【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。当生物暴露在环境污染物中，生物可能会发生氧化应激，主要表现为活性氧（ROS）产生和消耗的不平衡。在需氧生物的活细胞中，活性氧被一种由水和脂溶性低分子量自由基清除剂、特异性抗氧化酶组成的抗氧化防御机制解毒。

 应用ROS特异性荧光检测试剂，它的水解产物能被ROS氧化为高荧光物质，用多功能酶标仪检测荧光值反映氧化应激的程度。本方法已被授予国家发明专利。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是底物对照组、正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内），并加入ROS特异性荧光检测试剂。

服用供试品一段时间后，我们使用酶标仪对斑马鱼体内ROS进行荧光定量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ROS荧光值

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内荧光值比正常对照组有明显升高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼ROS水平明显高于正常对照组，与正常对照组存在显著性差异。

2.本实验证实了该供试品诱发斑马鱼氧化应激。

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【评价原理】

醉酒实为急性乙醇中毒，使人大脑兴奋，引起行为异常。乙醇进入人体后90%进入肝脏进行代谢，乙醇脱氢酶（ADH）可以将其氧化为乙醛，在乙醛脱氧酶（ALDH）催化下，乙醛转化为乙酸，最后转化为二氧化碳和水。在ADH和ALDH两种酶的作用下，乙醇能够被机体代谢而避免引起机体损伤。由于斑马鱼拥有与人类相似的消化系统，如肝脏、肠道等，消化和营养的吸收及运输与人类高度相似，当乙醇被过量摄入后，经过代谢产生大量乙醛，致使乙醛在体内积累，出现醉酒现象。

解酒有两种评价方法：1. 总运动距离，应用行为分析仪分析斑马鱼的运动轨迹，醉酒斑马鱼的总运动距离比正常斑马鱼明显增多。2. ADH和ALDH两种酶的含量，通过检测斑马鱼体内ADH和ALDH两种酶的含量，分析两种酶的调节作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用解酒剂组。其中正常对照组未摄入酒精，模型对照组和服用解酒剂组都摄入了等量的酒精（酒精通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用解酒剂组在摄入酒精之前摄入RU21、海王金樽之类的解酒剂。

服用一段时间解酒剂后，应用行为分析仪分析摄入酒精后的斑马鱼总运动距离；同时用ALDH和ADH试剂盒检测两种酶的含量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼运动轨迹图

黑线：慢速运动轨迹；绿线：中速运动；红线：快速运动，红线代表醉酒行为状态

可以看到，服用解酒剂组的运动轨迹与模型对照组比较，快速运动明显减少，醉酒行为有所改善。

从柱状图中可以出来，服用解酒剂组的ADH和ALDH两种酶含量与模型对照组比较明显增高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用解酒剂组的总运动距离与模型对照组比较明显降低，并ADH和ALDH两种酶含量明显增高。

2.本实验证实了RU21、海王金樽具有明显的解酒功效。

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空调、环境污染、季节转换带来的温度变化与压力，以及皮肤衰老、代谢减缓等因素，都会造成肌肤水份流失，令肌肤粗糙、黯哑、形成干纹、引发诸多肌肤问题。皮肤缺水可表现为表面失去光泽变得暗淡无光，失去弹性，出现细纹。补水保湿是护肤化妆品最基础的功效，通过斑马鱼技术能有效评价化妆品及其原料的补水保湿功效。

【评价原理】

斑马鱼用氯化钠处理，由于渗透压的原因皮肤表面将会失水皱缩，尾部面积因皱缩而变小，通过对尾部面积的影响评价化妆品的补水保湿效果。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组（供试品通过溶解到标准稀释水中的方式接触到斑马鱼皮肤）。

正常对照组不做处理，模型对照组用氯化钠溶液处理，供试品组在用氯化钠处理的同时定量加入受试的化妆品。孵育一段时间后，对斑马鱼进行拍照，以斑马鱼尾部面积评价供试品的补水保湿功效。

【结果展示】

图1 斑马鱼尾部面积（红色区域为尾部面积）

模型对照组斑马鱼尾鳍皱缩、面积明显减小

可以看到，供试品组斑马鱼的尾部面积与正常对照组相似，没有明显的皱缩。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，供试品组的斑马鱼尾部面积与正常对照组相似，没有出现明显的皱缩。

