【评价原理】

斑马鱼与人类生理结构和功能高度相似。斑马鱼消化道的解剖结构和细胞结构与人类消化道相似，具有同心圆层的内上皮、结缔组织、环状肌肉和外纵肌层。因此，可利用斑马鱼模型评价调节胃肠功效。

饲喂特异性的荧光染料（呈红色），在斑马鱼体内荧光染料不被其他组织干扰，且不会被吸收，荧光染料的残留量取决于胃肠道蠕动功能。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是模型对照组和服用胃肠调节剂组。模型对照组与服用胃肠调节剂组都摄入了等量的荧光染料（荧光染料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用胃肠调剂组在摄入荧光染料的之后摄入多潘立酮（吗丁啉）之类的胃肠调节剂。

服用一段时间胃肠调节剂后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼胃肠道荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胃肠道表型图

可以看到，胃肠调节剂组肠道荧光强度明显比模型对照组弱，说明胃肠调节剂通过促进胃肠道蠕动将荧光染料排出体外。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用胃肠调节剂组的胃肠道荧光情况比模型对照组明显减弱。

2.本实验证实了多潘立酮（吗丁啉）具有明显的胃肠调节功效。

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【评价原理】

药物骨毒性的安全性研究与肝、肾、心脏毒性等一般毒性相比较为薄弱，尤其是儿科人群用药的骨毒性安全问题，骨毒性非临床安全性评价愈加受到重视。斑马鱼是一种与人类同源性较高的脊椎动物，和哺乳动物一样，斑马鱼的骨骼是从3种胚胎干细胞系即神经嵴、体节中胚层和侧板发育而来的。

斑马鱼骨骼经过特异性的荧光染色后，经荧光显微镜采集到荧光强度能反映出骨密度和脊椎骨的数量，从而评价供试品骨毒性。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，我们对斑马鱼整体做骨钙染色，以脊椎骨荧光强度和脊椎骨数量评价供试品的骨毒性。

【结果展示】

图1. 斑马鱼骨密度表型图

黄色虚线区域为计算用脊椎骨

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼脊椎骨荧光强度明显减弱。

图2. 斑马鱼脊椎骨数量表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼脊椎骨数量明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼脊椎骨荧光强度明显减弱、数量明显减少，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有骨毒性。

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【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，斑马鱼肝脏中有许多与哺乳动物同源的脂质代谢酶，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。而且斑马鱼幼鱼通体透明，容易观察到毒性表型。酒精性肝损伤是全世界发病率和死亡率的主要原因，酒精性肝损伤是过量饮酒的结果。当患者继续饮酒时，会诱发严重的肝损伤形式，如脂肪性肝炎，纤维化，肝硬化和肝细胞癌。用乙醇可以诱发斑马鱼肝脏损伤，模拟人的肝脏疾病。

我们评价斑马鱼肝脏毒性有4个指标：1.肝脏面积；2.肝脏变性程度；3. 卵黄囊吸收延迟的发生率（卵黄囊是脂肪，卵黄囊吸收与肝功能密切相关）；4. 肝脏病理切片。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用肝保护剂组。其中正常对照组未摄入乙醇，模型对照组与服用肝保护剂组都摄入了等量的乙醇（乙醇通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。肝保护剂组在摄入对乙醇的同时摄入美他多辛之类的肝保护剂。

服用一段时间肝保护剂后，我们在显微镜下观察斑马鱼肝脏及卵黄囊表型，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

从病理切片中也能看出来，正常对照组肝细胞核规则清晰，肝细胞结构正常，边缘清晰。乙醇处理后，斑马鱼肝细胞结构模糊、肝细胞核肿大，肝组织出现脂肪空泡样变性，而肝保护剂组细胞和正常斑马鱼中形态相似。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，肝保护剂组斑马鱼肝脏与正常对照组相似，并未出现模型对照组的肝脏肿大、肝变性和卵黄囊吸收延迟情况。

2.本实验证实美他多辛对斑马鱼肝脏的保护作用。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。高血脂患者由于血液中胆固醇、油脂含量过多，就会使过多油脂沉积于血管壁上，容易使动脉管壁增厚、变硬、失去弹性，导致动脉硬化。斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖脂负荷状态下表现出持续高血糖、高血脂现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病。

