1978年，科学家首次发现CD24，即分化簇24（Cluster of differentiation 24），也称为热稳定抗原（heat-stable antigen，HSA)，一种高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白。CD24没有胞内信号结构域，然而，几种信号转导蛋白与CD24活性相关，其中研究最充分的是Src家族激酶。CD24信号可影响细胞的增殖和生长，也可通过影响细胞间黏附作用进而促进肿瘤的侵袭和转移。纵观吞噬相关检查点抑制剂的发现历史：在过去的20年里，自第一个肿瘤吞噬相关检查点CD47-SIRPα通路被发现以来，其他肿瘤吞噬相关检查点PD1-PD-L1通路、MHC-I-LILRB1通路以及CD24-Siglec-10通路等被逐步发现，在识别吞噬相关检查点方面取得了很大的进展[1]。CD47作为第一个被发现的肿瘤吞噬相关检查点，在多种人类血液肿瘤中存在高表达。目前，CD47的一个主要难点是其在红细胞和血小板有表达，导致血液毒性。然而，研究表明，CD24不在人红细胞表达，不会产生贫血的副作用[2]。作用机制CD24可作为“别吃我”信号分子，与巨噬细胞上的分子Siglec-10相互作用，传递抑制性信号，抑制破坏性炎症反应，减少巨噬细胞吞噬作用，传递“别吃我”信号。CD24可以与现有疗法互补，是未来免疫治疗的潜在靶点。CD24-Siglec-10抑制吞噬作用的示意图[3]研究进展通过查询统计，目前针对CD24靶点进行开发的在研公司或机构有很多，适应症涉及自身免疫疾病、炎症、病毒感染和肿瘤等多个领域。随着针对CD24靶点作用机制的发现，需要更多的临床研究来检验靶点对不同类型的肿瘤的影响。百奥动物自研产品B-hCD24 mice plus，是靶向CD24抗体开发相关药物进行药效评价的优质模型。相信随着对CD24的开发，多个领域的药物研发势必会进入一个加速的时代。数据展示01基本信息02血红细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的红细胞，结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠中可检测到小鼠CD24，但在B-hCD24小鼠中未检测到。在纯合B-hCD24小鼠中未检测到人CD24。03B细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞，结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中均可检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到人CD24。04T细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞，结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液中仅可检测到少量小鼠CD24(A)，而在野生型小鼠脾脏中无法检测到小鼠CD24(B)。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B)中均未检测到人CD24。05NK细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞，结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中未检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B) 中未检测到人CD24。06粒细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合子B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞，结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏 (B)中可检测到人CD24。07巨噬细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞，结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到人CD24。08树突状细胞蛋白表达分析流式细胞术分析纯合B-hCD24小鼠中的种属特异性CD24的表达。采集野生型小鼠和纯合B-hCD24小鼠的血细胞和脾细胞，结合种特异性抗CD24抗体通过流式细胞术进行分析。在野生型小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到小鼠CD24。在纯合B-hCD24小鼠血液(A)和脾脏(B)中可检测到人CD24。09CD24表达总结野生型小鼠与人的CD24表达谱不同，主要差别在于人红细胞不表达CD24但小鼠的红细胞表达。或可导致药物在野生型小鼠体内筛选时，可能会遇到在人中不会出现的血液毒性，干扰药物安全性、有效性的临床前评估。B-hCD24 mice plus人源化小鼠CD24表达谱与人一致，可有效避免相应风险。髓系细胞检查点相关产品列表参考资料1.Song Y, et al. Targeting macrophages in hematological malignancies: recent advances and future directions. J Hematol Oncol. 2022 Aug 17;15(1):110. doi: 10.1186/s13045-022-01328-x. 2.British Journal of Cancer (2013) 108, 1449–1459 | doi: 10.1038/bjc.2013.1023.Amira A Barkal, Irving L Weissman. CD24 signalling through macrophage Siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 2019 Aug;572(7769):392-396. 

