皮肤微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环。血液循环最根本的功能是进行血液和组织之间的物质交换，皮肤微循环状态与皮肤衰老密切相关。

【评价原理】

转基因血管内皮绿色荧光斑马鱼的节间血管可以在荧光显微镜下被明显地观察到，因而可以通过观察受试物对节间血管直径的影响来评价受试物促进血管新生的功效，进而表征改善微循环功效。此外，可以利用血流分析仪检测受试斑马鱼的血流速度，补充评价改善微循环功效。

【实验方案】

将斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组。正常对照组不做处理，供试品组添加一定浓度的受试化妆品，孵育24h小时后，在荧光显微镜下观察斑马鱼节间血管并拍照保存图片，用高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼节间直径，通过其统计学意义评价供试品改善微循环功效。

此外，通过血流分析仪分析观察各组斑马鱼的血流速度，以血流速度的增加量评价受试化妆品改善微循环功效。

【结果展示】

1、斑马鱼节间血管直径

图4. 供试品改善微循环功效表型图

黄色虚线标记部分为斑马鱼肠下血管，红色箭头所指为出芽数

2、斑马鱼血流速度（提供各组实验柱状图）

图5 斑马鱼血流速度

与模型对照组比较，***p<0.001

【评价结论】

1、经过斑马鱼对比实验，供试品组与正常对照组对比，肠下血管面积增大，出芽数增多，直径变大。

2、与正常对照组相比，化妆品组斑马鱼血流速度明显增大。

3、本实验证实了该化妆品具有改善微循环的功效。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。高血脂患者由于血液中胆固醇、油脂含量过多，就会使过多油脂沉积于血管壁上，容易使动脉管壁增厚、变硬、失去弹性，导致动脉硬化。斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖脂负荷状态下表现出持续高血糖、高血脂现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病。

用转基因绿色血管荧光斑马鱼（呈绿色），患有高糖高脂的斑马鱼眼部血管壁厚度较正常斑马鱼明显增厚，在共聚焦显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖降脂产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖降脂产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖降脂产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖降脂产品。

服用一段时间降糖降脂产品后，我们用共聚焦显微镜下观察斑马鱼眼部血管壁厚度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼眼部血管壁厚度

白色箭头所指为血管壁

可以看到，模型对照组的眼部血管壁厚度较正常对照组明显增厚，而降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近，并未出现模型对照组眼部血管壁增厚的情况。

2.本实验证实了松花蛹虫草具有眼部血管壁厚度增厚改善功效。

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【评价原理】

斑马鱼与人类生理结构和功能高度相似。斑马鱼消化道的解剖结构和细胞结构与人类消化道相似，具有同心圆层的内上皮、结缔组织、环状肌肉和外纵肌层。因此，可利用斑马鱼模型评价调节胃肠功效。

饲喂特异性的荧光染料（呈红色），在斑马鱼体内荧光染料不被其他组织干扰，且不会被吸收，荧光染料的残留量取决于胃肠道蠕动功能。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是模型对照组和服用胃肠调节剂组。模型对照组与服用胃肠调节剂组都摄入了等量的荧光染料（荧光染料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用胃肠调剂组在摄入荧光染料的之后摄入多潘立酮（吗丁啉）之类的胃肠调节剂。

服用一段时间胃肠调节剂后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼胃肠道荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胃肠道表型图

可以看到，胃肠调节剂组肠道荧光强度明显比模型对照组弱，说明胃肠调节剂通过促进胃肠道蠕动将荧光染料排出体外。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用胃肠调节剂组的胃肠道荧光情况比模型对照组明显减弱。

2.本实验证实了多潘立酮（吗丁啉）具有明显的胃肠调节功效。

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【评价原理】

斑马鱼心血管系统的发育与人高度相似，虽然斑马鱼是单心房单心室，但其心脏结构及功能与人高度保守。同时，由于斑马鱼具有透明易观察等优点，开始被大量应用于心血管疾病研究和药物心血管毒性评价当中。

羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 ( HMGCR) 是他汀类药物发挥抑制作用的直接作用点, HMGCR功能被抑制会影响血管的完整性和稳定性，诱发心脏出血。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和药物组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用改善心脏出血药物组都摄入了等量的辛伐他汀（辛伐他汀通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。药物组在摄入辛伐他汀的同时摄入淫羊藿苷之类的改善心脏出血药物。

