2022年12月19日，Madrigal Pharmaceuticals公司宣布了resmetirom（甲状腺激素受体（THR）-β口服选择性激动剂）治疗非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）的III期临床试验的积极结果，该研究达到双主要终点与一项关键次要终点，这一新闻无疑为NASH研究领域带来了最好的新年贺礼。 NASH是非酒精脂肪肝病（NAFLD）的疾病进展形式，表现为肝细胞脂肪变性，炎症细胞浸润和肝细胞气球样病变等症状，疾病进展可能会进一步导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌的发生。根据流行病学调查，NAFLD的全球患病率约为25%，NASH全球患病率约为1.5-6.5%，预计2015年至2030年期间NASH的患病率将增加63%，未来5-15年将超过丙肝感染成为等待肝移植的末期肝病的主要原因。全球NASH药物市场规模快速增长，预计2025年将达到107亿美元。NASH治疗药物的主要作用机制NASH的病理生理过程复杂，肥胖、II型糖尿病和代谢综合征是主要易感因素之一。但尚未有针对NASH适应症的药物在欧美等市场获批上市，仍需要复合的管理和药物联合治疗。目前治疗NASH的药物主要作用机制包括改善糖脂代谢、降低脂质毒性和细胞死亡、缓解肝脏炎症和抗纤维化等[1、2]。改善糖脂代谢药物肝脏中过量的脂肪酸导致过量能量，从而产生肝细胞的脂肪毒性代谢产物破坏肝细胞，因此减少肝内游离脂肪酸是一种潜在治疗策略。1、FXR（法尼酯 X受体）激动剂：可以改善胰岛素敏感性，抑制DNL并降低胆汁酸合成。此外，FXR的激活可以抑制固醇调节元件结合蛋白1C(SREBP-1C)，进而调节甘油三酯代谢和脂质再生。2. PPARs（过氧化物酶体增殖物激活受体）：包括三个亚型（PPARα、PPARβ和PPARγ），可以调节脂肪酸代谢。3. GLP-1R（胰高糖素样肽受体）激动剂：增强胰岛素分泌，以葡萄糖浓度依赖方式抑制胰高血糖素的分泌，减少血糖。4. THRβ（甲状腺激素受体β）激动剂：能够激活肝脏中的THRβ亚型，减少脂肪毒性改善肝功能。缓解肝脏炎症药物NASH疾病患者的肝巨噬细胞累积和炎症症状明显。1. ASK1（凋亡信号调节激酶1）抑制剂：阻断ASK1的激活，可抑制炎症发生、肝脏纤维化、胰岛素抵抗和肝脏脂质堆积等疾病过程。2. A3AR（选择性A3腺苷受体）激动剂：下调NF-κB信号通路，诱导炎性细胞凋亡。3. TLR4拮抗剂:抗炎抗纤维化。抗肝脏纤维化药物主要作用于抑制原纤维生成和纤维蛋白溶解增强两个方面。1. CCR2/5（C-C基序趋化因子受体）抑制剂：CCR2和CCR5介导通过募集炎症单核细胞和巨噬细胞的纤维化，并激活淋巴细胞和肝星状细胞。CCR2/5抑制剂具有抗炎和抗纤维化作用。2. TGF-β（转化生长因子）抑制剂：TGF-β诱导的促纤维化减弱。3. FGF（激素成纤维细胞生长因子）类似物：FGF19类似物抑制胆汁酸合成，调节代谢平衡；FGF21类似物减少肝脏脂肪和炎症，逆转纤维化，增加胰岛素敏感性并改善脂蛋白。全球部分NASH药物研发进展针对NASH的治疗药物以代谢类药物为主，多数为小分子化合物，海外药企诺和诺德、诺华、阿利斯康等均有布局，国内歌礼制药、众生药业、东阳光药业、先为达生物处于临床I/II期阶段。也有众多药物在NASH适应症上惨遭失败，20多款药物开发终止。2022年再生元在《新英格兰医学》公布一项研究，揭示未来NASH新兴靶点CIDEB，CIDEB基因变异被发现具有保护肝脏的功能；Cell Metabolism杂志上研究论文阐明了NASH中Cholesterol与TAZ的联系，为治疗纤维化NASH提供了新的靶点；宾夕法尼亚大学在Science发表的一项研究展示了选择性抑制剂mTORC1可有效抑制NASH。相信随着科学研究和生物技术的不断提高，NASH药物开发有望迎来更多创新药物选择。数据来源：科睿唯安数据库，公开资料NASH动物模型及药效评估NASH动物模型是临床前研究的重要工具，主要分为饮食诱导、化学诱导、基因编辑动物模型以及联合诱导模型。除了之前已经构建的WD（西方饮食）诱导NASH小鼠模型、HFMCD（高脂肪蛋氨酸胆碱缺乏饮食）诱导的NASH小鼠模型以及联合诱导的STAM-NASH模型，百奥动物新构建出基于C57BL/6老龄鼠和B-ob/ob小鼠的GAN（Gubra-Amylin NASH）饮食诱导NASH模型。GAN饮食是一种经过改良、无反式脂肪的高脂高胆固醇高果糖饲料（含40%脂肪、20%果糖和2%胆固醇），研究表明，GAN饮食诱导的NASH动物模型更生理的模拟了人类NASH疾病的发生，在生理、代谢和组织病理学方面有良好的转化性[3]。不同性别的动物在NASH易感性和严重程度上差异很大，雄性啮齿类动物比雌性更易发生NASH，因此绝大部分的研究只选择使用雄性动物。但雌性动物特定的病理生理机制的研究对NASH的精准治疗方案同样意义重大，FDA也要求不能忽略雌性动物对NASH研究的意义。百奥动物基于C57BL/6老龄鼠构建了GAN饮食诱导的NASH模型，同时选用雌雄两性别的老年鼠进行NASH模型的开发。结果显示，老龄鼠造模周期较年轻小鼠更短，诱导12周即可出现NASH表型，21周出现纤维化，能够更好的助力NASH药物临床前研究，加速药物评估和转化进程。C57BL/6老龄鼠的NASH模型模型诱导实验动物（C57BL/6 mice，5W，M；C57BL/6 mice，56W，M/F）使用Gubra-Amylin NASH (GAN) 饮食饲养。模型验证GAN饮食诱导的老龄鼠NASH模型表现出明显的代谢紊乱GAN饮食诱导的老龄鼠NASH模型表现出代谢紊乱。(A-B)GAN饮食诱导组的体重增加。(C)GAN饮食诱导组的葡萄糖耐受能力受损。(D)C图曲线下面积。(E)GAN饮食诱导组的血浆胰岛素含量增加。N=6-10 mice per group. Data are expressed as mean ± SEM. **: p<0.01.GAN饮食诱导12周后，老龄鼠表现出比年轻小鼠更严重的NASH表型GAN饮食诱导的老龄鼠NASH模型(A)诱导12周后H&E染色的代表性图片。(B)NAS（NAFLD acticity score）评分。 Data are expressed as mean ± SEM.N=6-10 mice per group. **: p<0.01. GAN饮食诱导21周后，老龄鼠表现出比年轻小鼠更严重的纤维化GAN饮食诱导的老龄鼠纤维化(A)诱导21周后天狼星红染色的代表性图片。(B)天狼星红染色的纤维化评分。Data are expressed as mean ± SEM. N=6-10 mice per group. **: p<0.01.GAN饮食诱导21周后，老龄雄鼠肝脏中的免疫细胞浸润增加GAN饮食诱导21周后，老龄雄鼠肝脏中的免疫细胞浸润增加(A)流式细胞仪评估肝脏中单核细胞（CD11bintF4 / 80low）和kupffer细胞（CD11b+F4 / 80hi）浸润比例。(B)肝脏中不同类型免疫细胞分析。Data are expressed as mean ± SEM. N=6-10 mice per group. *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001.GAN饮食诱导的C57BL/6小鼠NASH模型构建及药效评价模型诱导实验动物（C57BL/6 mice，6W，M）使用Gubra-Amylin NASH (GAN) 饮食饲养。模型验证GAN饮食诱导的C57BL/6小鼠NASH模型(A)治疗下的体重变化。(B)治疗后的葡萄糖耐受能力。(C)B图曲线下的面积。(D)诱导20周后H&E染色的代表性图片。(E)NAS（NAFLD acticity score）评分。Data are expressed as mean ± SEM. N=9 mice per group. *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001.GAN饮食诱导的B-ob/ob小鼠NASH模型构建及药效评价模型诱导实验动物（B-ob/ob mice，6W，M）使用Gubra-Amylin NASH (GAN) 饮食饲养。模型验证GAN饮食诱导的B-ob/0b小鼠NASH模型(A)治疗下的体重变化。(B)治疗后的葡萄糖耐受能力。(C)B图曲线下的面积。Data are expressed as mean ± SEM. N=9 mice per group. *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001.GAN饮食诱导B-ob/ob小鼠的NASH及纤维化(A)诱导16周后H&E染色的代表性图片。(B)NAS（NAFLD acticity score）评分。(C)诱导16周后天狼星红染色的代表性图片。(D)天狼星红染色的纤维化评分。Data are expressed as mean ± SEM. N=9 mice per group.百奥动物NASH模型比较百奥动物可提供多款饮食/饮食化学联合诱导的NASH小鼠模型，以及基于NASH模型的药物药理药效评估服务，欢迎联系洽谈。参考资料：1. Fu Y, et al., Diagnostic and therapeutic strategies for non-alcoholic fatty liver disease. Front Pharmacol. 2022 Nov 2;13:973366.2. Oseini, A.M. and Sanyal, A.J. Therapies in non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Liver Int, 2017,37: 97-103.3. Hansen, H.H., et al.,  Human translatability of the GAN diet-induced obese mouse model of non-alcoholic steatohepatitis. BMC Gastroenterol. 2020 Jul 6;20(1):2104. Hansen, H.H., et al., Mouse models of nonalcoholic steatohepatitis in preclinical drug development. Drug Discov Today, 2017. 22(11): p. 1707-1718.5. Ibrahim, S.H., et al., Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Dig Dis Sci, 2016. 61(5): p. 1325-36.

