【评价原理】

关节软骨受到急性外伤和慢性磨损，出现不同程度的损伤，导致关节疼痛、活动受限，甚至功能丧失。关节软骨的修复主要靠软骨细胞的增殖分化，生产足够的细胞外基质修复软骨缺损。人软骨细胞通常是静止的，血管化程度低，营养主要来源于关节液和软骨下骨，修复再生则显得十分有限，需要外源性的手段来辅助修复。地塞米松破坏软骨细胞的代谢平衡，引起软骨细胞的死亡或凋亡，从而引起软骨损伤。斑马鱼的骨骼发育与其他脊椎动物骨骼发育过程极其相似，因此，可用于软骨修复功效评价。

斑马鱼的软骨主要分布于头部，包括七对咽颅软骨弓（下颌弓、舌弓及五对鳃弓）和脑颅软骨。基于转基因软骨荧光斑马鱼特性，患有软骨损伤的斑马鱼的软骨荧光强度会明显比正常斑马鱼的软骨荧光强度要暗很多，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试软骨荧光斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和软骨修复产品组。其中正常对照组未摄入地塞米松，模型对照组与服用软骨修复产品组都摄入了等量的地塞米松（地塞米松通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用软骨修复产品组在摄入地塞米松的同时摄入硫酸软骨素之类的软骨修复产品。

服用一段时间软骨修复产品后，我们观察软骨荧光的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼软骨表型图

绿色荧光为斑马鱼头部软骨

可以看到，服用软骨修复产品组的软骨情况与未摄入地塞米松的正常对照组比较相似，没有明显的软骨损伤。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用软骨修复产品组的软骨情况与未摄入地塞米松的正常对照组相似，并未出现模型对照组的软骨损伤的情况。

2.本实验证实了硫酸软骨素具有明显软骨修复功效。

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【评价原理】

斑马鱼与哺乳动物有相似的神经系统。在哺乳动物体内起到睡眠调节作用的分子和细胞群（单胺能、胆碱能、下丘脑素能）的斑马鱼体内大部分是守恒的。各种催眠药物如H1组胺能拮抗剂、褪黑激素激动剂、-2肾上腺素能激动剂和γ-氨基丁酸（GABA）能调节剂在斑马鱼体内的反应也很保守。GABA是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质。戊四唑（PTZ）是GABA抑制剂，小剂量PTZ可诱导既有躁狂症又有抑郁症的双相精神障碍，从而造成失眠。

患有失眠症的斑马鱼会表现出行为异常，表现为总运动距离明显增加，可以用行为分析仪观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和安神助眠剂组。其中正常对照组未摄入PTZ，模型对照组与安神助眠剂组都摄入了等量的PTZ（PTZ通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。安神助眠剂组在摄入PTZ前服用睡安片之类的安神助眠剂。

服用一段时间安神助眠剂后，我们通过行为分析仪检测斑马鱼的总运动距离。

【结果展示】

图1. 斑马鱼的运动轨迹图

红色线条表示快速运动轨迹，绿色线条表示中速运动轨迹，黑色线条表示慢速运动轨迹

可以看到，服用安神助眠剂组的运动明显比加了模型对照组减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用安神助眠剂组的总运动距离相对于模型对照组明显减少，能缓解斑马鱼的躁狂症。

2.本实验证实了睡安片具有安神助眠功效。

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【评价原理】

醉酒实为急性乙醇中毒，使人大脑兴奋，引起行为异常。乙醇进入人体后90%进入肝脏进行代谢，乙醇脱氢酶（ADH）可以将其氧化为乙醛，在乙醛脱氧酶（ALDH）催化下，乙醛转化为乙酸，最后转化为二氧化碳和水。在ADH和ALDH两种酶的作用下，乙醇能够被机体代谢而避免引起机体损伤。由于斑马鱼拥有与人类相似的消化系统，如肝脏、肠道等，消化和营养的吸收及运输与人类高度相似，当乙醇被过量摄入后，经过代谢产生大量乙醛，致使乙醛在体内积累，出现醉酒现象。