全球双抗市场规模目前快速上升，有多款双抗进入临床中后期。根据目前管线中项目数和适应症情况，Frost &Sullivan预测：“2030年全球双抗市场规模将达到800亿美元，2030年我国双抗市场规模将超过100亿美元。”我国双抗药物开发起步相对较晚，但随着未来双抗技术平台日益成熟，获批药物种类增多，预计我国双抗市场规模也将高速扩张，2030年我国双抗市场规模预计将达108亿美元，2022至2030年复合增长率高达81.7%。‍ CD3 双抗介绍由于CD3与T细胞的激活密切相关，因此利用人CD3和肿瘤相关抗原（TAA）的双特异性抗体进行抗肿瘤治疗的手段被广泛研究。CD3×TAA 双抗又称为 T 细胞连接器（Bispecific T-cell engager, BiTE）。CD3双特异性抗体作用机制如下图所示，CD3×TAA双抗两个臂分别靶向T细胞表面抗原CD3和肿瘤细胞表面相关抗原TAA，从而拉近了肿瘤细胞与效应T细胞的距离，绕过了T细胞必须经过MHC-抗原肽与TCR形成复合物，以及共刺激分子的结合才能被激活的经典激活之路。激活的T细胞释放颗粒酶，穿孔素，从而有效杀伤肿瘤细胞。CD3×TAA双抗的作用机制[1]CD3双抗最新研究进展据统计，目前正在开发中的双特异性抗体有 50% 为 CD3 双抗。国内方面对于CD3靶点也热度不减。目前企业自主研发的CD3双抗约30多个，如针对市场表现良好的CD3×CD19靶点（Blincyto），绿竹生物、健能隆、爱思迈等制药企业在此靶点均有布局，以及CD3×CD20为目前竞争最为激烈的双抗靶点组合之一，在国内，目前已经有5款申报临床包括再鼎医药（再生元），嘉和生物，爱思迈生物，康诺亚/诺诚健华和Genmab和艾伯维。数据来源于科睿唯安及公开信息整理BioMice百奥动物自主研发了多个CD3×TAA小鼠模型，为双抗或三抗或多抗药物体内药效和安全性评价提供了有力工具。部分数据展示如下。B-hCD3E mice基本信息功能分析：体外刺激T细胞分泌细胞因子及双抗体外杀伤人源化小鼠的T细胞，在体外经CD3+ CD28刺激后，IL-2分泌增加，表明人源化改造后Th1细胞功能正常。人源化小鼠脾细胞+过表达MC38 细胞系+双抗孵育48h后，检测细胞裂解产生的LDH，结果显示CD8+ T细胞功能正常。双抗药效验证B-hCD3E mice+MC38-hCD19接种MC38-hEpCAM至B-hCD3E纯合小鼠皮下，肿瘤组织接近150±50mm3时分组进行体内药效评价实验（n=6）。 结果显示高剂量hCD3E抗体(Blinatumomab)可显著抑制肿瘤生长，证明B-hCD3E小鼠模型是体内评价抗hCD3E双特异性抗体疗效的有力工具。单抗药效验证人源化小鼠中mPD-1抗体显著抑制肿瘤生长（A），这表明CD3E人源化没有影响T细胞功能。抗hCD3抗体处理后肿瘤生长较快（A），B细胞占比没有明显差异（B），T细胞占比明显下降(C)，这表明hCD3抗体处理的肿瘤快速生长是由于T细胞过度激活耗竭(AICD)导致的。肿瘤标记物Ab(X)药效验证人源化小鼠中高剂量CD3双抗X抑制了肿瘤生长（A），治疗期间小鼠体重没有变化（B），B-hCD3E小鼠血液中B细胞（C）和T细胞（D）的比例没有明显变化。CD3双抗X在保持抑瘤效果的同时，没有产生过度激活T细胞的毒性，表明，B-hCD3E小鼠可作为CD3双抗临床前药效和毒性评价有力的研究模型。 三特异性抗体介绍三特异性抗体拥有三种特异性抗原结合位点，可以同时与靶细胞、功能细胞（一般为T细胞）相互作用，进而增强对靶细胞的杀伤。与单克隆抗体相比，三抗增加了两个特异性抗原结合位点，有利于将药物重定向至肿瘤局部，增加结合特异性，提升药物靶向肿瘤细胞的准确性，降低脱靶毒性。三特异性抗体作用机制[2]三特异性抗体最新研究进展全球已有多家生物医药企业布局三特异性抗体，赛诺菲作为三抗研发赛道的“领跑者”，目前已有3个三特异性抗体产品进入临床试验I期阶段，其中SAR442257是一款靶向CD3×CD28×CD38的三特异性抗体，它在体外试验中表现出比CD38单克隆抗体高1000~10000倍的骨髓瘤细胞杀伤活性。拟开发的适应症包括多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。除赛诺菲外还有诺华、罗氏是这一赛道的先行者。国内基石药业、嘉和生物等也都在布局三抗管线。数据来源于科睿唯安及公开信息整理B-hCD3E/hCD28 mice基本信息蛋白表达分析取野生型小鼠和纯合B-hCD3E/hCD28小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD3E抗体进行流式细胞术分析。如图所示，小鼠CD3E在野生型小鼠中检测到。人CD3E仅在纯合B-hCD3E/hCD28小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到（A）。小鼠CD28在野生型小鼠中检测到。人CD28仅在纯合B-hCD3E/hCD28小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到（B）。