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)是一种严重的自身免疫性疾病，主要特征为免疫调节功能紊乱，通过自身反应性细胞和抗体可引发炎性细胞因子的过度产生和攻击正常组织(心脏、关节、皮肤、肺、血管、肝脏、肾脏和神经系统)[1]。系统性红斑狼疮发病机制综述[1]遗传、环境、激素、表观遗传和免疫调节因素依次或同时作用于免疫系统。致病因素的作用导致自身抗体、免疫复合物、自身反应性或炎症性T细胞和炎症细胞因子的产生，这些细胞可能启动和放大各种器官的炎症和损伤。受局部因素影响，靶器官可能进一步受损。流行病学数据显示，我国SLE疾病负担较重，预估发病率约为8.57/10万人年，位居全球第四位[2]。其中约90%的SLE患者是女性，其余10%为男性及儿童。研究显示，SLE患者5年生存率从20世纪50年代的50%~60%升高至90年代的超过90%，并在2008年~2016年逐渐趋于稳定。SLE已由既往的急性、高致死性疾病转为慢性、可控性疾病[3]。SLE传统治疗药物包括糖皮质激素、抗疟药、免疫抑制剂、富马酸酯、间充质干细胞、小剂量白细胞介素2（IL2）、生物制剂等。目前，获批上市用于治疗SLE的靶向生物药仅3种。BioMice百奥动物自主开发了一系列稳定的靶点人源化小鼠模型，能够在不同方面模拟SLE发生发展过程，为临床前开发、评价更有效的SLE治疗药物提供了相应的疾病模型，加速了相关药物的研发进程。部分模型数据展示如下：>>>B-hTWEAK/hAPRIL mice肿瘤中的TWEAK/Fn14信号通路[4]。将TWEAK与Fn14结合导致Ect2 GEF激活Cdc42，随后由Trio GEF激活Rac1，促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭。TWEAK/Fn14信号同时激活经典和替代NF-κB通路，诱导细胞因子、趋化因子、粘附分子的产生。TWEAK/Fn14相互作用激活TRAF2信号通路。然后，Fn14招募一个cIAP1 TRAF2复合体。cIAP1使细胞对TNF-α敏感。TNF-α通过与TNFR1和TNFR2两种受体结合产生不同的效应。TNFR1可诱导细胞死亡，TNFR2可促进细胞增殖。BAFF和APRIL受体相互作用[5]。B细胞刺激分子BAFF和APRIL是维持B细胞和体液免疫的关键因素。BAFF和APRIL可以裂解成三聚体可溶性细胞因子，也可以组装成异构体。BAFF结合它的三个受体具有不同的亲和力：它与BAFF-R结合最强，其次是TACI，与BCMA结合较弱。APRIL是BCMA的首选配体，其次是TACI。APRIL还在细胞外基质和肿瘤或其他细胞表面与HSPG结合，触发APRIL多聚化并通过TACI实现信号传递。BAFF通过BAFF-R信号通路使用NF-κB和PI3K通路，而APRIL信号通过NF-κB通路与BCMA和TAC结合。B细胞蛋白表达分析>>>纯合B-hTWEAK/hAPRIL小鼠中种属特异性APRIL表达的流式细胞术分析。采集野生型(WT)小鼠和纯合B-hTWEAK/hAPRIL小鼠脾细胞，用抗APRIL抗体流式细胞术分析。由于抗体的交叉反应性，在WT小鼠和纯合B-hTWEAK/hAPRIL小鼠中检测到APRIL。>>>B-hBAFF mice人B细胞激活因子和增殖诱导配体抑制剂的作用机制[6]。B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)与三种受体B细胞激活因子受体(BAFF-R)、跨膜激活剂和钙调节剂和亲环配体相互作用剂(TACI)和B细胞成熟抗原(BCMA)结合不同。选择性BAFF抑制剂阻断可溶性BAFF或可溶性和膜性BAFF与其受体之间的相互作用，使APRIL功能完整，而BAFF/APRIL双抑制剂atacicept (TACI-Ig)阻断BAFF和APRIL与所有三种受体的相互作用。BAFF抑制会消耗B细胞并改变自身反应性B细胞的选择，并可能对T细胞和树突状细胞(DC)有直接或间接的影响。蛋白表达分析>>>用ELISA法分析野生型(WT)小鼠和B-hBAFF小鼠中BAFF的表达。采集WT小鼠和杂合B-hBAFF小鼠血清，采用种属特异性BAFF ELISA试剂盒进行ELISA分析。在WT小鼠和杂合B-hBAFF小鼠(H/+)中检测到小鼠BAFF。人BAFF仅在杂合B-hBAFF小鼠中检测到。ND:检测不到。>>>B-hBAFFR mice蛋白表达分析>>>纯合B-hBAFFR小鼠中种属特异性BAFFR表达的流式细胞仪分析。取WT和纯合B-hBAFFR小鼠脾细胞，用种属特异性抗BAFFR抗体流式细胞术分析。小鼠BAFFR在WT小鼠中检测到。人BAFFR仅在纯合B-hBAFFR中检测到，而在WT小鼠中检测不到。>>>B-hBAFF/hBAFFR mice蛋白表达分析>>>流式细胞术分析纯合B-hBAFF/hBAFFR小鼠中种属特异性BAFFR的表达。从野生型(WT)小鼠和纯合B-hBAFF/hBAFFR小鼠采集脾脏、淋巴结和血液中的B细胞，用种属特异性抗BAFFR抗体流式细胞仪分析。在WT小鼠中检测到小鼠BAFFR。人BAFFR仅在纯合B-hBAFF/hBAFFR小鼠检测到，而WT小鼠(+/+)则没有。>>>B-hC1Q miceC1q在免疫稳态中具有基本的抑制作用[7]。a.在描述良好的凋亡细胞清除通路中，C1q与吞噬细胞上的各种gC1q和C1q尾部受体相互作用，导致细胞因子产生/炎症反应的调节。C1q胶原蛋白尾部与LAIR-1之间的相互作用可阻止pDCs和单核细胞产生I型ifn和炎症因子，并在稳态或炎症状态下抑制DC分化和激活。PDC浆细胞样树突状细胞，Mono单核细胞，moDC单核细胞来源的树突状细胞。蛋白表达分析>>>ELISA法检测C1Q在野生型C57BL/6小鼠和纯合B-hC1Q小鼠中的表达。采集野生型C57BL/6小鼠和纯合B-hC1Q小鼠血清。小鼠C1Q仅在野生型小鼠中检测到。C1Q在野生型C57BL/6小鼠和纯合B-hC1Q小鼠中均可检测到。因此，推测该抗人C1Q抗体在人鼠之间具有交叉反应性。>>>B-hCLEC4C miceBDCA-2靶点全名为血液树突状细胞抗原2，也叫CLEC4C或CD303。CD303与FcRγ-链相关，在BCR样信号体中发出信号。触发CD303导致Syk的激活，SLP65的募集和PLCγ2的活性。在pDC中，PLCγ2-PKC通路可能在CD303触发后对NF-kB通路起负调控作用，并抑制IFN-I基因。越来越多的证据表明，pDC作为IFN-I的主要生产者可能在SLE的发病机制中发挥作用。pDC衍生的I型IFN被认为在SLE的致病性中发挥重要作用。血液树突状细胞抗原(BDCA2)是一种受体，特异性表达于人类和非人类灵长类动物的pDCs上，抑制TLR7和TLR9介导的I型IFN[8,9]。蛋白表达分析>>>流式细胞术分析B-hCLEC4C小鼠中种属特异性CLEC4C表达。采集野生型C57BL/6小鼠、杂合B-hCLEC4C小鼠和纯合B-hCLEC4C小鼠脾细胞，用抗CLEC4C抗体进行流式细胞术分析。人类CLEC4C仅在B-hCLEC4C小鼠的浆细胞样树突状细胞(pDCs)中检测到，而在野生型小鼠中检测不到。在B-CLEC4C小鼠和野生型小鼠的T细胞、B细胞和NK细胞中均未检测到人CLEC4C。参考资料：[1] Tsokos GC. Systemic lupus erythematosus. N Engl J Med. 2011, 365(22):2110-21.[2] Tian J, Zhang D, Yao X, et al. Global epidemiology of systemic lupus erythematosus: a comprehensive systematic analysis and modelling study. Ann Rheum Dis. 2022 Oct 14:ard-2022-223035.[3]曾小峰,陈耀龙.2020中国系统性红斑狼疮诊疗指南[J].中华内科杂志,2020(3):172-185.[4] Hu G, Zeng W, Xia Y. TWEAK/Fn14 signaling in tumors[J]. Tumor Biology, 2017, 39(6): 1010428317714624.[5]Samy E, Wax S, Huard B, et al. Targeting BAFF and APRIL in systemic lupus erythematosus and other antibody-associated diseases[J]. International reviews of immunology, 2017, 36(1): 3-19.[6]Boneparth A ,  Davidson A . B-cell activating factor targeted therapy and lupus[J]. Arthritis Research & Therapy, 2012, 14(4 Supplement):S2-S2.