用转基因绿色血管荧光斑马鱼（呈绿色），患有高糖高脂的斑马鱼眼部血管壁厚度较正常斑马鱼明显增厚，在共聚焦显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖降脂产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖降脂产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖降脂产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖降脂产品。

服用一段时间降糖降脂产品后，我们用共聚焦显微镜下观察斑马鱼眼部血管壁厚度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼眼部血管壁厚度

白色箭头所指为血管壁

可以看到，模型对照组的眼部血管壁厚度较正常对照组明显增厚，而降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近，并未出现模型对照组眼部血管壁增厚的情况。

2.本实验证实了松花蛹虫草具有眼部血管壁厚度增厚改善功效。

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皮肤微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环。血液循环最根本的功能是进行血液和组织之间的物质交换，皮肤微循环状态与皮肤衰老密切相关。

【评价原理】

转基因血管内皮绿色荧光斑马鱼的节间血管可以在荧光显微镜下被明显地观察到，因而可以通过观察受试物对节间血管直径的影响来评价受试物促进血管新生的功效，进而表征改善微循环功效。此外，可以利用血流分析仪检测受试斑马鱼的血流速度，补充评价改善微循环功效。

【实验方案】

将斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和供试品组。正常对照组不做处理，供试品组添加一定浓度的受试化妆品，孵育24h小时后，在荧光显微镜下观察斑马鱼节间血管并拍照保存图片，用高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼节间直径，通过其统计学意义评价供试品改善微循环功效。

此外，通过血流分析仪分析观察各组斑马鱼的血流速度，以血流速度的增加量评价受试化妆品改善微循环功效。

【结果展示】

1、斑马鱼节间血管直径

图4. 供试品改善微循环功效表型图

黄色虚线标记部分为斑马鱼肠下血管，红色箭头所指为出芽数

2、斑马鱼血流速度（提供各组实验柱状图）

图5 斑马鱼血流速度

与模型对照组比较，***p<0.001

【评价结论】

1、经过斑马鱼对比实验，供试品组与正常对照组对比，肠下血管面积增大，出芽数增多，直径变大。

2、与正常对照组相比，化妆品组斑马鱼血流速度明显增大。

3、本实验证实了该化妆品具有改善微循环的功效。

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【评价原理】

细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染。斑马鱼有着与哺乳动物非常相似的发育良好的免疫系统(包括特异性免疫和非特异性免疫），使得斑马鱼成为了研究病菌感染机制和筛选抗菌剂非常有用的动物模型。

经过荧光标记的细菌（呈红色）注射进入斑马鱼体内，生长繁殖，可以明显地被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是模型对照组和服用抗菌剂组。模型对照组与服用细菌抑制剂组都注射了等量的细菌（细菌通过静脉注射的方式入到斑马鱼体内）。服用抗菌剂组在注射细菌后摄入阿奇霉素、比阿培南、利奈唑酮之类的抗菌剂。

服用一段时间抗菌剂后，我们将斑马鱼置于荧光显微镜下观察细菌数量的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内细菌繁殖表型图

白色箭头所指红色颗粒为细菌

可以看到，服用抗菌剂组的体内细菌数量较模型对照组显著减少，未出现全身性感染。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗菌剂组的斑马鱼体内细菌数量较模型对照组显著减少，未出现全身性感染。

2.本实验证实了阿奇霉素、比阿培南、利奈唑酮等抗生素具有显著的抑制细菌作用。

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【评价原理】

斑马鱼胃肠道粘膜屏障系统由较完整的机械屏障、化学屏障和免疫屏障构成，与哺乳动物高度相似，可作为胃肠道粘膜屏障研究的动物模型。三硝基苯磺酸（TNBS）可破坏肠道粘膜屏障，与肠组织蛋白结合形成抗原，发生变态反应，诱发结肠炎。杯状细胞主要分泌黏蛋白，形成黏膜屏障以保护上皮细胞，肠黏膜损伤时杯状细胞数量减少。我们可以应用特异性的染料（呈蓝色），观察肠道杯状细胞数目，评价肠道粘液分泌功能。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用肠道粘膜辅助保护剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组与服用肠道粘膜辅助保护剂组都摄入了等量的TNBS（TNBS通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用肠道粘膜辅助保护剂组在TNBS诱导肠道粘膜损伤之后摄入常欣卫口服液之类的肠道粘膜辅助保护剂。