2.本实验证实了该供试品对具有明显的补水保湿功效。

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【评价原理】

铅中毒的器官主要是造血系统、心脏和神经系统。对于儿童的神经系统损伤导致智商降低，注意力缺陷多动障碍以及阅读和学习能力下降，其毒性机制与神经元生长和轴索束变化相关。

通过斑马鱼体内铅含量、轴索荧光强度和运动神经长度检测，铅中毒的斑马鱼体内铅含量明显比正常斑马鱼的高很多，而轴索荧光强度和运动神经长度铅中毒斑马鱼均明显少于正常斑马鱼。由于斑马鱼可被整体免疫荧光染色以及转基因荧光鱼运动神经发荧光的特性，我们可以通过荧光强度观察到明显的轴索细胞和运动神经的变化。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成五组，分别是正常对照组、模型对照组和服用促排铅剂组。其中正常对照组未摄入铅，模型对照组与服用促排铅剂组都摄入了等量的铅（铅通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用促排铅剂组在摄入铅的同时摄入绿豆肽复方之类的促排铅剂。

服用一段时间促排铅剂后，我们（1）检测体内铅含量；（2）用荧光显微镜采集轴索荧光强度；（3）用荧光显微镜采集运动神经长度。

【结果展示】

（1）体内铅含量：

图1. 斑马鱼体内铅含量

与模型对照组比较，*p < 0.05

可以看到，服用排铅剂组的铅含量与摄入相同铅的模型对照组比较相似明显减少。

（2）轴索荧光强度：

可以看到，服用排铅剂组脑部轴索荧光强度与摄入相同铅的模型对照组比较明显增加。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用促排铅剂组的铅含量、轴索荧光强度和运动神经长度与未摄入铅的正常对照组相似，并未出现模型对照组的铅含量升高，轴索荧光强度和运动神经长度减少的情况。

2.本实验证实了绿豆多肽复方具有明显的促排铅功效。

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【评价原理】

近年来，各种各样的美食迫使人们越来越关注胃肠道健康问题。斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，并拥有与人类结构和功能相似的胃肠道组织。斑马鱼胃肠道粘膜屏障系统由较完整的机械屏障、化学屏障和免疫屏障构成，与哺乳动物高度相似，可作为胃肠道粘膜屏障研究的动物模型。三硝基苯磺酸（TNBS）可破坏胃肠粘膜屏障，与肠组织蛋白结合形成抗原，发生变态反应，诱发溃疡性胃肠道损伤。胃肠道病变累及肌层和神经，导致胃肠壁张力减退，胃肠腔扩大。胃肠道病变时出现炎症反应，中性粒细胞募集到损伤部位。杯状细胞主要分泌黏蛋白，形成黏膜屏障以保护上皮细胞，胃肠黏膜损伤时杯状细胞数量减少。通过病理切片可观察胃肠道组织学改变（如溃疡形成等）的情况。

我们评价斑马鱼胃肠道粘膜损伤辅助保护功效有4个指标：1. 观察胃肠腔面积；2. 应用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，观察胃肠道中性粒细胞数量；3. 应用特异性的染料（呈蓝色），观察肠道杯状细胞数目；4. 胃肠道病理切片。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用胃肠道粘膜辅助保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用胃肠道粘膜辅助保护剂组都摄入了等量的TNBS（TNBS通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用胃肠道粘膜辅助保护剂组在TNBS诱导胃肠道粘膜损伤之后摄入常欣卫口服液之类的胃肠道粘膜辅助保护剂。

服用一段时间胃肠道粘膜辅助保护剂后，我们观察斑马鱼胃肠道表型，分析胃肠腔面积，胃肠道中性粒细胞数目和杯状细胞数目，同时制作成病理切片观察胃肠道的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胃肠道表型图（蓝色虚线区域为胃肠腔）

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护组的胃肠腔面积与正常对照组比较相似，没有明显的胃肠腔扩张。

图2. 斑马鱼胃肠道中性粒细胞表型图（黄色虚线区域为肠腔）

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的肠道中性粒细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的增多。

图3. 斑马鱼胃肠道杯状细胞表型图

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

图4. 斑马鱼胃肠道病理切片

可以看到，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的胃肠粘膜形态与正常对照组比较相似，没有明显的胃肠腔扩张、粘膜糜烂溃疡等症状。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用胃肠道粘膜辅助保护剂组的胃肠腔情况与正常对照组相似，并未出现模型对照组胃肠腔扩张、中性粒细胞数量增加、肠道杯状细胞数目减少、粘膜糜烂溃疡等情况。

