【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。当生物暴露在环境污染物中，生物可能会发生氧化应激，主要表现为活性氧（ROS）产生和消耗的不平衡。在需氧生物的活细胞中，活性氧被一种由水和脂溶性低分子量自由基清除剂、特异性抗氧化酶组成的抗氧化防御机制解毒。

 应用ROS特异性荧光检测试剂，它的水解产物能被ROS氧化为高荧光物质，用多功能酶标仪检测荧光值反映氧化应激的程度。本方法已被授予国家发明专利。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是底物对照组、正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内），并加入ROS特异性荧光检测试剂。

服用供试品一段时间后，我们使用酶标仪对斑马鱼体内ROS进行荧光定量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ROS荧光值

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内荧光值比正常对照组有明显升高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼ROS水平明显高于正常对照组，与正常对照组存在显著性差异。

2.本实验证实了该供试品诱发斑马鱼氧化应激。

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【评价原理】

甲萘醌是一种氧化剂，通过细胞内还原酶系统（微粒体的P450还原酶和线粒体的呼吸链还原酶），产生不稳定的半醌，进入氧化还原循环，产生活性氧族。用甲萘醌可诱导斑马鱼建立氧化应激模型。

经过特异性荧光染色（呈绿色，主要定位于细胞核和线粒体），发生氧化应激反应斑马鱼全身明显比正常斑马鱼绿很多，可以用荧光显微镜下观察到斑马鱼体内的活性氧含量。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和抗氧化剂组。其中正常对照组未摄入甲萘醌，模型对照组与抗氧化剂组都摄入了等量的甲萘醌（甲萘醌通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。抗氧化剂组在摄入甲萘醌之后摄入还原型谷胱甘肽之类的抗氧化剂。

服用一定时间抗氧化剂后，我们对斑马鱼整体做活性氧染色，观察整体绿色荧光强度的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼活性氧表型图

绿色荧光为活性氧

可以看到，抗氧化剂组的荧光强度较正常对照组强，但较模型对照组明显减弱。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗氧化剂组的荧光强度比模型对照组弱。

2.本实验证实了还原型谷胱甘肽具有明显抗氧化功效。

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【评价原理】

斑马鱼为鲤科短担尼鱼属的小型硬骨鱼，1998年国际经济合作与发展组织将斑马鱼胚胎发育方法列入测定单一化学品毒性的标准方法。由于斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，近年来斑马鱼被广泛应用于人类疾病模型及药物筛选、毒理学与环境检测中，使其成为新型的脊椎模式生物。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或胚胎注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体进行观察评价，观察斑马鱼心脏、脑部、耳、下颌、眼、肝脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、鳍、体长、身体着色、循环系统、身体水肿和出血等毒性反应情况，统计毒性发生率。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胚胎毒性表型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼眼变小、心包水肿、肝脏变性、卵黄囊吸收延迟、胃肠道发育延迟。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的组织器官产生明显的毒性表型，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有胚胎毒性。

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【评价原理】

泼尼松是糖皮质激素的一种常用制剂，糖皮质激素由于其抗炎和免疫抑制作用，在临床上得到广泛运用。皮质类固醇治疗过程中引起骨保护素(OPG)与核因子KB受体激活因子(RANK)配体(RANKL)之间的比例发生改变，导致在前3～6个月时骨吸收增加，使其发生骨质疏松并增加骨折的风险的不良反应。钙黄绿素是一种特异性的荧光染料，可与钙化的骨结构进行特异性结合。故在实验终点，用钙黄绿素工作液对斑马鱼进行染色，并置于荧光显微镜下观察，可观察到骨质疏松的斑马鱼脊椎骨荧光强度，比正常对照组斑马鱼弱很多。

我们评价骨质疏松症有2个指标：1. 骨形态发生蛋白（BMP）表达水平；2. 骨密度（荧光信号强度）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和增加骨密度药物组。其中正常对照组未加泼尼松，模型对照组与增加骨密度药物组都加入了等量的泼尼松（泼尼松通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用治疗骨质疏松药物组在加入泼尼松的同时加入依替膦酸二钠、特立帕肽之类的治疗骨质疏松的药物。服用药物后一段时间后，在显微镜下观察斑马鱼脊椎骨荧光强度同时测定基因的表达量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脊椎骨荧光表型图