服用改善心脏出血药物一段时间后，我们通过解剖显微镜对斑马鱼进行心脏出血发生率的统计；对斑马鱼进行行为学分析；通过心跳血流分析系统采集斑马鱼血流影像，并分析血流速度改善作用。

【结果展示】

图1. 斑马鱼改善心脏出血表型图

可以看到，模型对照组的斑马鱼心脏有明显的出血，服用改善心脏出血药物组的心脏出血情况与正常对照组比较相似，没有明显的心脏出血。

图2. 斑马鱼运动改善表型图

可以看到，模型对照组的运动距离明显减少，服用改善心脏出血药物组的运动距离与正常对照组比较相似，没有明显的运动减少。

图3. 斑马鱼改善血流柱状图

可以看到，模型组的血流速度明显减慢，服用改善心脏出血药物组的血流速度与模型对照组比较血流速度增加，没有明显的血流速度减慢。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用改善心脏出血药物组的心脏出血情况、运动距离、血流速度均有明显改善作用。

2.本实验证实了淫羊藿苷具有明显改善心脏出血的功效。

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化妆品中的功效活性成分是通过经皮吸收到达皮肤各层而发挥作用的，许多在体外试验中表现良好的活性物质在消费者实际使用过程中并未达到理想的功效结果，这与活性物的经皮吸收性能密切相关。

斑马鱼的皮肤结构与人体高度相似，因此活性成分在活体斑马鱼上的经皮吸收结果可以反映在人体皮肤上的吸收状况。

【评价原理】

    通过高效液相色谱法定量检测养鱼用水在孵育斑马鱼一段时间后的活性成分含量变化反映活性成分经斑马鱼的皮肤吸收状况，含量的减少量即为斑马鱼的经皮吸收量。

【实验方案】

我们将受试的斑马鱼分为三组，分别为正常对照组（不含活性物）、活性物对照组（不含鱼）和受试物组。在相同的温、湿度条件下孵育一段时间，在孵育前后分别检测各组中活性成分的含量。

【结果展示】

图1. 活性成分在不同组别中的色谱图

可以看到，受试物组的斑马鱼养鱼用水中的活性成分，在孵育后发生减少，减少量即为经皮吸收量。

【评价结论】

1、正常对照组的鱼水中未检测到活性成分，说明该方法不存在基体干扰；

2、活性物对照组孵育前后活性物含量无明显变化，说明在没有斑马鱼存在的孵育条件下活性物含量不发生变化；

3、受试物组，孵育后活性物含量明显低于孵育前，说明活性成分被经皮吸收至斑马鱼体内，经皮吸收量即为鱼水中的减少量。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。持续的高血糖水平导致糖尿病并发症发生，高血糖累及中枢和周围神经病变，出现神经炎症。感觉神经受损较为多见，出现麻木、触电、发热、蚁行感，运动神经受损则出现肌力下降。斑马鱼胰腺的形态发生和基本细胞结构、排列方式类似于哺乳动物，斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖负荷状态下表现出持续高血糖现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病的神经并发症。

用中性粒细胞荧光与运动神经荧光杂交品系斑马鱼（呈绿色），患有高血糖的斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目增多，在荧光显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖产品。

服用一段时间降糖产品后，我们用荧光显微镜观察斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目

黄色框线内绿色荧光点代表中性粒细胞

可以看到，模型对照组的周围运动神经中性粒细胞数目较正常对照组明显增多，而降糖产品组斑马鱼明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖产品组斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目与模型对照组比较明显减少。

2.本实验证实了松花蛹虫草之类的降糖产品具有神经炎症消退功效。

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【评价原理】

由于硬骨鱼和人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，而且与其他的动物模型相比，斑马鱼具有个体小适合高通量化学筛选、幼鱼身体透明易于观察骨骼发育的特点，所以近年来以斑马鱼为模型的骨骼研究逐渐成为这一领域的热点。斑马鱼从前向后的脊椎发育过程是非连续的，而是分成两个不同的区域：前域（包括前3块椎骨）和后域（包括第4-31块椎骨）。将斑马鱼脊椎骨钙化过程分成两个不同区域是基于第2和第3椎骨的出现晚于第4椎骨。我们利用斑马鱼骨骼发育的规律，摄入生长发育促进剂的斑马鱼脊椎骨发育会加快。