[7]Son M, Diamond B, Santiago-Schwarz F. Fundamental role of C1q in autoimmunity and inflammation. Immunol Res. 2015;63(1-3):101-106. doi:10.1007/s12026-015-8705-6[8]Röck J, Schneider E, Grün JR, et al. CD303 (BDCA-2) signals in plasmacytoid dendritic cells via a BCR-like signalosome involving Syk, Slp65 and PLCgamma2. Eur J Immunol. 2007;37(12):3564-3575. doi:10.1002/eji.200737711[9]Pellerin A, Otero K, Czerkowicz JM, et al. Anti-BDCA2 monoclonal antibody inhibits plasmacytoid dendritic cell activation through Fc-dependent and Fc-independent mechanisms. EMBO Mol Med. 2015;7(4):464-476. doi:10.15252/emmm.201404719

导读近日，CDE官网显示苏州泽璟生物制药股份有限公司I类新药「注射用盐酸ZG0895」在国内获批临床，有望成为一个全新的晚期实体瘤治疗新药，并可与肿瘤免疫治疗药物等其它药物联合增强抗肿瘤药效，从而改善患者的生活质量和延长寿命。ZG0895是泽璟制药自主研发的一种新型的高活性、高选择性的Toll样受体8（TLR8）激动剂，在多种体内模型中具有优异的抗肿瘤活性，可以导致肿瘤消退。今年AACR年会上公布的临床前研究数据中显示，ZG0895具有独特的结构，皮下注射后会展现出独特的药代动力学特性，可以降低药物进入循环系统后可能带来的全身性免疫系统持续激活的风险，具备良好的安全性，同时可以剂量依赖性的显著抑制肿瘤生长，相比以往的TLR8激动剂有望具有更好的临床用药安全性。背景概述Toll样受体家族（TLRs）是一类模式识别受体，可以识别PAMPs（病原体相关分子模式，Pathogen-associated molecular pattern），引发人体复杂的级联免疫反应；不但表达于免疫细胞上，还在各种肿瘤细胞中表达，参与肿瘤免疫监视，同时在炎症、免疫细胞调控、和增殖方面也发挥着关键作用。人和小鼠共13种TLRs，其中TLR10为人独有，TLR11/12/13为小鼠独有，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6是位于细胞表面的受体，相反TLR3、TLR7、TLR 8、TLR9位于内涵体中。图1  TRLs受体及其配体[1]相较于其它TLRs成员，TLR8 在多种免疫细胞表达，可以激活髓样树突状细胞来逆转Treg 细胞的免疫抑制功能，从而抑制肿瘤[2]。TLR7和TLR8信号通路共有接头蛋白MyD88，TLR7激活后通过形成复合物MyD88-IRF7促进炎症细胞因子表达[3]。当TLR8与其配体包括GU-rich ssRNA，short dsRNA，寡核苷酸和多种合成的化学激动剂结合时，其空间构象发生改变，形成同源二聚体，通过下游MyD88/IRAKs激活IRF7及NF-κB通路，诱导多种炎性细胞因子、IFNs、趋化因子的产生，抵抗细菌和病毒感染，也参与到多种疾病发生发展过程中[4]；另外TLR8还可以通过激活IRF3/7通路诱导IFN-b表达。图2 TLR8信号通路[4]TLR8药物靶点布局目前，全球尚未有TLR8 激动剂获批上市，但已出现多款在研药物。药物类型上，TLR8激动剂包括小分子化药和抗体偶联药物；适应症方面，在研TLR8激动剂还被开发用于治疗晚期实体瘤和慢性乙型肝炎。在这个领域研究进度比较领先的公司是吉利德，其中GS-9688是一款可口服使用的选择性TLR8小分子激动剂，用于治疗慢性乙型肝炎。另外上海迪诺医药科技有限公司的DN1508052-01是国内首款获批临床的小分子TLR8激动剂，用于治疗标准治疗后疾病进展或无标准治疗的晚期实体肿瘤。表1. 部分药物研究进展数据来源于科睿唯安及公开信息整理TLR8 作为一种已被证实的肿瘤靶点，具有广阔的肿瘤治疗临床应用潜力。BioMice百奥动物开发了一种新型TLR8人源化小鼠模型，助力相关药物的临床前药效评估，为TLR8激动剂的安全性评价提供了有力工具。部分数据展示如下：B-hTLR8 mice基本信息DC细胞中TLR8蛋白表达分析采集野生和纯合B-hTLR8 (H/H)小鼠的脾细胞，用种属特异性抗TLR8抗体进行流式细胞术分析。由于抗小鼠TLR8抗体与人TLR8的交叉反应，在野生小鼠和纯合B-hTLR8中检测到小鼠TLR8。人TLR8仅能在纯合B-hTLR8中检测到，而不能在野生小鼠中检测到。功能检测采集野生型小鼠和纯合B-hTLR8 (H/H)小鼠脾细胞，用TLR8激动剂TLR8-506和GS-9688 (Selgantolimod)刺激，ELISA对小鼠TNFα、IFNγ和IL12p40进行检测。与野生型相比，纯合B-hTLR8小鼠的TNFα、IFNγ和IL12p40分泌增加，这是由于B-hTLR8 mice与人TLR8有选择性的高亲和力结合，并且刺激与GS-9688浓度呈剂量依赖性。脾脏中白细胞亚群分析用流式细胞术分析从雌性C57BL/6和B-hTLR8小鼠(n= 3,6周龄)中分离的脾细胞以评估白细胞亚群。A.具有代表性的FACS图。B. FACS分析结果。纯合B- hTLR8小鼠的T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的百分比与C57BL/6小鼠相似，表明TLR8人源化不会改变这些细胞类型在脾脏的整体发育、分化或分布。药效实验靶向TROP2的抗体偶联TLR8小分子激动剂药物抗肿瘤药效。(A)抗人TROP2抗体偶联TLR8小分子激动剂抑制B-hTLR8小鼠MC38肿瘤生长。小鼠结肠癌B-hTROP2 MC38细胞皮下接种到纯合B-hTLR8小鼠(雌性，9周龄，n=8)。小鼠按体重差异分组，分别用不同剂量的抗体偶联药物治疗。(B)治疗期间体重变化。如图A所示，抗人TROP2抗体偶联TLR8激动剂对B-hTLR8小鼠肿瘤生长的控制有效，表明B-hTLR8小鼠模型是临床前体内研究中评估抗体偶联TLR8激动剂的理想模型。TLR8靶向药物在B-hTLR8胶原诱导的关节炎模型中的体内疗效。96只动物按体重随机分为2组，A组8只，B组88只。第0天，A组皮下注射PBS；B组动物注射CⅡ型乳剂。当B组动物的平均临床评分大于0时，再次分组，将这些动物分为5组，每组8只，分别标记为G2~G6。G1组为为非CIA对照组。G2为载体组（模型组），G3为80mg/kg阳性对照药物组，G4为低剂量TLR8靶向药物组，G5为中剂量TLR8靶向药物，G6为高剂量TLR8靶向药物。(A) 重量变化。与第0天相比，每天动物体重变化的百分比；(B) 给药后第21天的动物临床评分。作为供试品组，观察到G3-G6的平均得分低于载体治疗组（G2）。特别是G3和G6与G2表现出显著差异；(C) H&E染色病理统计评分。镜下G1组未见病变。G2组观察到不同程度的皮下混合性炎症细胞浸润、关节滑膜炎和/或滑膜形成、踝关节和/或指关节软骨和骨组织破坏。G6组显示TLR8靶向药物高剂量对关节炎动物模型相关病变有一定改善作用。表2. TLRs靶点人源化小鼠列表本期分享到此结束，如果您对相关小鼠模型有需求，欢迎随时与我们联系。快点击“阅读原文”获取更多模型信息吧。数据多多，欢迎分享~参考文献[1]Taro Kawai, Shizuo Akira. TLR signaling .Cell Death and Differentiation (2006) 13, 816–825[2]Martínez-Espinoza, Iván, and Antonieta Guerrero-Plata. “The Relevance of TLR8 in Viral Infections.”Pathogens (Basel, Switzerland) vol. 11,2 134. 22 Jan. 2022[3]Wang, J. et al. The Functional Effects of Physical Interactions among Toll-like Receptors 7, 8, and 9. Journal of Biological Chemistry 281, 37427-37434 (2006).[4]Dowling, D.J. Recent Advances in the Discovery and Delivery of TLR7/8 Agonists as Vaccine Adjuvants.  (2018).

