Nature子刊：儿童肾癌类器官生物样本库的构建

编者按：类器官作为一个良好的临床前模型，被应用于各种疾病的精准医疗、药物评价及基础研究。那么，儿童肾癌类器官是何时问世的？构建效率如何？是否已有系统的文献？

今天，我们特别回顾一项于2020年3月11日发表在《自然·通讯》的经典研究——《An organoid biobank for childhood kidney cancers that captures disease and tissue heterogeneity》，该研究建立了头一个儿童肾癌类器官生物样本库，为后续的儿童肾癌研究提供了动力。

● 一、研究背景

肾癌约占所有儿童癌症的7%，包括多种亚型，如肾母细胞瘤（Wilms tumors）、肾恶性横纹肌样瘤（MRTK）、肾细胞癌（RCC）、肾脏透明细胞肉瘤（CCSK）、后肾腺瘤和先天性中胚层肾瘤（CMN）等[1, 2]。不同的亚型，所对应的治疗及预后也不同，然而目前有效的治疗方案仍是少之又少[3-5]。因此，一个有效的临床前体外模型，可以大大助力儿童肾癌的个体化精准治疗，避免在患者身上试药，减少严酷治疗方案带来的长期影响[6]。

在本文发表之前，常用的儿童肾癌临床前体外模型依然是肾癌细胞系，尽管肾癌细胞系推动了肾癌基础研究的发展，但要开发出能够捕捉儿童肾癌表型和遗传异质性的细胞系一直是个挑战[7]。三维类器官模型为这一需求提供了机会[8]。肿瘤类器官可以重现并长期保留原有肿瘤组织的遗传异质性[9, 10]，并且对于患者的药物应答情况具有预测价值[11]。因此，本研究构建了儿童肾癌类器官生物样本库，为后续的儿童肾癌研究提供了动力。

● 二、研究结果

1. 成功建立儿童肾癌类器官生物样本库

原文图1 构建儿童肾癌生物样本库

本研究共构建了54例儿童肾癌类器官，其中47例同时构建了匹配的正常肾类器官。针对不同的儿童肾癌亚型，类器官的构建成功率分别为：肾母细胞瘤——75%（40/54）、肾恶性横纹肌样瘤——100%（7/7）、肾细胞癌——75%（3/4）、先天性中胚层肾瘤——100%（2/2）、后肾腺瘤——100%（1/1）和肾源性残余——100%（1/1）。

而从形态学上而言，正常的肾类器官呈现出折叠状和囊状的混合情况，而肾癌来源的类器官因亚型的不同，形态也有所不同，比如肾母细胞瘤类器官的形态为空泡状、实心球，肾恶性横纹肌样瘤的形态为葡萄串，而肾细胞癌的形态则是空心细胞堆叠状，并且同一个亚型的肾癌类器官的形态也不尽相同。

 2. 儿童肾癌类器官的表型特征

原文图2 儿童肾癌类器官的组织学特征

对不同亚型的儿童肾癌组织及对应类器官的HE染色显示，类器官在组织学上保留了原有肾癌组织的特征。比如，至少95%的肾恶性横纹肌样瘤会出现SMARCB1基因的表达缺失[12]，该基因的免疫组化也揭示，不论是肾恶性横纹肌样瘤的组织还是类器官，不论是原发灶还是转移灶，SMARCB1基因的表达都在一个很低的水平，但在对应的正常组织及类器官中，SMARCB1基因却高表达。

原文图3 肾母细胞瘤类器官的细胞异质性

典型的肾母细胞瘤具有“三相结构”，包括原始肾胚芽细胞、上皮细胞和间质细胞[13]，为进一步了解肾母细胞瘤类器官是否保留了这一细胞异质性，研究人员对肾母细胞瘤类器官进行了单细胞RNA测序分析（scRNA-seq）。结果显示，不同患者的类器官拥有不同的细胞群体，并且在同一类器官中也有不同的细胞类群，比如51T这一类器官包括三种细胞类群：上皮细胞（标志物为EPCAM和CDH1）、间质细胞（标志物为COL1A1和COL3A1）以及一种可能是肾胚芽细胞的细胞（共表达上皮及间质细胞的标志物，还表达祖细胞样的标志物）。因此，肾母细胞瘤类器官保留了这一疾病的细胞异质性，染色图片也说明了同一结果。

3. 儿童肾癌类器官的遗传学特征

原文图4 儿童肾癌类器官的遗传学特征揭示了常见的驱动突变和拷贝数变化

为证实类器官与原有组织在遗传学上的相似性，研究人员对原有组织和类器官同时进行了全基因组测序，通过分析及对比两者的测序结果，研究人员发现，类器官与其对应的肿瘤组织在遗传上高度相似，并且连续传代（文中至多是传到11代）不会扰乱类器官的遗传稳定性。