2.本实验证实了常欣卫口服液具有明显胃肠道粘膜辅助保护功效。

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【评价原理】

贫血是指人体外周血红细胞容量减少，低于正常范围下限的一种常见的临床症状。斑马鱼造血系统的形成，包括红系、髓系、淋系及巨核系为主的造血系统，其相关的转录因子及信号转导通路同人类有高度的同源性，这些特点使斑马鱼在人类造血系统和血液疾病的研究中有着更加广泛的应用。由于斑马鱼早期出现血液循环时胚胎透明，可通过染色剂在显微镜直接观察心脏红细胞的数量。

苯肼导致红细胞外翻和氧化应激产生，红细胞外翻能够引起血细胞聚集，氧化应激产生导致内皮细胞损伤，进而导致血小板聚集、纤维蛋白原形成，最终诱导血栓发生。

用特异性红细胞染色剂（呈红色），贫血斑马鱼心脏部位的红细胞较正常斑马鱼明显减少，在解剖显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用补血药物组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用补血药物组都摄入了等量的苯肼（苯肼通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用补血药物组先摄入生血宁之类的改善贫血药物后再摄入苯肼。

服用改善贫血药物一段时间后，再加入苯肼共同处理一段时间后，我们对斑马鱼整体做红细胞特异性染色，最终分析斑马鱼的红细胞信号强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼贫血表型图

可以看到，模型对照组红细胞信号强度较正常对照组明显减少，服用补血药物组的红细胞信号强度与正常对照组比较相似，没有明显的红细胞减少情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用补血药物组的红细胞信号强度与正常对照组相似，并未出现模型对照组红细胞减少的情况。

2.本实验证实了生血宁具有明显改善贫血的功效。

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【评价原理】

过敏原/致敏因子诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放活性介质如组胺、5-HT，前列腺素D、白三烯、血小板活化因子等，表现为平滑肌收缩，毛细血管扩大和通透性增强，腺体分泌物增多等，诱发多种过敏症状。 类胰蛋白酶是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是临床上检验人体是否过敏的重要指标。斑马鱼产生过敏反应时，亦诱导肥大细胞分泌类胰蛋白酶。C48/80作为肥大细胞活化剂，可以诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放类胰蛋白酶。

我们检测过敏有两种方法。1. 类胰蛋白酶的含量：用酶标仪检测类胰蛋白酶的含量。2. 肥大细胞数量：制作病理切片，经过过碘酸雪夫染色，肥大细胞呈蓝色，肥大细胞释放的组胺和白三烯等物质呈红色。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成四组，分别是正常对照组和滴注致敏剂低、中、高剂量组。其中正常对照组未滴注C48/80，滴注致敏剂组均滴注C48/80低、中、高剂量（C48/80通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

滴注C48/80一段时间后，利用酶标仪检测类胰蛋白酶含量（吸光度值），同时制作病理切片进行过碘酸雪夫染色。

【结果展示】

图1. 斑马鱼类胰蛋白酶含量（吸光度值）

与正常对照组比较，*p < 0.05，***p < 0.001

可以看到，滴注中、高浓度致敏剂组类胰蛋白酶含量与正常对照组比较明显升高。

图2. 斑马鱼体内肥大细胞染色典型图

箭头指示为肥大细胞

从病理切片中也能看出来，滴注致敏剂组斑马鱼的肥大细胞与正常对照组相比数量明显上升。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，滴注致敏剂组斑马鱼类胰蛋白酶含量和肥大细胞数量与正常对照组相比数量明显上升。

2.本实验证实了C48/80具有明显的致敏作用。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。高血脂患者由于血液中胆固醇、油脂含量过多，就会使过多油脂沉积于血管壁上，容易使动脉管壁增厚、变硬、失去弹性，导致动脉硬化。斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖脂负荷状态下表现出持续高血糖、高血脂现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病。

用转基因绿色血管荧光斑马鱼（呈绿色），患有高糖高脂的斑马鱼眼部血管壁厚度较正常斑马鱼明显增厚，在共聚焦显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖降脂产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖降脂产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖降脂产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖降脂产品。