哮喘是一种异质的、高度复杂的呼吸道慢性炎症性疾病，可引起患者咳嗽、喘息、呼吸急促和胸闷等症状，严重时可危机生命。哮喘通常是由各种上皮损伤，如病毒、过敏原、细菌、空气污染物和其他环境刺激物引起的。不同国家哮喘患病率差异较大，有的国家低至1%，有的则高达18%，全世界的哮喘患者约有3.39亿人。哮喘有明显的性别差异，不同年龄男女性的患病率和严重程度不同，据调查，13岁以下的男孩哮喘发病率较高，但成年后，女性的发病率增加，高于男性(图1)。性激素、遗传和表观遗传变异、社会和环境因素以及对哮喘治疗的反应是影响哮喘发病率、流行率和严重程度的重要因素。图1. 发达国家哮喘终生患病率百分比。[1]哮喘的症状主要是由于气道炎症导致的，炎症引起的过程包括粘液产生、气道壁重塑和支气管高反应性。气道壁重塑和气道粘液堵塞导致的持续性气道阻塞是目前临床治疗哮喘未满足的迫切医疗需求之一。哮喘通常在幼年发病(早发型哮喘)，但也有些在成年发病(晚发型哮喘)。晚发型哮喘比早发型哮喘更严重，但与过敏的关系更小。过敏性哮喘往往始于幼年时期，与辅助T细胞2 (Th2)反应有关。当接触过敏原后，过敏原特异性Th2细胞产生2型细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-9、IL-13)，导致气道壁上大量嗜酸性粒细胞积累，粘液分泌增多，过敏原特异性B细胞合成免疫球蛋白E (IgE)增加。而晚发型哮喘分Th2型和非Th2型，非Th2型通常与肥胖、衰老和吸烟有关，Th2型常伴有复发性和慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)，并对阿司匹林敏感，可能与气道嗜酸性粒细胞数量增多有关。图2. 哮喘发病中驱动气道炎症的机制。与哮喘发病相关的2型(绿色)和非2型(黄色)适应性免疫反应。图中显示了2型反应的激活和分化导致IL-4、IL-5、IL-9和IL-13产生增加，以及嗜酸性粒细胞浸润增加，B细胞产生IgE、AHR、FENO和粘液产生增加。非2型炎症在成人比哮喘儿童更常见。非2型炎症导致T细胞产生的IL-17A或IFN-γ增加，或IL-6、TNF和IL-1增加导致中性粒细胞浸润、AHR、FENO和粘液产生增加。[1]随着研究的深入，哮喘表型的分类已发展成哮喘内型，主要是基于哮喘患者痰液中的炎性细胞类型，分为2-高型或-超高型(嗜酸性粒细胞)和2-低型(非嗜酸性粒细胞，中性粒细胞)。2-高内型是由Th2相关的细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13调控的，超2型高哮喘则反映了更严重的疾病形式。2-低内型更加复杂，目前尚未发现生物标志物。2-低型哮喘一般包括所有没有2-高型炎症的哮喘患者。[2, 3]靶点药物进展哮喘发病机制复杂，众多细胞因子（TSLP, IL4, IL5, IL13, IL-33等）参与其中，阻断某一个细胞因子治疗哮喘只能达到部分效果，药物联合使用将是治疗该病的发展趋势。根据科睿唯安数据库检索哮喘有3万+的药物发现数据结果，范围缩小到抗体类药物，也有73个上市/处在临床阶段的药物，其中上市药物15个，III期9个，II期29个，部分数据展示如下。阿斯利康已有多个药物上市，覆盖靶点广，占据明显的主导地位。今年2月，Tezspire (tezepelumab)还在美国获批用于12岁及以上严重哮喘患者的一次性预充型自我给药。Tezspire 是第一个也是唯一一个被批准用于治疗严重哮喘患者的生物制剂，在其批准的标签内没有表型或生物标志物的限制。面对如此多哮喘相关靶点药物研究现状，谁会是下一个闪光者，值得期待！表1. 部分研究进展数据整理自科睿唯安数据库BioMice百奥动物利用基因编辑技术自主开发了一系列哮喘相关靶点人源化小鼠，同时基于靶点人源化小鼠和野生型小鼠构建了哮喘模型可用于药效评估，助力该疾病药物的临床前研究。表2. 哮喘相关靶点人源化小鼠表3. 药理药效服务内容NEW PRODUCT模型示例：B-hTSLP/hTSLPR mice plus胸腺基质淋巴细胞生成素（Thymic stromal lymphopoietin, TSLP）是一种上皮细胞来源的I型细胞因子，属于IL-27细胞因子家族。主要在活化的肺和肠上皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞中表达。TSLPR又称为细胞因子受体样因子2（CRLF2），是TSLP的受体，属于血细胞生成素家族。TSLPR主要在树突细胞和单核细胞中表达。当过敏原、烟雾、病毒、细菌和真菌等诱因刺激肺和肠道上皮细胞和角质形成细胞释放TSLP（正电荷），结合TSLPR（负电荷）形成TSLPR:TSLP二元复合物，与IL-7Rα结合形成三元复合物TSLPR-TSLP-IL-7Rα，磷酸化JAK和STAT5启动促炎信号（图3）。图3. TSLP及其信号复合体信号启动示意图。[4]有证据表明，TSLP是哮喘病理生理学的关键因子，其对各种适应性和先天性免疫细胞和结构细胞的作用，可驱动嗜酸性炎症(过敏性和非过敏性)、非嗜酸性炎症和气道的结构变化。阻断TSLP的临床试验对哮喘患者产生了积极的治疗结果，减少了急性发作和炎症，同时改善了肺功能。[5]利用B-hTSLP/hTSLPR mice plus 构建哮喘小鼠模型抗人TSLP抗体在哮喘小鼠模型中的体内药效流式细胞术分析BALF中的免疫细胞。雄性B-hTSLP/hTSLPR plus小鼠用OVA免疫诱导建立小鼠哮喘模型(n=6)。在致敏阶段给予抗人TSLP抗体(Tezepelumab，内部合成)。实验结束后收集BALF，检测肺组织浸润炎性细胞。结果显示，嗜酸性粒细胞在OVA诱导但未处理组(G2)的比例显著高于非诱导组(G1)，而处理组(G3)与G2组相比，嗜酸性粒细胞比例显著降低。G3组CD45+细胞和嗜酸性粒细胞数量也有下降趋势。结果表明，抗人TSLP抗体能有效降低经OVA诱导的B-hTSLP/hTSLPR plus小鼠嗜酸性粒细胞的数量和比例。哮喘小鼠模型血清中OVA特异性IgE的产生水平。在实验终点收集血清，分析OVA特异性抗体反应的IgE水平。结果显示，接受tezepelumab治疗的小鼠体内IgE水平低于未接受治疗的小鼠。哮喘小鼠模型H&E染色。在实验终点收集肺组织，H&E染色结果显示接受PBS气雾剂的B-hTSLP/hTSLPR plus小鼠肺组织无任何炎症反应。接受OVA的B-hTSLP/hTSLPR plus小鼠支气管周和血管周炎症显著增加。在给予tezepelumab治疗的小鼠中观察到嗜酸性粒细胞浸润显著减少。黑色箭头：炎症细胞；黑色三角形：嗜酸性粒细胞。更多小鼠实验数据信息欢迎联系我们。参考文献[1]. https://doi.org/10.1183/16000617.0067-2021[2]. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.016[3]. doi: 10.1111/all.14027[4]. doi: 10.3389/fimmu.2018.01595[5]. doi: 10.1080/14728222.2020.1783242

尽管调节T细胞（Treg）对维持机体免疫耐受避免自身免疫疾病很重要，但它们也抑制了肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的抗肿瘤免疫反应。TME中Treg细胞数量增加、Teff/Treg比例降低与许多癌症的不良预后相关。因此，Treg清除、控制Treg细胞活性与浸润是有潜力的肿瘤免疫疗法。图. Treg靶向的抗肿瘤疗法[1]1去除瘤内Treg细胞a)    通过靶向IL-2受体CD25 (IL-2RA)来实现Treg清除，如Dadizumab治疗脑胶质瘤。但这种疗法的治疗窗口较小。因为CD25既是Treg也是Teff细胞活化后上调的分子。靶向CD25的Treg清除也会伴随Teff的清除。罗氏正在开发新型IL-2非阻断CD25抗体（RG6292），在不影响Teff细胞上的IL-2信号的前提下特异性清除Treg。b)    通过靶向CTLA-4来实现Treg清除。BMS正在开发第二代CTLA-4抑制剂BMS-986218，对Yervoy进行Fc改造以增强ADCC作用清除Treg。c)    靶向TME中Treg的其他表面标志物：ICOS、OX40、GITR、LAG-3、CCR4（mogamulizumab，去岩藻糖的CCR4单抗，通过增强ADCC作用清除Treg）、CCR8、TNFR2。d)    通过鉴定TME Treg marker来实现特异性TME中Treg的清除，而不影响其他正常组织中的Treg。如普米斯生物的双抗CCR8 x CTLA-4。2阻止Treg细胞浸润Treg在趋化因子的作用下迁移至TME，如CCL28-CCR10，CCL1-CCR8，CCL22-CCR4（mogamulizumab）的相互作用。通过中和抗体封闭分泌型CCL1或CCL22；阻断CCR4和CCR8可有效阻止Treg细胞迁移。3使瘤内Treg对免疫检查点阻断剂敏感免疫检查点抑制剂PD-(L)1疗法总体上只能使约20%的病人获得较好的响应，原因之一便是TME内存在异常活化的Treg细胞。由于Treg表达抑制型受体TIGIT、LAG3、CTLA-4、PD-1、TIM-3等，使得Treg具有高度免疫抑制活性。通过抑制型受体的联合阻断[2]可有效降低Treg的免疫抑制能力。4靶向T细胞的共刺激信号a)    GITR激活可促进Teff功能、抑制Treg功能；GITR激动剂DTA-1可使瘤内Treg减少50%以上。b)    OX40与配体结合后可增加Teff和记忆T细胞的存活和扩增，同时降低Treg的免疫抑制活性；OX40激活剂OX86在B16F10小鼠黑色素瘤模型中可诱导TME中Treg深度耗竭并增加CD8+ Teff细胞的浸润。c)    ICOS拮抗剂MEDI-570、激动剂JTX-2011（vopratelimab）可在不影响外周Treg频率的情况下降低小鼠瘤内Treg的频率。5靶向Treg分泌的抑制型细胞因子a)   抑制TGF-b：直接结合成熟的TGFb：M7824；作用于GARP：DS1055a去岩藻糖的GARP抗体，可消耗TME中的Treg；作用于整合素αVβ8b)    抑制IL-10c)    IL-35拮抗剂6改变Treg脆性NRP-1的缺失和IFNg的表达可破坏Treg细胞的免疫抑制功能。NRP1+ Treg在多种人类癌症中富集。NRP-1拮抗剂Fc（AAG）-TPP11可选择性抑制TME中NRP1+ Treg的功能和稳定性，而不影响外周Treg[3]。7靶向Treg代谢a)    Teff依赖糖酵解，而瘤内低糖、缺氧、酸性环境抑制Teff的功能。但TME内Treg利用乳酸替代途径来维持其抑制功能。二甲双胍可对Treg代谢重编程至糖酵解，从而减弱Treg的免疫抑制功能。b)    癌细胞加速的糖酵解消耗TME中的葡萄糖并增加乳酸和脂肪酸含量。脂肪酸代谢也促进Treg细胞发育。抑制脂质合成和代谢信号的SREBP可释放TME中的Treg抑制[4]。c)    TME内的IDO和腺苷可促进Treg增殖和抑制功能。IDO抑制剂、CD39/CD73/A2AR抑制剂可抑制Treg活性。为了更好的研究、开发Treg疗法，百奥动物开发了一系列Treg靶点人源化小鼠，助力相关药物的临床前药效评估。B-hCTLA4/hCCR8 mice 品系名称：C57BL/6-Ctla4tm1(CTLA4) Ccr8tm1(CCR8) /Bcgen通用名：B-hCTLA4/hCCR8 mice背景：C57BL/6货号：112251hCTLA-4蛋白的瘤内T细胞表达分析hCTLA-4的流式表达分析。小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植至纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠（雌性，7周龄，n=3）。当肿瘤生长至400-700 mm3时对其进行流式检测。人CTLA-4仅在纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠的T细胞中检测出来。hCCR8蛋白的瘤内T细胞表达分析CCR8的流式表达分析。小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植至纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠（雌性，7周龄，n=3）。当肿瘤生长至400-700 mm3时对其进行流式检测。人CCR8仅在纯合B-hCTLA4/hCCR8小鼠的T细胞中检测出来。