解酒有两种评价方法：1. 总运动距离，应用行为分析仪分析斑马鱼的运动轨迹，醉酒斑马鱼的总运动距离比正常斑马鱼明显增多。2. ADH和ALDH两种酶的含量，通过检测斑马鱼体内ADH和ALDH两种酶的含量，分析两种酶的调节作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用解酒剂组。其中正常对照组未摄入酒精，模型对照组和服用解酒剂组都摄入了等量的酒精（酒精通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用解酒剂组在摄入酒精之前摄入RU21、海王金樽之类的解酒剂。

服用一段时间解酒剂后，应用行为分析仪分析摄入酒精后的斑马鱼总运动距离；同时用ALDH和ADH试剂盒检测两种酶的含量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼运动轨迹图

黑线：慢速运动轨迹；绿线：中速运动；红线：快速运动，红线代表醉酒行为状态

可以看到，服用解酒剂组的运动轨迹与模型对照组比较，快速运动明显减少，醉酒行为有所改善。

图2. 斑马鱼体内乙醇脱氢酶含量

与模型对照组比较，** p < 0.01

图3. 斑马鱼体内乙醛脱氢酶含量

与模型对照组比较，** p < 0.01

从柱状图中可以出来，服用解酒剂组的ADH和ALDH两种酶含量与模型对照组比较明显增高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用解酒剂组的总运动距离与模型对照组比较明显降低，并ADH和ALDH两种酶含量明显增高。

2.本实验证实了RU21、海王金樽具有明显的解酒功效。

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【评价原理】

斑马鱼消化道的解剖结构、组织细胞形态与人类消化道相似，具有内皮、结缔组织、环状肌肉和外纵肌层。斑马鱼发育至5 dpf时，其消化道即出现了自发有节奏的肌肉收缩活动。经过喂食不被吸收的特异性荧光材料尼罗红，可以明显的观察到被鱼吃进去的荧光染料，以胃肠道尼罗红的量（荧光强度）为指标，若供试品有胃肠动力抑制作用，则胃肠道内尼罗红无法排出，堆积的尼罗红的量增加，胃肠道荧光强度明显变亮。

【实验方案】

我们先给斑马鱼喂饲特异性荧光材料尼罗红，然后将受测试斑马鱼分成2组，分别是正常对照组、胃肠动力抑制剂组。服用一段时间胃肠动力抑制剂后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼胃肠道荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胃肠道荧光强度表型图

可以看到，服用胃肠动力抑制剂斑马鱼的胃肠道荧光强度明显比正常对照组亮。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用胃肠动力抑制剂斑马鱼的胃肠道荧光强度明显比正常对照组亮。

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【评价原理】

斑马鱼胃肠道粘膜屏障系统由较完整的机械屏障、化学屏障和免疫屏障构成，与哺乳动物高度相似，可作为胃肠道粘膜屏障研究的动物模型。三硝基苯磺酸（TNBS）可破坏肠道粘膜屏障，与肠组织蛋白结合形成抗原，发生变态反应，诱发结肠炎。杯状细胞主要分泌黏蛋白，形成黏膜屏障以保护上皮细胞，肠黏膜损伤时杯状细胞数量减少。我们可以应用特异性的染料（呈蓝色），观察肠道杯状细胞数目，评价肠道粘液分泌功能。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用肠道粘膜辅助保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用肠道粘膜辅助保护剂组都摄入了等量的TNBS（TNBS通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用肠道粘膜辅助保护剂组在TNBS诱导肠道粘膜损伤之后摄入常欣卫口服液之类的肠道粘膜辅助保护剂。

服用一段时间肠道粘膜辅助保护剂后，我们观察和分析肠道杯状细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肠道杯状细胞表型图