服用一段时间降糖降脂产品后，我们用共聚焦显微镜下观察斑马鱼眼部血管壁厚度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼眼部血管壁厚度

白色箭头所指为血管壁

可以看到，模型对照组的眼部血管壁厚度较正常对照组明显增厚，而降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近，并未出现模型对照组眼部血管壁增厚的情况。

2.本实验证实了松花蛹虫草具有眼部血管壁厚度增厚改善功效。

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皮肤微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环。血液循环最根本的功能是进行血液和组织之间的物质交换，皮肤微循环状态与皮肤衰老密切相关。

【评价原理】

转基因血管内皮绿色荧光斑马鱼的节间血管可以在荧光显微镜下被明显地观察到，因而可以通过观察受试物对节间血管直径的影响来评价受试物促进血管新生的功效，进而表征改善微循环功效。此外，可以利用血流分析仪检测受试斑马鱼的血流速度，补充评价改善微循环功效。

【实验方案】

将斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组。正常对照组不做处理，供试品组添加一定浓度的受试化妆品，孵育24h小时后，在荧光显微镜下观察斑马鱼节间血管并拍照保存图片，用高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼节间直径，通过其统计学意义评价供试品改善微循环功效。

此外，通过血流分析仪分析观察各组斑马鱼的血流速度，以血流速度的增加量评价受试化妆品改善微循环功效。

【结果展示】

1、斑马鱼节间血管直径

图4. 供试品改善微循环功效表型图

黄色虚线标记部分为斑马鱼肠下血管，红色箭头所指为出芽数

2、斑马鱼血流速度（提供各组实验柱状图）

图5 斑马鱼血流速度

与模型对照组比较，***p<0.001

【评价结论】

1、经过斑马鱼对比实验，供试品组与正常对照组对比，肠下血管面积增大，出芽数增多，直径变大。

2、与正常对照组相比，化妆品组斑马鱼血流速度明显增大。

3、本实验证实了该化妆品具有改善微循环的功效。

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【评价原理】

斑马鱼的鳔从器官进化、组织结构以及生物学等多个层面都类似于哺乳动物的肺泡。

细菌性肺炎：注射给予LPS建立斑马鱼细菌性肺炎模型。LPS是脂质和多糖的复合物，来源于革兰氏阴性菌细胞壁的外膜，是内毒素的主要成分。接触一定量的LPS会引起机体支气管炎、肺炎、肝炎及脂多糖血症。

通过使用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼和转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，在荧光显微镜下可以直接观察斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞，并分时间点视频记录巨噬细胞和中性粒细胞溢出血管情况，使用实时荧光定量PCR仪可获得基因表达水平，通过制作组织病理切片观察斑马鱼鱼鳔部位的病理结构变化。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中，模型对照组与抗炎药组都注射了等量的LPS建立细菌性肺炎模型。抗炎药组在注射了LPS的同时摄入吲哚美辛之类的抗肺炎抗炎药。

服用一段时间抗肺炎抗炎药后，我们在荧光显微镜下拍摄斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞的数量，并分时间点视频记录巨噬细胞和中性粒细胞溢出血管情况，用实时荧光定量PCR仪检测TNF-α、IL-1β值，同时制作成病理切片观察鱼鳔部位的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼中性粒表型图

黄色虚线区域为鱼鳔，绿色荧光颗粒为中性粒细胞

可以看到，抗炎药组斑马鱼鱼鳔位置处的中性粒细胞聚集情况明显改善。

图2. 斑马鱼巨噬细胞表型图

黄色虚线区域为鱼鳔，绿色荧光为巨噬细胞

可以看到，抗炎药组斑马鱼鱼鳔位置处的巨噬细胞聚集情况明显改善。

图3. TNF-α基因表达水平

与模型对照组比较，*p < 0.05

可以看到，抗炎药组能显著抑制斑马鱼的炎症基因TNF-α表达水平。

图4. IL-1β基因表达水平

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，抗炎药组能显著抑制斑马鱼的炎症基因IL-1β表达水平。

图4. 鱼鳔部位病理切片

从病理切片中能看出来，抗炎药组斑马鱼鱼鳔病理结构与正常对照组相似，未出现模型对照组渗入的炎性细胞明显增多的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗炎药组能显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞的聚集，能显著抑制炎症基因表达水平，能改善炎性浸润情况。

2.本实验证实了吲哚美辛具有显著的细菌性肺炎防治作用。

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