B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2 mice 品系名称：C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)Cd274tm1(CD274)Tnfrsf1btm1(TNFRSF1B)/Bcgen通用名：B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2 mice背景：C57BL/6货号：130849抗人PD-1抗体和抗人TNFR2抗体联合治疗抗人PD-1和抗人TNFR2抗体联用可抑制B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠中hPD-L1 MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌hPD-L1 MC38细胞皮下移植至纯合B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠（雌性，6-7周龄，n=5）。当肿瘤体积达到约100 mm3时对小鼠进行分组给药。帕博丽珠单抗（PD-1抗体）和抗人TNFR2抗体的给药剂量和频次如图所示。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。所有抗体均为自制。可以看出，两药联用比单药均有更强的肿瘤抑制作用，证明B-hPD-1/hPD-L1/hTNFR2小鼠是验证hPD-1抗体和hTNFR2抗体体内药效的有力临床前模型。B-hIL2RA mice品系名称：C57BL/6-Cd25tm1(CD25)/Bcgen通用名：B-hIL2RA mice背景：C57BL/6货号：110066抗人IL-2RA抗体体内药效抗人IL-2RA抗体可抑制B-hIL2RA小鼠中MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植至纯合B-hIL2RA小鼠（雌性，6-7周龄，n=8）。抗人IL-2RA抗体（211At-7G7/B6 和 M-A251）的给药剂量和频次如图所示。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。可以看出，B-hIL2RA小鼠是验证hIL-2RA抗体体内药效的有力临床前模型。B-hGARP mice品系名称：C57BL/6-Lrrc32tm1(LRRC32)/Bcgen通用名：B-hGARP mice背景：C57BL/6货号：110102抗鼠PD-1抗体和抗人GARP/latent-TGFb1抗体联合治疗抗鼠PD-1抗体和抗人GARP/latent-TGFb1抗体联用可抑制B-hGARP小鼠中MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌MC38细胞（5x105）皮下移植至纯合B-hGARP小鼠（雌性，7周龄，n=6）。当肿瘤体积达到50-70 mm3时对小鼠进行分组给药。抗鼠PD-1抗体和抗人GARP/latent-TGFb1抗体（自制）的给药剂量和频次如图所示。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。可以看出，两药联用比单药均有更强的肿瘤抑制作用，证明B-hGARP小鼠是验证hGARP抗体体内药效的有力临床前模型。B-hPD-1/hCD39 mice品系名称：C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)Entpd1tm3(ENTPD1)/Bcgen通用名：B-hPD-1/hCD39 mice背景：C57BL/6货号：121179抗人CD39抗体和抗人PD-1抗体联合治疗抗人CD39和抗人PD-1抗体联用可抑制B-hPD-1/hCD39小鼠中MC38肿瘤的生长。小鼠结肠癌B-hPD-L1 MC38细胞（5x105）皮下移植至纯合B-hPD-1/hCD39小鼠（雌性，7-8周龄，n=6）。当肿瘤体积达到100-150 mm3时对小鼠进行分组给药-帕博丽珠单抗（PD-1抗体）和抗人CD39抗体（SRF367A）。（A）肿瘤体积变化；（B）体重变化。数值为平均数± SEM。所有抗体均为自制。可以看出，两药联用比单药均有更强的肿瘤抑制作用，证明B-hPD-1/hCD39小鼠是验证hCD39抗体和hPD-1抗体体内药效的有力临床前模型。部分Treg靶点相关品系参考文献1.     Shan, Feng et al. “Therapeutic targeting of regulatory T cells in cancer.” Trends in cancer vol. 8,11 (2022): 944-961. doi:10.1016/j.trecan.2022.06.0082.     Tawbi, Hussein A et al. “Relatlimab and Nivolumab versus Nivolumab in Untreated Advanced Melanoma.” The New England journal of medicine vol. 386,1 (2022): 24-34. doi:10.1056/NEJMoa21099703.     Jung, Keunok et al. “A Neuropilin-1 Antagonist Exerts Antitumor Immunity by Inhibiting the Suppressive Function of Intratumoral Regulatory T Cells.” Cancer immunology research vol. 8,1 (2020): 46-56. doi:10.1158/2326-6066.CIR-19-01434.   Lim, Seon Ah et al. “Lipid signalling enforces functional specialization of Treg cells in tumours.” Nature vol. 591,7849 (2021): 306-311. doi:10.1038/s41586-021-03235-6

2022年3月8日，国家药品监督管理局（NMPA）正式批准依马利尤单抗（Emapalumab）注射液（商品名：伽蜜芬）在国内上市，适用于难治性、复发性或进展性、或对常规疗法不耐受的原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）成人和儿童（新生儿及以上）患者，开启了HLH靶向治疗的新篇章。01噬血细胞综合征噬血细胞综合征（HPS）又称噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH），是一种遗传性或获得性免疫调节功能异常导致的严重炎症反应综合征，由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞异常激活、增殖和分泌大量炎性细胞因子引起，以发热、血细胞减少、肝脾肿大及肝、脾、淋巴结和骨髓组织发现噬血现象为主要临床特征[1]。目前广泛应用的标准诱导治疗方案是HLH-1994或HLH-2004方案，主流还是力推HLH-94方案。HLH-94方案有三个关键药物，地塞米松、VP-16、环孢菌素A，联合使用丙种球蛋白可能有一定的加强效果。遗憾的是，现有的诱导缓解治疗方案并不能充分满足原发性HLH患者的治疗需求，当前HLH治疗仍面临困局，那么破局之道在何方？随着对HLH发病机制的进一步挖掘，全新的HLH治疗靶点——IFN-γ浮出了水面。02IFN-γ及其诱导的HLH发病机制干扰素(IFNs)是具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节特性的多效细胞因子，是免疫反应的中心协调因子。IFN-γ最初是基于其体外抗病毒活性被鉴定出来的。它的受体由两个亚基组成，IFNGR1和IFNGR2。IFNGR1的主要功能是与配体结合，，而IFNGR2通过Janus激酶（JAKs）以及信号转导子和转录激活子（STATs）在信号转导中起主要作用，但在这一过程中，两个受体亚基都是必需的。有趣的是，只有IFNGR1有STAT1的核定位信号。图1: IFNGR的结构和IFN-γ诱导的信号通路[2]IFN-γ在调节先天和适应性免疫反应中发挥着重要作用。在炎症环境中，IFN-γ触发免疫反应的激活，并刺激病原体的消除；它还可以防止免疫系统的过度激活和组织损伤。在肿瘤微环境(TME)中，IFN-γ通过调节T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞（APCs）、肿瘤细胞、血管和淋巴系统来维持促肿瘤和抗肿瘤免疫的平衡[2]。图2: 肿瘤微环境中的IFN-γ应答者HLH的发病机制尚未被完全阐明，但学界目前认为，细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞（NK）的功能受损，是原发性HLH的主要病因。在正常情况下，细胞毒性T细胞和NK细胞通过免疫接触方式，向被病毒感染的靶细胞或癌细胞释放细胞毒性颗粒，颗粒中包含的穿孔素在靶细胞表面造成孔隙，使细胞毒性颗粒内容物（颗粒酶和其他蛋白酶）进入靶细胞内，诱导靶细胞的凋亡。但在HLH患者体内，由于基因突变、免疫缺陷、感染、恶性肿瘤或风湿性疾病等触发因素的影响，细胞毒性颗粒释放受阻，导致细胞毒作用功能受损，出现抗原清除障碍，T细胞与靶细胞结合后，会持续产生IFN-γ等大量促炎性细胞因子，从而持续刺激巨噬细胞和组织细胞过度活化，进一步释放更多的炎性细胞因子，诱发持续性、失控的高炎症反应，即为细胞因子风暴，导致急性全身性炎症反应甚至继发性器官功能障碍（如肝、肾、肺功能障碍），进而引起多器官功能衰竭，最终导致患者死亡[3-4]。图3：HLH发病机制示意图[3]（A：正常的免疫清除功能；B：HLH发病时异常的免疫清除功能）而在HLH的发生发展，尤其是细胞因子风暴的发生过程中，IFN-γ起到了关键作用。有研究显示，HLH患者体内的IFN-γ水平明显升高，且IFN-γ的过度生成与HLH的血液学特征表现有关。针对IFN-γ这个“风暴眼”信号通路，百奥动物自主开发了4个IFN-γ及其受体基因人源化的小鼠模型，包括：B-hIFNGR1 mice、B-hIFNGR2 mice、B-hIFNGR1/hIFNG mice、B-hIFNGR1/hIFNG/hIFNGR2 mice，助力HLH领域创新药物的临床前研究。03B-hIFNGR1 mice验证数据mRNA和蛋白表达分析通过RT-PCR和流式细胞术分析B-hIFNGR1小鼠中IFNGR1的表达。(A)mRNA的表达检测。人IFNGR1的mRNA仅在纯合B-hIFNGR1小鼠的脾细胞中检测到。(B)从野生型小鼠和B-hIFNGR1小鼠中收集腹腔冲洗液来源的巨噬细胞，用种属特异性抗IFNGR1抗体进行流式细胞术分析。人IFNGR1在B-hIFNGR1小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中检测不到。04B-hIFNGR2 mice验证数据mRNA和蛋白表达分析利用RT-PCR和western blot的方法分析野生鼠和纯合B-hIFNGR2小鼠中IFNGR2的mRNA和蛋白的表达。(A) mRNA的表达检测。小鼠Ifngr2 的mRNA仅在野生鼠(+/+)的小肠中检测到。人IFNGR2的mRNA仅在纯合B-hIFNGR2小鼠(H/H)中检测到。(B)蛋白的表达检测。收集野生鼠和纯合B-hIFNGR2小鼠的骨骼肌，用同时结合人和小鼠IFNGR2的抗体进行western blotting分析。结果表明，在纯合B-hIFNGR2小鼠中可以检测到IFNGR2蛋白的表达。05B-hIFNGR1/hIFNG mice验证数据蛋白表达分析B-hIFNGR1/IFNG小鼠IFNG和IFNGR1的表达分析。(A) IFNG表达分析。用抗CD3ε抗体刺激野生型小鼠(+/+)和纯合B-hIFNGR1/hIFNG小鼠(H/H,H/H) 2 h后采集血清，使用ELISA检测IFNG的表达。小鼠IFNG仅在野生鼠中检测到，人IFNG仅在纯合B-hIFNGR1/hIFNG小鼠中检测到。(B) IFNGR1表达分析。采集野生型小鼠和纯合B-hIFNGR1/hIFNG小鼠腹腔冲洗液来源的巨噬细胞，用抗IFNGR1抗体进行流式细胞术分析。人IFNGR1在B-hIFNGR1/hIFNG小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中检测不到。06IFN-γ信号通路相关人源化小鼠模型参考资料：[1] 中国医师协会血液科医师分会, 中华医学会儿科学分会血液学组, 噬血细胞综合征中国专家联盟. 中国噬血细胞综合征诊断与治疗指南（2022年版）[J]. 中华医学杂志, 2022, 102(20): 1492-1499.[2] Gocher AM, Workman CJ, Vignali DAA. Interferon-gamma: teammate or opponent in the tumour microenvironment? Nat Rev Immunol 2022; 22(3):158-172.[3] 张垚, 汤勇民. 儿童噬血综合征的研究进展[J]. 中国小儿血液与肿瘤杂志. 2020; 02: 112-117.[4] Fajgenbaum DC, June CH. Cytokine storm[J]. N Engl J Med. 2020 Dec 3;383(23):2255-2273.