可以看到，服用肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

2.本实验证实了常欣卫口服液具有明显的促肠道粘液分泌功能。

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【评价原理】

斑马鱼为鲤科短担尼鱼属的小型硬骨鱼，1998年国际经济合作与发展组织将斑马鱼胚胎发育方法列入测定单一化学品毒性的标准方法。由于斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，近年来斑马鱼被广泛应用于人类疾病模型及药物筛选、毒理学与环境检测中，使其成为新型的脊椎模式生物。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或胚胎注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体进行观察评价，观察斑马鱼心脏、脑部、耳、下颌、眼、肝脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、鳍、体长、身体着色、循环系统、身体水肿和出血等毒性反应情况，统计毒性发生率。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胚胎毒性表型图

可以看到，服用/注射供试品组的斑马鱼眼变小、心包水肿、肝脏变性、卵黄囊吸收延迟、胃肠道发育延迟。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的组织器官产生明显的毒性表型，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有胚胎毒性。

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【评价原理】

斑马鱼的听觉外侧系统由内耳和侧线两个关键的感觉结构组成，斑马鱼具有典型的内耳结构，内耳的毛细胞和侧线的毛细胞在结构功能及分子水平上与哺乳动物的内耳毛细胞非常相似，包括对耳毒性药物的相似反应。

经过特异性荧光染色（呈绿色），听力损伤的斑马鱼比正常斑马鱼毛细胞明显减少或缺失（荧光减弱或者消失）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体做毛细胞特异性染色，观察毛细胞的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼毛细胞表型图

绿色荧光颗粒为毛细胞

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼毛细胞减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼毛细胞明显减少，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有听毒性。

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【评价原理】

临床上显示常见的青光眼视神经病变、糖尿病性视网膜病变以及视网膜中央动静脉阻塞等疾病的发生都与缺氧有关系。组织的缺氧被视为视网膜血管疾病的重要原因，而与血管相关的视网膜疾病恰恰是临床上导致视力丧失的最主要原因。斑马鱼视网膜结构与人类高度相似，这使得斑马鱼胚胎能够模拟视网膜新生血管，为在短时间内快速评估功效提供了模型。

氯化钴是广泛使用的化学缺氧模拟剂，其钴可以取代特定前体羟化酶中的铁离子，使羟化活性失活。缺氧条件下，能够诱导转录因子（hif）和血管内皮生长因子（vegf）的表达，诱发新生血管形成。

改善湿性黄斑变性有3个指标：（1）采用转基因血管内皮细胞绿色荧光斑马鱼，可在荧光显微镜在观察到缺氧的斑马鱼视网膜血管明显增多增粗；（2）同时制作病理切片，进行苏木素-伊红染色，观察视网膜结构变化；（3）检测hif、vegf基因相对表达量。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和黄斑变性药物组。其中正常对照组未摄入氯化钴，模型对照组与黄斑变性药物组都摄入了等量的氯化钴（氯化钴通过溶于鱼水的方式摄入到斑马鱼体内）。黄斑变性药物组在摄入氯化钴的同时给予施图伦滴眼液、贝伐单抗之类的黄斑变性药物。

服用/注射一段时间黄斑变性药物后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼视网膜血管的变化，制作成病理切片观察视网膜的病理结构变化，检测hif、vegf基因相对表达量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼视网膜血管表型图

可以看到，服用/注射黄斑变性药物组的视网膜血管面积与正常对照组比较相似，没有明显的血管增多增粗。

图2. 视网膜结构表型图

从病理切片中也能看出来，模型斑马鱼眼睛病理切片的色素上皮层和外核层结构紊乱、变薄，而服用/注射黄斑变性药物组的色素上皮层和外核层结构均有所恢复。

图3. hif-1α基因相对表达量

可以看到，模型斑马鱼hif-1α基因表达显著升高，服用/注射黄斑变性药物组该基因明显下降。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射黄斑变性药物组与模型对照组比较，视网膜血管明显变细、视网膜结构较正常、hif-1α基因表达下调。