4. 儿童肾癌类器官的基因表达及DNA甲基化情况

原文图5 儿童肾癌类器官的转录组及DNA甲基化图谱

研究人员还对儿童肾癌类器官进行了双端RNA-seq，发现类器官与对应肿瘤组织的基因表达非常类似，表现为t-SNE图上的聚集。此外107T肾细胞癌类器官中出现SFPQ-TFE3基因融合，71T肾细胞癌类器官中出现MALAT1-TFEB基因融合，这两种基因融合已被发现是儿童肾细胞癌的驱动因素[14]。与转录组分析一致，对甲基化CpG位点的聚类分析也表明，不同分型的儿童肾癌类器官与对应的肿瘤组织在t-SNE图上出现聚集，说明类器官保留了原有肿瘤的表观遗传学特征。

5. 儿童肾癌类器官用于药敏测试

原文图6 类器官药敏测试揭示了患者特异性药物敏感性

研究人员将儿童肾癌类器官用于药敏测试，结果显示，不同的患者对于同样的单药治疗方案（放线菌素D、长春新碱、多柔比星、依托泊苷、Idasanutlin）的应答情况不同，并且同一患者的肾母细胞瘤类器官与正常肾类器官对于同样药物的应答情况也有所不同。这一结果说明，儿童肾癌类器官可用于高通量药物测试，以揭示患者的特异性药物敏感性。

● 三、编者点评

1. 这是一项非常经典的类器官研究，适合每一位想要开展“儿童肾癌类器官研究”或“类器官样本库研究”的学者拜读。但一般此类“类器官样本库研究”的常见思路往往是：特定疾病类器官样本库的构建，形态学、组织学、遗传学分析，类器官用于药敏测试。虽然本文中运用了多种测序手段，但依然没有跳出这个“思路框框”，因此也没有非常长足的创新性；

2. 本文后一部分进行了儿童肾癌类器官的药敏测试，但其未与临床上的患者药物应答情况进行一个对比，损失了一定的临床指导意义；

3. 本文着重于儿童肾癌类器官各种特征的描述，但可能会使得那些想要从中学习如何培养儿童肾癌类器官的学者大失所望，因为本文没有详细介绍儿童肾癌类器官构建的注意点及配方优化的细节。此外，儿童肾癌类器官的培养是否比成人肾癌类器官的培养更加简便及高效，也只能等下一位学者给出答案。

作为斑马鱼生物技术的全球应用者，环特生物搭建了“斑马鱼、类器官、哺乳动物、人体”四位一体的综合技术服务体系，开展科研服务（CRO）、智慧实验室建设和精准医疗三大业务。目前，环特类器官平台已建立成人肾癌类器官的培养方法，在近期内将推出专用于肾癌类器官的培养试剂盒，敬请期待！

参考资料：

[1] Breslow, N., Olshan, A., Beckwith, J. B. & Green, D. M. Epidemiology of Wilms tumor. Med Pediatr. Oncol. 21, 172–181 (1993).

[2] Gooskens, S. L. et al. Congenital mesoblastic nephroma 50 years after its recognition: a narrative review. Pediatr. Blood Cancer 64, e26437 (2017).

[3] van den Heuvel-Eibrink, M. M. et al. Position paper: rationale for the treatment of Wilms tumour in the UMBRELLA SIOP-RTSG 2016 protocol. Nat. Rev. Urol. 14, 743–752 (2017).

[4] Gooskens, S. L. et al. Position paper: Rationale for the treatment of children with CCSK in the UMBRELLA SIOP-RTSG 2016 protocol. Nat. Rev. Urol. 15, 309–319 (2018).

[5] Brok, J., Treger, T. D., Gooskens, S. L., van den Heuvel-Eibrink, M. M. & Pritchard-Jones, K. Biology and treatment of renal tumours in childhood. Eur. J. Cancer 68, 179–195 (2016).

[6]Pritchard-Jones, K. et al. Treatment and outcome of Wilms’ tumour patients: an analysis of all cases registered in the UKW3 trial. Ann. Oncol. 23, 2457–2463 (2012).

[7] Brok, J., Treger, T. D., Gooskens, S. L., van den Heuvel-Eibrink, M. M. & Pritchard-Jones, K. Biology and treatment of renal tumours in childhood. Eur. J. Cancer 68, 179–195 (2016).

[8] Drost, J. & Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat. Rev. Cancer （doi.org/10.1038/s41568-018-0007-6） (2018).

[9] Boj, S. F. et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell 160, 324–338 (2015).

[10] Broutier, L. et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nat. Med. （doi.org/10.1038/nm.4438） (2017).

[11] Vlachogiannis, G. et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science 359, 920–926 (2018).

[12]Jackson, E. M. et al. Genomic analysis using high-density single nucleotide polymorphism-based oligonucleotide arrays and multiplex ligation-dependent probe amplification provides a comprehensive analysis of INI1/SMARCB1 in malignant rhabdoid tumors. Clin. Cancer Res. 15, 1923–1930 (2009).

[13] Rivera, M. N. & Haber, D. A. Wilms’ tumour: connecting tumorigenesis and organ development in the kidney. Nat. Rev. Cancer 5, 699–712 (2005).

[14] Young, E. E., Brown, C. T., Merguerian, P. A. & Akhavan, A. Pediatric and adolescent renal cell carcinoma. Urol. Oncol. 34, 42–49 (2016).