特应性皮炎（atopic dermatitis，简称AD，也被称作eczema）是一种慢性炎症皮肤病，常常始发于儿童时期，但任何年龄段都可能发病。AD的发病原因尚不完全清楚，主要包括遗传因素、过度活跃的免疫系统、皮肤屏障破损、环境刺激（如肥皂、洗涤剂、尘螨等）、情绪压力、感染等。Atopic指“对过敏原敏感”。目前的治疗手段主要包括1） 抗炎抗痒的类固醇类药物：可的松等；2）免疫抑制剂：钙调磷酸酶抑制剂他克莫司，甲氨蝶呤等；3） 抗组胺类药物：Loratadine等；4） 生物药：Dupilumab抗体（IL-4和IL-13抑制剂）等。II型炎性细胞因子介导的炎症反应在AD的发生发展中扮演重要角色。越来越多的AD新药研发聚焦在这些信号通路上（图1）。图1. AD病理及其获批生物药的靶点[1]IL-31主要由Th2细胞和先天免疫细胞分泌。IL-31受体由IL-31RA和OSMRb组成，表达于周围感觉神经、皮肤角质细胞和免疫细胞。相应的，IL-31R与IL-31相互作用，会导致瘙痒、皮肤屏障受损和炎症，以及其他炎性因子的分泌。 TSLP (thymic stromal lymphopoietin) 最早从小鼠胸腺基质细胞系中发现，主要表达于活化的肺和肠表皮细胞，也被成为“警报素”（alarmin）。其受体为由TSLPR和IL-7Ra组成的异源二聚体。TSLP可诱导II类免疫反应，也可直接作用于感觉神经元引起瘙痒。IL-33是另一种警报素，与TSLP一起加强II类炎症反应。 IL-22由活化的T细胞，主要是Th22和Th17细胞表达。其受体由IL-22R1（也被称为IL-22RA1）和IL-10RB组成。与IL-22中和抗体相比，IL-22R1的阻断抗体可能是更好的治疗方法。IL-22R1只表达在少部分细胞上，不表达在免疫细胞上，从而可避免系统性的免疫激活或抑制。同时，阻断IL-22R1同样阻止了与IL-22类似的IL-20和IL-24效应，它们与IL-22共表达，都通过IL-22R1来传导下游信号。图2. IL-22配受体结构[2]Th2细胞因子（如IL-4, IL-13）会活化B细胞分泌IgE抗体，同时，皮肤损伤增加了免疫系统暴露于环境过敏原的机会。循环中IgE水平与AD紧密相关。IgE受体由结合配体的α链、含有ITAM结构域进行信号传导的γ链、以及稳定受体的β链组成。图3. 抗原结合的IgE引发FcεRI受体偶联[3]靶向AD相关细胞因子及其免疫通路的生物药主要有数据整理自Cortellis数据库百奥动物自主研发了一系列AD相关细胞因子及其信号通路的靶点人源化小鼠，助力特异性皮炎药物的临床前开发。B-hIL31/hIL31RA/hOSMR mice 图4. 种属特异性IL-31, IL-31RA和OSMR基因表达。鼠IL-31的mRNA在野生型小鼠中被检测到；而人IL-31的mRNA仅在纯合B-hIL31 mice中被检测到。鼠IL-31RA的mRNA在野生型小鼠中被检测到；而人IL-31RA的mRNA仅在纯合B-hIL31RA mice中被检测到。鼠OSMR的mRNA在野生型小鼠中被检测到；而人OSMR的mRNA仅在纯合B-OSMR mice中被检测到。OSMR蛋白在纯合B-OSMR mice中被检测到。图5. 人IL-31引发B-hIL31/hIL31RA/hOSMR mice瘙痒。对纯合B-hIL31/hIL31RA/hOSMR mice (雌性，n=3)在第0、3、7、10天用hIL-31刺激，并记录每次打入hIL-31后3小时内的抓挠次数。hIL-31成功引发B-hIL31/hIL31RA/hOSMR mice瘙痒。靶向IL-31的抗体药物处理显著缓解了瘙痒。B-hTSLP/hTSLPR/hIL7R mice 图6. 脾脏中种属特异性TSLPR表达分析。对于cDC, pDC和非DC细胞亚群，mTSLPR蛋白只在野生型小鼠和B-hIL7R小鼠中检测到；hTSLPR蛋白仅在B-hTSPLP/hTSLPR小鼠和B-hTSLP/hTSLPR/hIL7R mice中检测到。骨髓中TSLPR表达也有相同的种属特异性。图7. 脾脏中种属特异性IL7R表达分析。mIL7R蛋白只在野生型小鼠和B-hTSPLP/hTSLPR小鼠中的非DC细胞中检测到；hIL7R蛋白仅在B-hIL7R小鼠和B-hTSLP/hTSLPR/hIL7R mice的非DC细胞中中检测到。骨髓中IL7R表达也有相同的种属特异性，且在pDC和非DC细胞中都可以检测到。 图8. 小鼠的TARC（CCL17）可被相应种属的TSLP诱导表达。用FLT3L诱导骨髓产生DC细胞，并用人或鼠的TSLP进行体外刺激。DC细胞分泌的TARC浓度由ELISA来测量。mTARC仅可被hTSLP在纯合B-hTSLP/hTSLPR mice和B-hTSLP/hTSLPR/hIL7R mice中诱导，且后者表达量更高；mTARC仅可被mTSLP在野生型和B-hIL7R mice中诱导，且前者表达量更高。B-hIL33/hTSLP/hTSLPR mice图9. 种属特异性IL-33和TSLP的表达。卡泊三醇涂抹于小鼠耳部7天，用ELISA分析耳朵IL-33和TSLP的表达。mTSLP和mIL-33在野生型C57BL/6小鼠中表达，而hTSLP和hIL-33仅在纯合B-hIL33/hTSLP/hTSLPR mice中表达。B-hIL10RB mice图10. 种属特异性IL-10RB基因表达。鼠IL-10RB的mRNA在野生型小鼠中被检测到；而人IL-10RB的mRNA仅在纯合B-hIL10RB mice中被检测到。图11. 种属特异性IL-10RB的表达。收集脾脏和血液中的单核细胞，并用流式细胞仪检测IL-10RB的表达。mIL-10RB在野生型小鼠中检出，hIL-10RB仅在纯合B-hIL10RB mice小鼠中表达。B-hIgE/hFCER1A mice图12. 种属特异性IgE的表达。体内用LPS刺激后收集骨髓中的嗜碱性粒细胞，用流式细胞仪分析种属特异性IgE抗体。mIgE只在野生型小鼠中表达，而hIgE仅在纯合B-hIgE/hFCER1A mice中表达。图13. 种属特异性FCER1A的表达。收集骨髓中的嗜碱性粒细胞，用流式细胞仪分析种属特异性FCER1A表达。mFCER1A只在野生型小鼠中表达，而hFCER1A仅在纯合B-hIgE/hFCER1A mice中表达。AD相关人源化小鼠列表P.S. 特异性皮炎与银屑病同属炎症性皮肤病，那它们有什么区别呢？从症状上，特异性皮炎伴有强烈的瘙痒，且易发于手肘、膝盖的内侧，表现为皮肤渗漏结痂；而银屑病没有那么痒，多出现在外侧，表现为鳞状皮肤。从疾病机制上来说，特异性皮炎与Th2及其产生的细胞因子强相关；而银屑病主要由Th17细胞及其产生的IL-17驱动。由于特异性皮炎没有IL-17协助产生抗菌蛋白，其更容易产生皮肤感染。此外，AD病人常伴有高血清水平IgE，但银屑病病人没有。参考资料1. Ratchataswan, Thanaporn et al. “Biologics for Treatment of Atopic Dermatitis: Current Status and Future Prospect.” The journal of allergy and clinical immunology. In practice vol. 9,3 (2021): 1053-1065. doi:10.1016/j.jaip.2020.11.0342. Sabat, R., Ouyang, W. & Wolk, K. Therapeutic opportunities of the IL-22–IL-22R1 system. Nat Rev Drug Discov 13, 21–38 (2014). https://doi.org/10.1038/nrd41763. Pullen, Nicholas A et al. “The Fyn-STAT5 Pathway: A New Frontier in IgE- and IgG-Mediated Mast Cell Signaling.” Frontiers in immunology vol. 3 117. 11 May. 2012, doi:10.3389/fimmu.2012.00117

“瘙痒是一种能引起强烈搔抓渴望的不快的感觉。“关于瘙痒的定义是300多年前由德国医生塞缪尔·哈芬莱弗(Samuel Hafenreffer)第一次提出的，一直沿用至今。许多炎症性疾病，如特应性皮炎、过敏性鼻炎、支气管哮喘等常常伴随强烈瘙痒。N细胞因子细胞因子是免疫反应中的重要因子；近几年的单细胞测序分析表明，痒觉响应的初级感觉神经元中也有许多亚群表达各类细胞因子受体。近20年来神经免疫领域的研究也证实，细胞因子及其受体是触发慢性痒的重要因素之一。神经元瘙痒受体的激活和下游信号传导[1]白介素-31(interleukin-31,IL-31)与特应性皮炎和瘙痒有关，主要由TH2型T细胞产生。IL-31受体由IL-31RA和OSMRb组成，表达于周围感觉神经、皮肤角质细胞和免疫细胞。相应的，IL-31R与IL-31相互作用，会导致瘙痒、皮肤屏障受损和炎症，以及其他炎性因子的分泌。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)，是一种与IL-7互为远距离旁系同源的，归属于短链四α螺旋束Ⅰ型IL-2家族的多效性细胞因子。研究表明 TSLP可以通过 TRPA1 阳性神经元上的 TSLP 受体直接促进瘙痒，反过来，抓挠会诱导表皮角质细胞进一步表达 TSLP，持续性搔抓行为则会加重痒的感觉，形成“越抓越痒、越痒越抓”的恶性循环（the vicious itch-scratch cycle）。