis, Activity test) 2.酶学研究• 结合试验(HTRF, Alpha )， ADP 定量 (ADP-Glo, etc.)• 磷酸化底物检测 (Ulight, HTRF, Lantha, Alpha)• 细胞磷酸化蛋白检测(AlphaScreen, HCS, WB)• 激酶, 表观遗传酶学, E3. DUBs, 磷酸酶, 蛋白酶, 解旋酶, 核酸酶3.细胞系工程• 建立了超过1000 株细胞株• 报告基因，突变, 标签和无标签表达• 过表达稳转细胞株 (Flip-In, lentiviral and Retroviral system, Neon electroporation, T-REx system, HiBiT and PPI systems etc.)• 敲出 (KO) 和敲入 (KI) ：CRISPR/Cas 9 system, siRNA, shRNA4.离子通道• 基于荧光功能筛选 (FLIPR)• 电生理实验(手动膜片钳和自动膜片钳QpatchII)• Panel screening (100+ targets validated)5.GPCR• GPCR 稳转细胞系构建• cAMP(HTRF; agonist/antagonist, CRE-BLA/Fluc)• 钙流(Flipr; IP-one, NFAT-Luc)• β-arrestin((PPI/NanoBRET)• Panel screening (100+ targets validated)6.核受体• 荧光偏振结合试验 (lantha)• 基于TaqMan的基因表达• 报告基因筛选(transient transfection, stable cell line)• Panel screening (30+ nuclear receptors)7.免疫-肿瘤靶点研究• 检查点阻断生化结合试验和细胞报告基因试验• 共培养报告基因试验• 全血, PBMC, T cell, Tregs, DC, B and NK cellular assays• 体外实验 MLR, co-culture, etc• 细胞因子释放试验FACS, ELISA8.Panel screening• Safety panel (47个/90个靶点)• 激酶谱 >400 assays validated (provide 207 and 310 panel screening)• 其他panels: TK family (76x), CDK family (16x) and Mini kinase (60x)• 定制激酶谱• 体外脱靶效应筛选(基于不同疾病靶点)• GLP hERG/心脏安全研究• Cell panel screening
我司利用损伤的DNA会激活PARPs酶通过NAD+使核蛋白进行聚腺苷二磷酸核糖基化，从而使组蛋白与DNA分离，通过对底物的生物素标记，检测PARPs的活性，来建立检测体系。研究内容聚ADP核糖聚合酶(PARPs)家族ADP核糖基化（ADPr）是蛋白质的一种可逆的、进化保守的转录后修饰过程，参与调节体内多种生物过程，在维持基因的稳定性和细胞凋亡等方面发挥着重要的作用。ADPr主要由ADP-核糖基转移酶（ART）蛋白超家族催化，研究最多的ADP-核糖基转移酶蛋白家族是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶家族（PARPs）。聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是一个蛋白质家族，它将ADP核糖单元从NAD+转移到目标核蛋白上，形成长支链的聚ADP-糖链。目前已经在哺乳动物体内发现17个PARP家族蛋白，被命名为PARP1-17。 PARP抑制剂是一种靶向聚ADP核糖聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase）的癌症疗法，是一种成功利用合成致死 (Synthetic Lethality) 概念获得批准在临床使用的抗癌药物。为此，对PARP抑制剂的研发已经成为抗癌领域的一个热点我司利用损伤的DNA会激活PARPs酶通过NAD+使核蛋白进行聚腺苷二磷酸核糖基化，从而使组蛋白与DNA分离，通过对底物的生物素标记，检测PARPs的活性，来建立检测体系。以下是部分PARPs系列酶测试的数据展示：组蛋白去乙酰化酶家族（HDACs）组蛋白去乙酰化酶（HDACS）催化组蛋白的去乙酰化，维系组蛋白乙酰化与去乙酰化的平衡状态，与癌相关基因转录表达、细胞增殖分化及细胞凋亡等诸多过程密切相关。我司为客户提供了HDACs系列相关的酶学化合物筛选服务。以下是部分HDACs系列酶测试的数据展示。