B-hCD3E/h4-1BB‍ mice基本信息蛋白表达分析取野生型小鼠和纯合B-hCD3E/h4-1BB小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD3E抗体进行流式细胞术分析。小鼠CD3E在野生型小鼠中检测到。人CD3E仅在纯合B-hCD3E/h4-1BB小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到（A）。用种属特异性抗4-1BB抗体进行流式细胞术分析。小鼠4-1BB在野生型小鼠中检测到。人4-1BB仅在纯合B-hCD3E/h4-1BB小鼠中检测到，而在野生型小鼠中检测不到（B）。参考文献1. Singh A, Dees S, Grewal IS. Overcoming the challenges associated with CD3+ T-cell redirection in cancer. Br J Cancer. 2021 Mar;124(6):1037-1048. doi: 10.1038/s41416-020-01225-5. Epub 2021 Jan 19. PMID: 33469153; PMCID: PMC7960983；2. R&D Investor Event，Adapted from Garfall et al, Trispecific antibodies offer a third way forward for anticancer immunotherapy, Nature 575, 2019 ©2019, Springer Nature (under permission requested). Article screenshot from Wu et al, Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy of tumor-directed T cells through T cell receptor co-stimulation, Nat Cancer 2020 ©2020, Springer Nature (under permission requested).

GARP（LRRC32）是I型跨膜蛋白，其中胞外区有两组10 LRRs (leucine-rich repeats) 区，通过富含脯氨酸的结构域（proline domain）连接。非活性状态（Latent）TGF-β 通过其LAP上的半胱氨酸与GARP形成二硫键的连接（图1A）。图1. GARP的结构（A）和功能（B）[1]GARP对TGF-β的成熟和活化起作用（图1B）。TGF-β最开始以同源二聚体的方式合成，被蛋白酶切割后形成非活性状态的TGF-β。GARP可以增强酶切及latent TGF-β的形成。在细胞膜表面，GARP/latent TGF-β复合物与整合素互作，进而释放成熟的TGF-β。成熟的TGF-β可与细胞表面的TGF-β受体互作引发下游信号通路。 GARP在活化的Treg细胞上选择性表达，调控TGF-β的分泌。TGF-β具有广泛的细胞活性。在肿瘤内部，TGF-βs，尤其是TGF-β1，会刺激基质细胞增生、新血管形成、癌细胞转移及抑制免疫细胞浸润。新研究发现，TGF-β是免疫检查点抑制剂在肿瘤微环境中耐药的主要原因。基于此，GARP/TGF-β是Treg细胞具有免疫抑制功能的核心机理之一。抑制Treg细胞表面的GARP功能，或靶向清除GARP+ Treg细胞，是此靶点的主要的成药机制。目前，针对GARP没有上市药物。处于临床阶段的GARP药物有以下三款。药物成药形式靶点研发公司开发阶段1DS-1055a单抗GARP第一三共Phase   I2ABBV-151单抗GARP/TGF-β1AbbviePhase   I3HLX-60单抗GARP复宏汉霖Phase   IDS-1055a是一款去岩藻糖的IgG1抗体，具有增强的ADCC效应，主要通过去除GARP+调节性T细胞（Treg）来发挥抗肿瘤作用[2]。目前正在实体瘤患者中开展I期临床试验（NCT04419532）。 ABBV-151是一款GARP/TGF-β1 IgG4抗体抑制剂，阻止TGF-β1的释放，从而减小TGF-β1的免疫抑制作用[3]。2018年，argenx将ARGX-115独家授权给AbbVie（ABBV-151）。目前ABBV-151正在进行单药及与PD-1单抗（ABBV-181）联用于实体瘤患者的I期临床试验(NCT03821935)。 HLX-60是一款GARP单抗，可阻断TGF-β1的释放，从而减小TGF-β1的免疫抑制作用；同时，还可以引发ADCC效应，清除GARP+ Treg。2022年8月26日，HLX-60与PD-1单抗联用于实体瘤患者的I期临床试验于澳大利亚获批[4]。百奥赛图自主研发了GARP人源化小鼠B-hGARP，用于靶向GARP的药物药效研究，助力新药研发。B-hGARP mice人GARP的种属特异性表达图2. RT-PCR分析纯合B-hGARP小鼠的种属特异性GARP mRNA的表达。