框内为定量的脊椎骨

可以看到，服用治疗骨质疏松药物组的斑马鱼脊椎骨表型与未加入泼尼松的正常对照组比较相似，与模型对照组比较荧光信号明显增强，说明斑马鱼的骨密度有所恢复。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用治疗骨质疏松药物组的脊椎骨荧光强度与模型对照组比较明显增强，骨密度有所恢复；骨形态发生蛋白（BMP）表达量明显上调。

2.本实验证实了依替膦酸二钠、特立帕肽等治疗骨质疏松的药物具有增强骨密度的功效。

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【评价原理】

正常成人的心率在每分钟60～100次之间，如果低于60次称为心动过缓，是心律失常的一个重要类型，患者平时有头晕、乏力、倦怠、精神差的症状。研究表明，斑马鱼心血管系统的发育与人高度相似，虽然斑马鱼是单心房单心室，但其心脏结构及功能与人高度保守。同时，由于斑马鱼具有透明易观察等优点，开始被大量应用于心血管疾病研究和药物心血管毒性评价当中。

维拉帕米能阻滞心肌细胞慢通道，抑制Ca2+向细胞的内流，阻碍心脏慢反应电活动，降低舒张期去极化速度，抑制窦房结的自律性，减慢心率；亦能延长房室结的有效不应期，减慢房室传导。

用解剖显微镜下观察斑马鱼心率，模型对照组斑马鱼心率较正常斑马鱼明显减慢。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和药物组。其中正常对照组未摄入维拉帕米，模型对照组与药物组都摄入了等量的维拉帕米（维拉帕米通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。药物组先摄入地高辛之类的改善心动过缓药物再摄入维拉帕米。

服用改善心动过缓药物后再加入维拉帕米共同处理至实验终点后，我们对斑马鱼统计斑马鱼的心率。

【结果展示】

图1. 斑马鱼心动过缓柱状图

可以看到，模型对照组心率明显减慢，服用药物组的心率与正常对照组比较相似，没有明显的心率减慢。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用改善心动过缓药物组的心率相较于模型对照组。

2.本实验证实了地高辛具有明显改善心动过缓的功效。

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【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位处，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。内毒素（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，我们将其注射到斑马鱼卵黄囊，诱导炎症介质的产生。斑马鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在卵黄囊。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到斑马鱼卵黄囊的中性粒细胞比正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎组。其中正常对照组未注射LPS，模型对照组和抗炎组均注射LPS（LPS通过注射到卵黄囊的方式摄入到斑马鱼体内）。抗炎药组在注射LPS之前摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为卵黄囊，绿色颗粒为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组卵黄囊内中性粒细胞比模型对照组明显，未出现中性粒细胞大量募集情况。

以IL-6、IL-10基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼IL-6基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-6基因表达明显下调。

图3. 斑马鱼IL-10基因相对表达量

与模型对照组比较，***p < 0.001

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-10基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射抗炎药组卵黄囊内中性粒细胞数量比正常对照组略多，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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【评价原理】

酒精进入人体后90%进入肝脏进行代谢，长期过量饮酒诱发酒精性脂肪肝，临床表现为肝脏受脂肪浸润。由于斑马鱼拥有与人类相似的消化系统，如肝脏、肠道等，消化和营养的吸收及运输与人类高度相似，在大量摄入酒精后，肝脏也会出现脂肪变性（酒精性脂肪肝）的情况。

经过脂肪特异性染色（呈红色），患有酒精性脂肪肝的斑马鱼的肝脏会明显比正常斑马鱼的肝脏要红很多，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用解酒剂组。其中正常对照组未摄入酒精，模型对照组与服用解酒剂组都摄入了等量的酒精（酒精通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用解酒剂组在摄入酒精的同时摄入RU21、海王金樽之类的解酒剂。

服用一定时间解酒剂后，我们对斑马鱼整体做脂肪特异性染色，观察肝脏的脂肪变化，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼酒精性脂肪肝表型图

黄色虚线区域为肝脏，肝脏内红色代表脂肪

可以看到，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组比较相似，没有明显的脂肪沉积。

图2. 肝脏病理切片

黄色箭头指向脂肪颗粒

从病理切片中也能看出来，酒精性脂肪肝斑马鱼的肝脏有很多脂肪颗粒，而服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组都没有出现类似的脂肪颗粒。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组相似，并未出现模型对照组的出现大量脂肪颗粒（酒精性脂肪肝）的情况。