表观遗传（Epigenetics）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变可在生物体发育和细胞增殖的过程中稳定遗传给后代。其主要分子机制有：DNA甲基化、非编码RNA调控、组蛋白修饰、染色质重塑等。随着表观遗传学的深入研究，与其相关的疾病得以了解甚至攻克，极大推进了疾病研究和药物研发进程。表观遗传靶点是近十年以来出现的左右希望的一类成药靶点，这些靶点不仅与肿瘤学研究相关，而且对代谢、神经、炎症、心血管疾病研究也存在潜在影响。爱思益普专注新药靶点，助力新药发现。目前，已经构建多个靶点的药物筛选体系。图1.表观遗传相关靶点展示图图2.表观遗传相关靶点数据展示图
γ－氨基丁酸是一种化合物，别名4－氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA），是一种氨基酸，在人体大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中起重要作用。据研究发现，GABA是在人脑能量代谢过程中起重要作用的活性氨基酸 ,是脑组织中最重要的神经递质。起作用能促进乙酰胆碱合成、降血氨、抗惊厥、降血压、促进生长激素分泌等多种生理功能。 ICE团队利用液相色谱质联用法对GABA检测进行方法学验证，检测动物模型体内的神经递质含量。对于神经递质检测，与传统的HPLC-ECD检测相比，UPLC-MS或UPLC-MS/MS具有灵敏度高，特异性强，检测时间短的优势。从而为客户提供更全面更细致有关神经递质相关的服务。北京爱思益普生物科技股份有限公司专注于从靶点发现验证、先导化合物筛选、优化到临床前候选分子阶段的创新药一体化生物学服务平台，覆盖在肿瘤，免疫，心血管，中枢神经系统等疾病领域，整合蛋白科学、酶学、细胞学、体内外药物代谢动力学、药理学等平台，支持创新药物研发项目，支持基础科研与临床转化医学业务。
Cell Panel Screening用于评价测试化合物对不同人类癌症细胞系的治疗效果。爱思益普（ICE）已有500株细胞，如图1所示，准备就绪用于化合物基于Cell Panel的活力筛选。同时，ICE已构建了2个固定的Cell Panel和一个Blood Cell Panel。其中120 株细胞组成的Cell Panel包含有18个癌种；60株细胞组成的Cell Panel包含有16个癌种，Blood Cell Panel由50株细胞组成且含有6种血液瘤类型。目前，ICE已完成了细胞扩库、阳性药（PDD; Staurosparine，STS；AZD1775; Talazoparib等）验证等工作以助力新药研发勇攀高峰。ICE’s mini cell panel screening 如图2所示，其敏感性如图3所示，及ICE’s cell panel screening数据展示如图4所示。图1. ICE tumor types图2. ICE’s mini cell panel screening图3. ICE’s sensitivity of cells
GPCR是一类重要的成药性靶点，超过800个成员，是最大的成药性靶点家族。FDA批准的药物中，超过25%的药物作用于GPCR靶点。 根据下游信号差异，爱思益普建立了基于荧光的多种筛选方法和平台，已经构建和正在优化的GPCR受体超过130个，并正在快速扩大，可以按客户需求定制。研究内容GPCR是一类重要的成药性靶点，超过800个成员，是大的成药性靶点家族。FDA批准的药物中，超过25%的药物作用于GPCR靶点。根据下游信号差异，爱思益普建立了基于荧光的多种筛选方法和平台，已经构建和正在优化的GPCR受体超过130个，并正在快速扩大，可以按客户需求定制。图1，爱思益普GPCR靶点药物开发能力布局 GPCR Receptor stable cell lines at ICEA1GCGR5-HT1AGPR52A2AGLP-15-HT1BGPR81A2BmGLP-15-HT1DGPR84A3rGLP-15-HT1EGPR55Alpha 1AGLP-25-HT1FGPR75Alpha 1BGIP5-HT2AGPR183Alpha 1DH15-HT2BAT1Alpha 2AH25-HT2CAT2Alpha 2BH35-HT4ANPY1RAlpha 2CH45-HT4BBDKRB2Beta 1M15-HT7AC5AR1Beta 2M25-HT7BNPFFR1 Beta 3M35-HT7DNPFFR2CB1M4SSTR1PTAFRCB2M5SSTR2GABAB(1a)CCR1deltaSSTR3mGlu5CCR2kappaSSTR4CysLT1CCR3muSSTR5MC1CCR4muAVPR1A MC4CCR5muAVPR1BNK1CCR6NOPAVPR2MT1CCR7NOPS1P1MT2CCR8NOPS1P2TAAR1CCR9ADP1S1P3SMOCCR9BDP2S1P4NK1CXCR1EP1S1P5NK2CXCR2EP2LPA1NK3CXCR3EP3LPA2CASRCXCR4EP4LPA3OX1CXCR5FPLPA4OX2CX3CR1TPLPA5GnRHD1IPFPR1CCK1D2LP2Y12FPR2CCK2D2SD4ETAETBD3D5图2 爱思益普已经构建的GPCR靶点图3 GPCR抗体筛选平台