脊椎骨染色应用与钙特异性结合的荧光染料（呈绿色），经荧光显微镜观察脊椎骨的数量。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用生长发育促进剂组（维生素D3、碳酸钙之类的生长发育促进剂通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间生长发育促进剂后，我们对斑马鱼做骨骼特异性荧光染色，观察斑马鱼脊椎骨的发育情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼脊椎骨荧光图

黄色虚线区域为定量的脊椎骨

可以看到，服用生长发育促进剂的脊椎骨数量明显比正常对照组增多。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用生长发育促进剂的斑马鱼脊椎骨数量比正常对照组增多。

2.本实验证实了维生素D3、碳酸钙具有明显促进生长发育功效。

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【评价原理】

多发性硬化是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病，可能是遗传易感个体与环境因素作用而发生的神经免疫过程，由于其发病率较高，成慢性病程和倾向于年轻人罹患，而成为最重要的神经系统疾病之一。研究表明斑马鱼的髓鞘少突胶质细胞的结构特性和细胞谱系关系与哺乳动物具有高度的可比性。斑马鱼体内与髓鞘形成相关的基因与哺乳动物具有很好的同源性。尽管这些基因与哺乳动物有些不同，但高度保守的基因序列足够表达出功能类似的蛋白。

溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，能诱导斑马鱼脑脊髓神经细胞髓鞘损伤。经过特异性荧光染色，髓鞘损伤的斑马鱼荧光比正常斑马鱼弱很多，可以在荧光显微镜下明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用髓鞘保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用髓鞘保护剂组都摄入了等量的溴化乙锭（溴化乙锭通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用髓鞘保护剂组先摄入溴化乙锭再摄入L-甲状腺素钠之类的髓鞘保护剂。

服用髓鞘保护剂后，我们对斑马鱼整体进行荧光染色，对斑马鱼髓鞘进行定量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼多发性硬化症表型图

黄色箭头为斑马鱼髓鞘细胞

可以看到，模型对照组的髓鞘细胞荧光强度较正常对照组明显减弱，服用髓鞘保护剂组的髓鞘细胞荧光强度明显增强。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用髓鞘保护剂组的髓鞘细胞荧光强度明显增强，并未出现模型对照组明显髓鞘损伤的情况。

2.本实验证实了L-甲状腺素钠具有明显治疗多发性硬化症的功效。

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【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。硫酸铜损伤斑马鱼神经丘（斑马鱼体表侧线器的末稍器官），造成神经丘细胞死亡，斑鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在神经丘周围，吞噬死亡的细胞 。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞比正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中正常对照组未摄入硫酸铜，模型对照组和服用/注射抗炎药组均摄入硫酸铜（硫酸铜通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用/注射抗炎药组在摄入硫酸铜之前摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体表侧线上中性粒细胞表型图

黄色箭头所指为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组侧线上中性粒细胞与正常对照组相似，未出现中性粒细胞募集情况。

以IL-1β基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼IL-1β基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-1β基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗炎药组侧线上中性粒细胞数量与正常对照组数量相当，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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随着年龄的增长，人体皮肤因自身生理调节和外界因素的作用而逐渐出现雀斑、日晒斑、黄褐斑等色斑，色斑的形成与皮肤中黑色素的沉着有关，祛斑功效实质上是对黑色素的清除作用。通过班斑马鱼技术能简洁而有效的评价化妆品的祛斑功效。

【评价原理】

斑马鱼在发育初期全身透明，胚胎发育至 24 h时黑色素开始从视网膜上皮生长，48h逐渐形成稳定并可见的黑色素色斑。将受试物于斑马鱼发育48h时加入鱼水中，72h时观察黑色素的降低程度，从而评价祛斑功效

【实验方案】

我们挑选2dpf的斑马鱼分成若干组，含正常对照组和供试品组。正常对照组不做处理，供试品组使用受试化妆品，孵育24hpf后，对斑马鱼头部进行拍照，利用高级图像处理软件分析斑马鱼头部的黑色素信号强度，从而评价其祛斑功效。

【结果展示】（展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

图1. 斑马鱼头部黑色素表型图（蓝色为分析区域）

阳性对照组和化妆品组与正常对照组对比分析，得出祛斑功效作用。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼对比实验，阳性对照组和化妆品组与正常对照组对比，斑马鱼头部只有少量的黑色素。

2.本实验证实了该化妆品具有祛斑作用。

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