服用一段时间肠道粘膜辅助保护剂后，我们观察和分析肠道杯状细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肠道杯状细胞表型图

可以看到，服用肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞数量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用肠道粘膜辅助保护剂组的肠道杯状细胞量与正常对照组比较相似，没有明显的减少。

2.本实验证实了常欣卫口服液具有明显的促肠道粘液分泌功能。

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【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。硫酸铜损伤斑马鱼神经丘（斑马鱼体表侧线器的末稍器官），造成神经丘细胞死亡，斑鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在神经丘周围，吞噬死亡的细胞 。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞比正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中正常对照组未摄入硫酸铜，模型对照组和服用/注射抗炎药组均摄入硫酸铜（硫酸铜通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用/注射抗炎药组在摄入硫酸铜之前摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼体表侧线上的中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体表侧线上中性粒细胞表型图

黄色箭头所指为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组侧线上中性粒细胞与正常对照组相似，未出现中性粒细胞募集情况。

以IL-1β基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼IL-1β基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，IL-1β基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗炎药组侧线上中性粒细胞数量与正常对照组数量相当，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。当生物暴露在环境污染物中，生物可能会发生氧化应激，主要表现为活性氧（ROS）产生和消耗的不平衡。在需氧生物的活细胞中，活性氧被一种由水和脂溶性低分子量自由基清除剂、特异性抗氧化酶组成的抗氧化防御机制解毒。

 应用ROS特异性荧光检测试剂，它的水解产物能被ROS氧化为高荧光物质，用多功能酶标仪检测荧光值反映氧化应激的程度。本方法已被授予国家发明专利。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是底物对照组、正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内），并加入ROS特异性荧光检测试剂。

服用供试品一段时间后，我们使用酶标仪对斑马鱼体内ROS进行荧光定量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ROS荧光值

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内荧光值比正常对照组有明显升高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼ROS水平明显高于正常对照组，与正常对照组存在显著性差异。

2.本实验证实了该供试品诱发斑马鱼氧化应激。

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【评价原理】

过敏原/致敏因子诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放活性介质如组胺、5-HT，前列腺素D、白三烯、血小板活化因子等，表现为平滑肌收缩，毛细血管扩大和通透性增强，腺体分泌物增多等，诱发多种过敏症状。 类胰蛋白酶是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是临床上检验人体是否过敏的重要指标。斑马鱼产生过敏反应时，亦诱导肥大细胞分泌类胰蛋白酶。C48/80作为肥大细胞活化剂，可以诱导组织学上肥大细胞脱颗粒，释放类胰蛋白酶。

我们检测过敏有两种方法。1. 类胰蛋白酶的含量：用酶标仪检测类胰蛋白酶的含量。2. 肥大细胞数量：制作病理切片，经过过碘酸雪夫染色，肥大细胞呈蓝色，肥大细胞释放的组胺和白三烯等物质呈红色。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成四组，分别是正常对照组和滴注致敏剂低、中、高剂量组。其中正常对照组未滴注C48/80，滴注致敏剂组均滴注C48/80低、中、高剂量（C48/80通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

滴注C48/80一段时间后，利用酶标仪检测类胰蛋白酶含量（吸光度值），同时制作病理切片进行过碘酸雪夫染色。

【结果展示】

图1. 斑马鱼类胰蛋白酶含量（吸光度值）

与正常对照组比较，*p < 0.05，***p < 0.001

可以看到，滴注中、高浓度致敏剂组类胰蛋白酶含量与正常对照组比较明显升高。

图2. 斑马鱼体内肥大细胞染色典型图

箭头指示为肥大细胞

从病理切片中也能看出来，滴注致敏剂组斑马鱼的肥大细胞与正常对照组相比数量明显上升。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，滴注致敏剂组斑马鱼类胰蛋白酶含量和肥大细胞数量与正常对照组相比数量明显上升。

2.本实验证实了C48/80具有明显的致敏作用。

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