白细胞介素4 (interleukin-4, IL4)主要由T细胞、自然杀伤T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞产生。受体在多种痒觉相关伤害感受神经元中均有表达，且与氯喹、组胺、TSLP反应性神经元重合。当IL4受体被激活，JAK(Janus kinase)信号通路与TRPV1和TRPA1共同作用，引起神经元内钙离子浓度升高，诱发瘙痒行为。为了更好的研究和开发瘙痒相关疾病疗法，百奥动物开发了一系列瘙痒相关靶点人源化小鼠，助力相关药物的临床前药效评估。B-hIL31/hIL31RA/hOSMR micehIL31诱导B-hIL31/hIL31RA/hOSMR小鼠瘙痒及IL-31抗体药效在第0、3、7、10天分别给与纯合B-hIL31/hIL31RA/hOSMR小鼠(雌性，n=3)注射hIL-31，并记录hIL-31注射后3h小鼠的抓痕计数。以注射hIL-31前记录抓痕计数作为基线。如图所示，hIL-31在纯合B-hIL31/hIL31RA/hOSMR小鼠中成功诱导瘙痒。一种靶向IL-31信号的抗体作为阳性对照，在我们的模型中显示出显著的止痒效果(经客户验证)。B-hTSLP/hTSLPR miceOxazolone诱导特应性皮炎样皮损抗人TSLP抗体对Oxazolone诱导特应性皮炎小鼠模型的药效各组小鼠均采用抗hTSLP抗体tezepelumab(内部合成)治疗。(A)各组耳表皮厚度统计分析。第18天开始，耳表皮开始脱皮。因此，从第18天开始，耳表皮厚度逐渐减少，如图所示。(B)治疗期间体重变化。(C)血清总IgE水平。第26天采集血清，ELISA法测定总IgE水平。(n = 8)。B-hTSLP/hTSLPR小鼠特应性皮炎模型耳皮肤H&E染色。(A)H&E染色。(B)耳表皮皮肤厚度。(C)耳表皮皮肤嗜酸性粒细胞浸润评分。(D)耳表皮皮肤总分。与同型对照组相比，地塞米松或tezepelumab（内部合成）治疗组耳厚和耳皮肤嗜酸性粒细胞浸润评分显著降低，表明B-hTSLP/hTSLPR小鼠为体内评价抗人TSLP抗体提供了强有力的临床前模型。B-hIL4/hIL4RA miceOxazolone诱导特应性皮炎样皮损抗人IL4RA抗体对Oxazolone诱导特应性皮炎小鼠模型的药效各组小鼠均使用杜匹单抗（内部合成）治疗。剂量在图例中显示。(A)治疗期间体重变化。(B)各组耳表皮厚度统计分析。第18天开始，耳表皮开始脱皮。因此，从第18天开始，耳部厚度逐渐减小，如图所示。(C)血清总IgE水平。第26天采用ELISA法检测总IgE水平。耳厚和血清总IgE浓度与抗体剂量呈负相关。(n = 5)。B-hIL4/IL4RA小鼠特应性皮炎模型耳皮肤H&E染色。(A)H&E染色。(B)耳表皮皮肤嗜酸性粒细胞浸润评分(n=5)。给药后耳皮肤嗜酸性粒细胞浸润分数显著降低，表明B-hIL4/hIL4RA小鼠为体内评估抗人IL4RA抗体提供了强有力的临床前模型。瘙痒相关人源化小鼠模型参考文献[1] Dong X, Dong X. Peripheral and Central Mechanisms of Itch. Neuron. 2018 May2;98(3):482-494. doi: 10.1016/j.neuron.2018.03.023. PMID: 29723501; PMCID:PMC6022762.

导读1 月 13 日，罗氏制药中国宣布，全球首个获批的靶向 CD79B  ADC注射用维泊妥珠单抗（Polatuzumab Vedotin /优罗华）两项适应症获 NMPA 批准，是自CD20靶向药物（如利妥昔单抗）获批治疗B细胞恶性肿瘤外，20 多年来国内唯一获批用于弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL） 一线治疗的创新靶向药物。这两项适应症分别为：联合利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星和泼尼松适用于治疗既往未经治疗的弥漫性大 B 细胞淋巴瘤成人患者；联合苯达莫司汀和利妥昔单抗用于不适合接受造血干细胞移植的复发或难治性弥漫性大 B 细胞淋巴瘤成人患者。ADC药物近年来已成为一类强大的肿瘤治疗药物，并在血液肿瘤疾病领域取得了突破性的进展。在国内机遇与挑战下，CD79B ADC药物有望为弥漫性大 B 细胞淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤患者的治疗提供更多选择。研究背景B细胞是自身免疫中的主要效应细胞，主要功能为产生抗体、在T细胞协助下生成促炎细胞因子。B细胞受体（B-cell receptors，BCR）位于B细胞膜表面，是一种多蛋白复合物，对B细胞的抗原识别和信号转导至关重要。B细胞信号控制着免疫突触的形成、细胞骨架的重组、形态变化和细胞迁移，影响着抗原亲和力区分和抗原内吞和呈递等诸多关键功能，一旦BCR信号传导发生异常，将可能导致B细胞相关疾病，包括B细胞恶性肿瘤，免疫缺陷和自身免疫性疾病等[1]。图1.  B 细胞受体信号通路[2]抗原结合B细胞受体（BCR）诱导信号复合物的形成，该复合物由CD79A和CD79B胞内端ITAM残基的磷酸化引发。由PI3K途径介导的抗原非依赖性（tonic）BCR信号转导对于成熟B细胞的存活和各类B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）非常重要[2]。CD79是B细胞受体（BCR）的组成部分中参与信号转导的异源二聚体分子，由CD79A（也称为Igα）和CD79B（也称为Igβ）两条肽链组成。CD79A是前B细胞受体（preBCR）的信号组成部分之一。最新研究发现CD79A与中枢神经系统浸润和B细胞前体(BCP)急性淋巴细胞白血病患者的复发有关[3]；CD79B是一种B细胞表面抗原，是BCR的组成部分，CD79B几乎在所有B细胞表面表达，对BCR的表达与转运至胞膜具有重要的作用，在多种B细胞NHL和慢性淋巴细胞白血病B细胞上均有较高表达，具有广泛性杀伤B细胞肿瘤的作用机制。CD79A和CD79B也协同调节成熟B细胞的凋亡；因此，CD79A和CD79B在BCR的内化与提呈中发挥重要功能。同时临床前研究也验证了以CD79B作为结合位点，比靶向CD79A更加高效，因此CD79B成为发挥ADC作用机制理想的治疗靶标，能够通过精巧的内吞作用并转运到富含蛋白酶的溶酶体样区室，从而有效递送载荷药物并引起靶向的细胞毒杀伤[4]。CD79靶点药物在研进展针对CD79B靶点开发的药物有单抗，双特异性抗体和ADC药物。目前全球已披露三款靶向CD79B的免疫治疗药物，第一款于2019年6月获FDA批准上市的Polatuzumab vedotin，是目前唯一获批(FDA、EMA)靶向CD79B的ADC药物，用于治疗复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤；另一款靶向CD79B的ADC药物IIadatuzumab vedotin（DCDS-0780A），同样来自罗氏，用于治疗非霍奇金淋巴瘤。除了两款治疗淋巴瘤的ADC药物，还有一款靶向CD79B的PRV-3279是双特异性抗体（CD32B×CD79B），用于治疗系统性红斑狼疮，处于临床II期。数据来源于科睿唯安随着研究的深入，弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤和系统性红斑狼疮的治疗靶点将不断被发现，CD79A/B可作为人B细胞活化的有效抑制剂靶点来治疗系统性红斑狼疮等自身免疫疾病。针对一系列疾病靶点的研究机理，BioMice百奥动物自主开发了CD79靶点人源化小鼠，可以为该靶点药物的开发提供有效的临床前药效评价工具，助力靶向药物研究。B-hCD79A mice基本信息蛋白表达分析通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCD79A小鼠中CD79A的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCD79A小鼠的脾细胞，并用种属特异性抗CD79A抗体进行流式细胞术分析。结果显示：由于mCD79A抗体人鼠交叉识别，所以鼠CD79A在野生小鼠和纯合B-hCD79A小鼠中可以检测到；B-hCD79B mice基本信息mRNA表达分析用RT-PCR分析纯合B-hCD79B小鼠中CD79B基因的种属特异性表达。mCD79B mRNA的表达仅在野生型小鼠的脾细胞中检测到，而hCD79B mRNA的表达只在纯合B-hCD79B小鼠中检测到，野生型小鼠中检测不到。蛋白表达分析通过流式细胞术检测野生型C57BL/6和纯合B-hCD79B小鼠中CD79B的蛋白表达。收集野生型C57BL/6和纯合B-hCD79B小鼠的脾细胞，并用种属特异性抗CD79B抗体进行流式细胞术分析。结果显示：由于mCD79B抗体人鼠交叉识别，所以鼠CD79B在野生小鼠和纯合B-hCD79B小鼠中可以检测到；参考文献[1] Musette P, Bouaziz J. B Cell Modulation Strategies in Autoimmune Diseases: New Concepts. Front Immunol 2018;13(9):622.[2] Burger J A, Wiestner A. Targeting B cell receptor signalling in cancer: preclinical and clinical advances[J]. Nat Rev Cancer, 2018, 18(3): 148- 167.[3] Lenk L, Carlet M, Vogiatzi F, Spory L, Winterberg D, Cousins A, et al. CD79a promotes CNS-infiltration and leukemia engraftment in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Commun Biol. 2021;4(1):73.[4] Polson AG, et al. Blood. 2007‘110(2):616–623