2.本实验证实了RU21、海王金樽解酒剂具有疏肝解酒（酒精性脂肪肝防治）功效。

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【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，斑马鱼肝脏中有许多与哺乳动物同源的脂质代谢酶，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。而且斑马鱼幼鱼通体透明，容易观察到毒性表型。酒精性肝损伤是全世界发病率和死亡率的主要原因，酒精性肝损伤是过量饮酒的结果。当患者继续饮酒时，会诱发严重的肝损伤形式，如脂肪性肝炎，纤维化，肝硬化和肝细胞癌。用乙醇可以诱发斑马鱼肝脏损伤，模拟人的肝脏疾病。

我们评价斑马鱼肝脏毒性有4个指标：1.肝脏面积；2.肝脏变性程度；3. 卵黄囊吸收延迟的发生率（卵黄囊是脂肪，卵黄囊吸收与肝功能密切相关）；4. 肝脏病理切片。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用肝保护剂组。其中正常对照组未摄入乙醇，模型对照组与服用肝保护剂组都摄入了等量的乙醇（乙醇通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。肝保护剂组在摄入对乙醇的同时摄入美他多辛之类的肝保护剂。

服用一段时间肝保护剂后，我们在显微镜下观察斑马鱼肝脏及卵黄囊表型，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

从病理切片中也能看出来，正常对照组肝细胞核规则清晰，肝细胞结构正常，边缘清晰。乙醇处理后，斑马鱼肝细胞结构模糊、肝细胞核肿大，肝组织出现脂肪空泡样变性，而肝保护剂组细胞和正常斑马鱼中形态相似。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，肝保护剂组斑马鱼肝脏与正常对照组相似，并未出现模型对照组的肝脏肿大、肝变性和卵黄囊吸收延迟情况。

2.本实验证实美他多辛对斑马鱼肝脏的保护作用。

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【评价原理】

Caspase家族在细胞凋亡的调控上起着重要的作用。Caspase分为三大类：凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎症介导因子。凋亡启动因子在级联反应的上游，包括（Caspase-8和Caspase-9）等，能识别和激活下游的Caspase。Caspase-9参与线粒体途径介导的细胞凋亡。凋亡执行因子在级联反应的下游，包括Caspase-3和Caspase-7等，作用于其特异性底物并导致细胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中的，最重要的凋亡执行者之一，大多数引发细胞凋亡的因素，最终均需要通过caspase-3介导的信号传递途径，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志。

我们评价斑马鱼对caspase的诱导作用有3个指标：1.对caspase 3的诱导作用；2.对caspase 8的诱导作用；3.对caspase 9的诱导作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和供服用/注射试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，利用特异性试剂盒检测斑马鱼体内caspase的活性。

【结果展示】

图1. 斑马鱼caspase3活性

与正常对照组比较，*** p < 0.001

图2. 斑马鱼caspase8活性

与正常对照组比较，*** p < 0.001

图3. 斑马鱼caspase9活性

与正常对照组比较，*** p < 0.001

可以看到，服用/注射供试品组与正常对照组比较caspase活性明显上升。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼caspase活性明显上升，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼caspase有诱导作用。

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【评价原理】

斑马鱼胃肠道粘膜屏障系统由较完整的机械屏障、化学屏障和免疫屏障构成，与哺乳动物高度相似，可作为胃肠道粘膜屏障研究的动物模型。三硝基苯磺酸（TNBS）可破坏肠道粘膜屏障，与肠组织蛋白结合形成抗原，发生变态反应，诱发结肠炎。杯状细胞主要分泌黏蛋白，形成黏膜屏障以保护上皮细胞，肠黏膜损伤时杯状细胞数量减少。我们可以应用特异性的染料（呈蓝色），观察肠道杯状细胞数目，评价肠道粘液分泌功能。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用肠道粘膜辅助保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用肠道粘膜辅助保护剂组都摄入了等量的TNBS（TNBS通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用肠道粘膜辅助保护剂组在TNBS诱导肠道粘膜损伤之后摄入常欣卫口服液之类的肠道粘膜辅助保护剂。

服用一段时间肠道粘膜辅助保护剂后，我们观察和分析肠道杯状细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肠道杯状细胞表型图

可以看到，服用肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

2.本实验证实了常欣卫口服液具有明显的促肠道粘液分泌功能。

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