人类参与生物学功能的蛋白大约有30,000多种，然而可成药的靶点只占据其中很少的一部分。探索不可成药靶点作为药物研发领域一个非常有挑战性但值得尝试的课题，因此备受关注。新兴技术例如靶向蛋白降解技术，将为该领域的发展提供极大助力。蛋白靶向降解技术借助蛋白酶体和溶酶体这两大天然存在于人体内的细胞器对致病蛋白进行精准降解，目前主流的蛋白降解通路大致分为三类：基于泛素-蛋白酶体系统、基于内体-溶酶体通路和基于自噬-溶酶体通路。蛋白降解通过细胞自身的蛋白酶系统来降解靶点蛋白(POI)，从而调控蛋白水平，而非像传统药物那样通过抑制靶点蛋白的功能来发挥其药物作用。为加速蛋白降解分子发现的过程，ICE团队针对PROTAC的特性和发挥作用的环节，积极布局对应的研发能力，专注于难成药靶点的药物研发，如：蛋白水平开展蛋白表达和纯化、生物物理学评价，蛋白亲和力、三元复合物的形成等；细胞水平可优化蛋白的降解与表达水平的检测，比如传统WB、数字化WB、通量化ICW和IFA、HiBiT敲入稳转细胞系的构建等技术，也可以利用商品化试剂盒如AlphaLISA，ELISA, HTRF等方法检测总蛋白的表达水平；同时结合细胞信号转导通路的检测、细胞活力与增殖等层次，多方位确定PROTAC分子在细胞中的活性；机制研究上可以通过ADME的方法、蛋白组学、结构生物学等手段，评价PROTAC分子在细胞内发挥作用的机制，也可以通过抑制剂的手段研究蛋白降解通路的特异性等等，形成了完整的蛋白靶向降解剂筛选平台。以BTK的PROTAC为例，简要地描述ICE在PROTAC分子早期研发布局的常用分析方法。细胞水平的降解，在优化方法的早期，会利用传统Western Blot实验看趋势，再结合数字化Western Blot（主要使用ProteinSimple的JESS设备）确定降解情况，用于后续筛选。传统电泳Western Blot实验（ICE数据）相比传统电泳Western Blot实验而言，JESS则显得更为便捷，制备样本流程简单，目前ICE团队已用JESS顺利完成多项蛋白降解相关实验。数字化Western Blot-JESS实验（ICE数据）对于大量的PROTAC分子细胞活性筛选，也有适合于微孔板的方式，如可开发方法的In-cell western（ICW）和Immunofluorescence assay（IFA），ELISA、Alphalisa等技术。ICW assay（ICE数据）IFA assay（ICE数据）对于通量的筛选，也可使用HiBiT内源敲入的细胞系，快速筛选可降解BTK蛋白的PROTAC分子，同时还可以看到降解的一些动力学过程，也可一并看到PROTAC分子对细胞增殖过程的影响。HiBiT内源敲入的细胞系（ICE数据）PROTAC具有分子量较大、氢键较多、溶解性较差、透膜性较差、稳定性较差等特性，需要尽早收集ADME相关数据，比如PROTAC分子在溶液中的溶解度、LogD，LogP，在血浆、肠液、胃液、原代肝细胞、筛选细胞实验培养基中的稳定性等等，透膜性也是另一个重要的参数，比如测试Caco-2，MDCKII, MDCKII-MDR1等细胞系中的Papp，做细胞实验所需细胞系中的透膜能力等等；还有代谢稳定性，在肝微粒体和原代肝细胞中的稳定性等等。结合体外的筛选平台，也可以通过靶点结合和生物标记物分子的检测，快速评价PROTAC透过肿瘤细胞的能力及与靶点的结合能力。对于脱靶效应的检测，也是非常重要，这个也受限于PROTAC的基本原理，当分子与非靶点蛋白有较弱或中等的亲和力时，也有可能带来脱靶降解，常会用到蛋白组学的方法来分析。液质联用（LC-MS/MS）可以快速结合细胞学化合物处理的条件，简单便捷分析一些参数，比如细胞对化合物的摄取量、非特异结合的量、生物转化的量、化合物溶解性及稳定性等等，这些分析简单的构成了细胞生物利用度，可以从一定程度上解释化合物在酶学和细胞学实验体系中活性的相对差异。爱思益普目前已经可以提供此类试验分析，可及时便捷地为大家提供troubleshooting的试验数据。目前新的蛋白降解方式不断出现，如分子胶，LYTACs，AUTACs，ATTECs，RIBOTACs，等等。对于膜蛋白而言，ICE有着丰富的稳转细胞系储备，如离子通道、GPCR受体等，希望在膜蛋白的降解领域能给大家更多的支持，为中国蛋白降解领域的药物研发做一些事。
目前发现48个成员，与代谢性疾病关系密切；建立了以荧光素酶报告基因为主的核受体筛选平台 研究内容目前发现48个成员，与代谢性疾病关系密切；建立了以荧光素酶报告基因为主的核受体筛选平台 已建立的核受体列表Nuclear receptor familyTargetsThyroid hormone receptorTRα, TRβPeroxisome proliferator-activated receptorLXRα, LXRβ, FXR, FXR-βRetinoic acid receptorRARα, RARβ, RARγLiver X receptor-likeLXRα, LXRβ3-Ketosteroid receptorsGR, MR, PR, AREstrogen receptorErα, ErβExample：荧光素酶报告基因验证