随着全球人口不断增长与老龄化的加剧，恶性肿瘤已成为威胁人类健康的主要因素，其疾病死亡率一直高居首位。近年来，免疫治疗在抗肿瘤治疗中的作用备受关注，基于免疫治疗的新药开发和标志物探索，成为了当前肿瘤研究的热点，这也对临床前研究中动物模型的建立和使用提出了更高的要求。21世纪以后，人类的生物医学研究主要受限于生物体的复杂性，这使得临床前利用模式动物对抗肿瘤药物的研究评价显得尤为重要。但由于人与小鼠的物种差异和免疫排斥特性，简单的基因改造手段无法在小鼠身上创造出一个和人类免疫系统相似的免疫环境。如小鼠同种异体移植瘤模型、基因工程小鼠、人源性细胞系移植瘤模型、人源性肿瘤组织移植瘤模型等动物模型均缺乏人免疫系统及肿瘤免疫微环境，极大地限制了免疫机制及免疫治疗的转化研究。因此，既可以模拟人肿瘤特征又同时存在“人源化”免疫系统的免疫重建小鼠模型就成为了免疫肿瘤研发中的优质模型。目前应用于临床前的免疫系统人源化小鼠模型主要有三类，一类是将成熟的人外周血单个核细胞（hPBMC）通过腹腔或者尾静脉注入免疫缺陷小鼠体内重建人的免疫系统，即hPBMC型；另一类是将人CD34+造血干细胞（HSC）通过腹腔或者尾静脉注入免疫缺陷小鼠，同样实现了人类免疫系统的重建，即HSC（CD34+）型；还有一类是移植胎儿胸腺和胎肝到经过辐照的重度免疫缺陷小鼠肾包膜下，同时接种人的骨髓造血干细胞进行免疫重建，即BLT模型。本文将重点介绍HSC免疫系统重建的小鼠模型。三种方式免疫重建小鼠[1]HSC具有高度自我更新和多向分化潜能，是各种免疫细胞的共同祖先。HSC的分化依赖于骨髓和胸腺造血微环境，部分分裂增殖以维持数量相对恒定，部分增殖分化成表面标志为CD34+/CD38+的定向干细胞，包括淋巴系祖细胞（CLP）和髓系祖细胞（CMP）。CLP继续分化为T细胞、B细胞和NK细胞。CMP进一步分化为单核-巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、红细胞和血小板。HSC发育为成熟免疫细胞的每一阶段均需多种细胞因子的参与。造血干细胞的发育[2]免疫重建模型构建的第一步是要构建免疫缺陷小鼠模型。我们使用的B-NDG小鼠为百奥赛图自主研发的，缺乏成熟的T、B、NK细胞的重度免疫缺陷小鼠模型，是目前国际公认的免疫缺陷程度高、适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。第二步即是在B-NDG及B-NDG衍生小鼠的基础上移植入人的免疫细胞、造血干细胞等，构建免疫系统重建小鼠，以能够更好的模拟人的免疫系统，进行免疫学研究和免疫药物评价。免疫重建小鼠模型可用于研究肿瘤在肿瘤微环境中的生长情况以及肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。具体可应用于血液疾病、肿瘤免疫、造血和免疫学、人类疾病感染模型，以及免疫抑制剂、双特异性抗体等药物药效评价、ADCC效应功能等的研究。那我们是如何使用B-NDG小鼠建立HSC免疫重建模型，构建后的模型数据又是如何呢？将1.5×105 CD34+ HSC 细胞接种到辐射后的B-NDG免疫缺陷小鼠体内，会使HSC发育成T、B、NK细胞等，从而建立了人的固有免疫系统和淋巴细胞。HSC免疫重建模型相对来说，发生移植物抗宿主病（GvHD）的时间较晚，小鼠的生存期较长。那么拿到HSC（CD34+）型的模式小鼠又能做些什么呢？下面我们来看一组数据，如图所示，在B-NDG小鼠上进行CD34+免疫重建，静脉注射5×105 Raji-Fluc细胞，5天后再给小鼠静脉注射人源PD-1抗体，2天后可见抗体对肿瘤细胞有明显的抑制作用。说明HSC（CD34+）重建的B-NDG小鼠是CDX药效试验的有效模型。此外，我们也可以利用此模型进行双特异性抗体药效评价或者免疫检查点药物和其他药物联用，比如PD-L1抗体与CD47抗体联合用药，这不仅能达到验证人的抗体药效作用，同时由于使用的是人源细胞系或PDX样本，且免疫系统环境高度人源化，实验结果具有更高的可靠性和参考价值。但这种重建方法也存在一些局限性，例如小鼠体内缺乏人的细胞因子，人类干细胞在小鼠体内发育受限等。于是研究人员也尝试通过基因工程敲入人的细胞因子基因来代替小鼠的基因，可以使组织、细胞中人类细胞因子适当表达[3]。huHSC-B-NDG hIL15 miceIL15(interleukin 15)是一种编码白细胞介素家族蛋白的多效细胞因子，在先天性和适应性细胞稳态以及外周免疫功能中发挥重要作用。IL15支持先天淋巴样细胞的发育，通过对IL15转基因小鼠和IL15敲除小鼠的研究表明，IL15在NK细胞、自然杀伤性T细胞（NKT）和记忆性CD8+T细胞的发育中起着至关重要的作用。移植人造血干细胞（HSCs）的小鼠模型表明，人IL15是移植后人NK细胞发育所必需的细胞因子。人NK细胞发育示意图[4]百奥动物开发了B-NDG hIL15小鼠，将人IL15基因的编码序列（CDS）插入小鼠IL15基因的5’UTR后，使小鼠表达人的IL15，但不表达鼠的IL15。该小鼠具有B-NDG小鼠背景，同时表达人IL15，将人HSCs移植到B-NDG hIL15小鼠，不管是成体鼠还是新生鼠，与B-NDG小鼠相比，人NK细胞的重建率都有明显提高。B-NDG hIL15小鼠可以用来研究人NK细胞的发育与功能、评价依赖NK细胞发挥作用特别是具有ADCC功能的抗体药效的有力工具。在B-NDG hIL15小鼠中移植CD34+ HSCs增强人NK细胞的重建（成体鼠）雌性6周龄的B-NDG小鼠（n=17）和B-NDG hIL15小鼠（n=19）分别经1.6Gy照射后，通过尾静脉注射人HSCs (1.5E5)，在不同的时间点取外周血检测各类型人免疫细胞的重建水平。结果显示：与B-NDG小鼠相比，B-NDG hIL15小鼠中重建的人NK细胞比例显著性增高，从重建2周到14周都能比较稳定地维持较高比例。利用人HSCs重建人免疫系统的B-NDG hIL15小鼠肿瘤模型能有效验证抗人CLDN18.2抗体的药效（成体鼠）5周龄的B-NDG hIL15小鼠经1.2 Gy照射后，通过尾静脉注射人HSCs (1.5E5)， 6周后皮下注射人CLDN18.2过表达的人肺癌B-hCLDN18.2 A549细胞（1E7），7天开始腹腔注射抗人CLDN18.2抗体（zolbetuximab，内部合成），每周取外周血检测人NK细胞和T细胞的重建水平，实验终点时取肿瘤组织检测浸润的人NK细胞和T细胞水平。结果显示：在重建人免疫系统的B-NDG hIL15小鼠肺癌模型中，抗人CLDN18.2抗体能有效抑制肿瘤的生长，肿瘤抑制率是36.2%；外周血及肿瘤组织中都能检测到较高水平的人NK细胞；外周血及肿瘤组织中也能检测到人T细胞，但人T细胞的重建较人NK细胞重建较慢，在外周血中的人T细胞水平维持逐渐升高的趋势。若想减少CD34+ HSC细胞数量的使用，可以使用新生鼠进行免疫重建实验。新生鼠免疫重建实验新生鼠与成体鼠HSC免疫重建对比使用新生鼠移植人CD34+ HSCs重建人免疫系统的方法与特点在新生的B-NDG hIL15小鼠中移植人CD34+ HSCs能重建功能性人NK细胞出生后24-48h的B-NDG小鼠（n=10）和B-NDG hIL15小鼠（n=10）分别经1.0、0.9 Gy辐射后，通过颞静脉注射人CD34+ HSCs (3E4)，在不同的时间点取外周血检测各类型人免疫细胞的重建水平。结果显示：与B-NDG小鼠相比，B-NDG hIL15小鼠中重建的人NK细胞比例显著性增高，从重建6周到18周都能比较稳定地维持较高比例。此外，通过将不同种类的肿瘤细胞系移植入免疫重建的小鼠的体内构建的CDX模型，我们可以最大限度地利用小鼠模型模拟人体内免疫系统的响应情况，为研究肿瘤在人体内的生长状态提供了最优模型。百奥动物开发了一系列免疫系统重建的小鼠模型，huHSC-B-NDG hIL15 mice目前保持大量稳定现货供应，欲购从速！百奥赛图自主开发的B-NDG系列小鼠，其成熟的T、B和NK细胞全部缺失，是目前公认的免疫缺陷程度高、非常适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，在此基础上百奥动物开发了一系列二代鼠，详情可访问百奥动物官网了解，如有需要请随时与我们联系！参考文献：[1] De La Rochere P, etc. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends Immunol. 2018 Sep;39(9):748-763.[2] Reya T, etc. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 2001 Nov 1;414(6859):105-11. [3] Rongvaux A, etc. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol. 2014 Apr;32(4):364-72. [4] Fehniger, etc. Interleukin 15: biology and relevance to human disease. Blood 97, 14-32.