2.本实验证实了施图伦滴眼液、贝伐单抗具有明显的湿性黄斑变性防治作用。

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【评价原理】

在尿酸形成的生化链中，黄嘌呤氧化还原酶催化最后两步反应，将次黄嘌呤代谢为黄嘌呤，进一步将黄嘌呤分解代谢为最终产物尿酸。在斑马鱼及大多数哺乳动物中存在尿酸氧化酶，一种高效降低尿酸水平的酶，可将尿酸分解成高水溶性的尿囊素，并随着尿液排出。但是人没有尿酸氧化酶，所以建立斑马鱼高尿酸模型需要加入氧嗪酸钾抑制尿酸氧化酶的活性，同时增加尿酸形成的前体物质黄嘌呤来增加尿酸的合成。经过尿酸荧光检测试剂盒检测，患有高尿酸的斑马鱼的尿酸荧光信号强度会明显比正常斑马鱼的尿酸荧光信号强度要高很多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降尿酸产品组。其中正常对照组未摄入氧嗪酸钾和黄嘌呤，模型对照组与阳性对照组都摄入了等量的氧嗪酸钾和黄嘌呤（氧嗪酸钾和黄嘌呤通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降尿酸产品组在摄入氧嗪酸钾和黄嘌呤的同时摄入鲣鱼胶原肽和蛹虫草之类的降尿酸产品。

服用一段时间降尿酸产品组后，我们用尿酸荧光检测试剂盒检测斑马鱼体内尿酸水平。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内尿酸水平（荧光信号强度）

与模型对照组比较，*** p < 0.001

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，阳性对照组的尿酸水平与未摄入氧嗪酸钾和黄嘌呤的正常对照组相似，并相对模型对照组的尿酸水平显著降低。

2.本实验证实了鲣鱼胶原肽和蛹虫草降尿酸产品具有显著降尿酸功效。

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【评价原理】

斑马鱼消化道的解剖结构和细胞结构与人类消化道相似，具有同心圆层的内上皮、结缔组织、环状肌肉和外纵肌层。三硝基苯磺酸（TNBS）的乙醇溶液造模法属于正常免疫系统下的半抗原诱导性模型，当TNBS的乙醇溶液灌肠时，乙醇作为有机溶剂溶解肠粘膜表面的黏液，暂时性破坏肠粘膜屏障，使TNBS和肠组织蛋白结合形成完全抗原，导致肠黏膜免疫系统针对该抗原的迟发性变态反应，并造成肠黏膜的损伤。杯状细胞是黏蛋白的主要来源，其数量和形态反应肠粘膜的健康状况，是肠粘膜异常的敏感指标。

由于斑马鱼通体透明的特点，有两种方法检测结肠炎的防治作用。1.观察肠腔面积的变化，2. 通过特异性染料（呈蓝色）对肠道的杯状细胞染色，通过观察杯状细胞数量来判断肠粘膜的损伤情况。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和抗结肠炎药物组。其中正常对照组未摄入TNBS，模型对照组与抗结肠炎药物组都加入了等量的TNBS（TNBS通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。抗结肠炎药物组在摄入TNBS的同时摄入泼尼松之类抗结肠炎药物。

服用一段时间抗结肠炎药物组后，我们观察斑马鱼的肠腔面积变化、杯状细胞数量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肠腔面积表型图

绿色虚线区域为斑马鱼肠腔

可以看到，服用抗结肠炎药物的肠腔面积与未加TNBS的正常对照组比较相似，没有明显的肠腔面积扩大。

图2. 斑马鱼肠道杯状细胞表图

红色框线区域内蓝色颗粒为杯状细胞

可以看到，服用抗结肠炎药物的肠道杯状细胞数量与未加TNBS的正常对照组比较相似，没有像模型组明显的杯状细胞减少情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗结肠炎药物的肠腔面积和杯状细胞数量与未加入TNBS的正常对照组相似，并未出现模型对照组的肠腔变大和杯状细胞减少的情况。

2.本实验证实了泼尼松具有结肠炎的防治作用。

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