鼠GARP mRNA只在野生型小鼠中检测到，人GARP mRNA只在纯合B-hGARP小鼠中检测到。图3. 利用流式细胞仪分析纯合B-hGARP小鼠的种属特异性GARP蛋白的表达。取野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H)的脾组织，用种属特异的抗GARP抗体进行流式分析。鼠GARP只在野生型小鼠中检测到，人GARP只在纯合B-hGARP小鼠中检测到。GARP人源化不影响白细胞各亚群比例图4. 脾脏白细胞亚群的流式分析。分离野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H) （n=3, 6周龄）的脾细胞并进行白细胞亚群流式分析。（A）代表性单活CD45+细胞的流式分析；（B）图A的统计分析。B-hGARP小鼠的T, B, NK, DC和单核/巨噬细胞的比例与野生型小鼠相似，证明人源化GARP不影响脾脏中这些细胞集群总体的发育、分化和分布。数值：平均值 ± SEM。图5. 脾脏T细胞亚群的流式分析。分离野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H)（n=3, 6周龄）的脾细胞并进行T细胞亚群流式分析。（A）代表性CD3+ T细胞的流式图分析；（B）图A的统计分析。B-hGARP小鼠的CD4+, CD8+ 和Treg细胞的比例与野生型小鼠相似，证明人源化GARP不影响脾脏中这些T细胞集群总体的发育、分化和分布。数值：平均值 ± SEM。人源化GARP同样也不影响血液中白细胞亚群和T细胞亚群总体的发育、分化和分布。（数据未展示）GARP人源化不影响小鼠血常规图6. B-hGARP小鼠血常规检测。采集野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H)（n=6, 6周龄）的血液进行血常规分析（CBC, complete blood cell count），所有检测项目均没有发现区别，说明GARP人源化并没有改变血细胞组成。数值：平均值 ± SEM。GARP人源化不影响小鼠血生化图7. B-hGARP小鼠血生化检测。采集野生C57BL/6小鼠(+/+)和纯合B-hGARP小鼠(H/H)（n=6，6周龄）的血清进行血生化分析，所有检测项目均没有发现区别。说明GARP人源化并没有改变血生化。数值：平均值 ± SEM。B-hGARP小鼠模型用于药效分析图8. mPD-1单抗和hGARP/latent-TGFβ1单抗联用在B-hGARP鼠中的抗肿瘤活性。（A）mPD-1单抗和自制hGARP/latent-TGFβ1单抗（ABBV-151）联用可抑制B-hGARP鼠中MC38肿瘤的生长。鼠结肠癌细胞系MC38（5E5）皮下植入纯合B-hGARP鼠（n=6，7周龄）中。当肿瘤长到50~70 mm3的时候对鼠进行分组，同时用mPD-1单抗和hGARP/latent-TGFβ1单抗联用治疗，治疗的剂量和时间如图所示。（B）治疗期间的体重变化。数值：平均值 ± SEM。图8A显示，mPD-1单抗和hGARP/latent-TGF-β1单抗联用可有效控制B-hGARP中肿瘤的生长，证明B-hGARP是一个强大的临床前模型，可用于抗人GARP抗体的体内药效评估。除B-hGARP小鼠外，在研品系还有B-hGARP/hTGF-β1双靶点人源化小鼠，敬请期待。参考资料[1] Metelli, Alessandra et al. “Immunoregulatory functions and the therapeutic implications of GARP-TGF-β in inflammation and cancer.” Journal of hematology & oncology vol. 11,1 24. 20 Feb. 2018, doi:10.1186/s13045-018-0570-z[2] Satoh, Kazuki et al. “Novel anti-GARP antibody DS-1055a augments anti-tumor immunity by depleting highly suppressive GARP+ regulatory T cells.” International immunology vol. 33,8 (2021): 435-446. doi:10.1093/intimm/dxab027[3] Cuende, Julia, et al. "Monoclonal antibodies against GARP/TGF-β1 complexes inhibit the immunosuppressive activity of human regulatory T cells in vivo." Science translational medicine 7.284 (2015): 284ra56-284ra56.[4] 复宏汉霖官网：https://www.henlius.com/en/NewsDetails-3737-26.html