研究进展丨新型溴代阻燃剂TBPH诱导斑马鱼非酒精性脂肪肝及其潜在机制研究

编者按

四溴邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（TBPH），作为一种新型溴代阻燃剂，是传统阻燃剂五溴联苯醚(penta-BDEs)的替代品。作为添加型的阻燃剂，TBPH在生产、使用和废弃时，不可避免地被释放进入环境中，对生态环境和人类健康造成潜在的威胁。已有研究表明，许多环境污染物会破坏动物体内的脂质稳态，导致异常的脂质积累，主要是肝细胞中甘油三酯(TG)的积累，并伴随肝细胞膨胀、炎症和氧化应激。这些不良反应可能导致肝脂肪变性或从单纯性脂肪肝转变为代谢综合征的肝脏表现，如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的组织学表型。

今天，我们分享2021年5月由中国科学院水生生物研究所研究团队发表在《Environmental Science & Technology》（IF=11.4）的一项研究成果，该研究建立了斑马鱼非酒精性脂肪肝模型来验证暴露于TBPH是否会诱导NAFLD进展及其潜在机制，并进行生化测试、组织病理学观察和肝脏转录谱分析以评估NAFLD易感性。为进一步探索NAFLD发病机制及其潜在毒理学机制，还研究了表观遗传修饰(例如DNA甲基化)，研究结果表明，TBPH暴露破坏了斑马鱼的肝脏脂质代谢并诱发了NAFLD。

文章题目

Nonalcoholic Fatty Liver Disease Development in Zebrafish upon Exposure to Bis(2-ethylhexyl)-2,3,4,5-tetrabromophthalate, a Novel Brominated Flame Retardant

杂志：Environmental Science & Technology（IF=11.4）

发表时间：2021年5月2日

作者：周炳升，杨丽华，韩建，李瑞雯等

单位：中国科学院水生生物研究所

01、研究背景

四溴邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯(TBPH)是一种新型溴化阻燃剂，是五溴联苯醚(BDEs)等传统溴化阻燃剂的替代品，已被列为高产量化学品。在过去十年中，它的大规模使用伴随着广泛的污染，导致在室内灰尘、空气、污水污泥和水生环境中检测到它的存在。此外，据报道，TBPH在水生食物网中经历了营养放大，在鱼类、海洋海豚和鼠海豚中检测到高浓度在人类样本中也检测到它的存在，如头发、指甲、血清和母乳。

虽然TBPH已在环境和生物体中被广泛检测到，但根据先前的研究，在暴露的生物体(如鱼类)中，急性毒性相对较低。然而，TBPH的结构类似于邻苯二甲酸二(2乙基己基)邻苯二甲酸酯，一种已知的过氧化物酶体增殖剂和脂质代谢干扰物；因此，TBPH已被证明是过氧化物酶体增殖体激活核受体γ (ppartγ)激动剂。在我们最近对斑马鱼胚胎的研究中，我们观察到急性暴露于TBPH诱导了脂质储存的减少，主要以依赖于pparγ的方式，通过促进pparγ启动子的去甲基化和激发下游参与脂质代谢的基因转录。核受体信号在脂质代谢功能障碍中起着至关重要的作用，尤其是PPAR家族。最近有报道称，表观遗传调控，如DNA甲基化，通过干扰脂质代谢在人类肥胖发展中发挥作用。我们假设TBPH破坏代谢处理器，通过PPAR信号导致脂质稳态受损通路；然而，TBPH对脂质代谢的生物学作用仍有待阐明。

据报道，许多环境污染物会破坏动物体内的脂质稳态，导致异常的脂质积累，主要是肝细胞中甘油三酯(TG)的积累，并伴随肝细胞膨胀、炎症和氧化应激。这些不良反应可能导致肝脂肪变性或从单纯性脂肪肝转变为代谢综合征的肝脏表现，如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的组织学表型。环境污染是NAFLD发生的重要危险因素。在动物实验中，越来越多的证据表明高脂肪饮食(HFD)会加重环境化学物质引起的NAFLD。在过去的几十年里，超重和肥胖已成为世界范围内普遍存在的健康威胁，并与NAFLD风险的增加密切相关。

在此，我们的目的是确定暴露于TBPH是否会诱导NAFLD进展及其潜在机制。斑马鱼作为模型生物，在肝脏细胞组成、功能、信号和介导肝脏疾病的细胞过程方面与人类相似，使其成为研究肝脏疾病基本机制的有用系统。斑马鱼被喂食正常饮食(ND)或HFD，并进行生化测试、组织病理学观察和肝脏转录谱分析以评估NAFLD易感性。为了进一步探索NAFLD发病机制的潜在毒理学机制，我们研究了表观遗传修饰(例如DNA甲基化)。我们的研究结果表明，TBPH暴露破坏了斑马鱼的肝脏脂质代谢并诱发了NAFLD。

02、研究结果

1. 在2周的暴露期间，没有观察到一般的毒性或行为异常。在ND组和HFD组中，TBPH暴露没有改变体重。

在ND组中，暴露于0.02 μM TBPH对HSI（Hepatosomatic index，肝体指数=肝重/体重*100）没有影响，但暴露于2 μM TBPH时，HSI相对于溶剂对照组显着降低。在HFD组中，与溶剂对照组相比，暴露于0.02 μM TBPH和2 μM TBPH时，HSI显著下降。在ND和HFD组中，与溶剂对照组相比，暴露于2 μM TBPH时，肝脏TG浓度显著增加(图1A)。

此外，2 μM TBPH处理后，HFD组TG浓度高于ND组(图1A)。在暴露于0.2和2 μM TBPH时，ND组肝脏组织病理学分析显示肝脏脂肪变性和轻度球囊变性(图1B)，而在HFD组中，发现明显的球囊变性和肝脏脂肪变性明显恶化(图1B)。油红O染色进一步证实TBPH处理中脂质积累。HFD饲喂组的脂质染色最小，而ND和HFD联合2 μM TBPH组的脂质积累最严重，ND和HFD饲喂的日粮加0.2 μM组的脂质积累中等(图1C)。

图1

2. 研究人员测量了肝脏中促炎生物标志物的水平，如TNF-a和IL-6。在ND组中，TBPH处理完全没有诱导TNF-a和IL-6，而在HFD组中，0.2 μM和2 μM TBPH处理可显著诱导TNF-a和IL-6(图2A,B)。此外，在没有TBPH暴露的情况下，与ND组相比，HFD组的TNF-a和IL-6显著增加(图2A,B)。

图2

3. 在ND组中，SOD活性在暴露于0.02或2 μM TBPH时未受影响，而CAT活性在暴露于2 μM TBPH时显着增加(图3A,B)。另一方面，在HFD组中，暴露于0.2 μM和2 μM TBPH时，SOD和CAT活性显著增加(图3A,B)。

此外，在0.2 μM和2 μM TBPH处理下，HFD组对SOD和CAT活性的诱导均显著高于ND组(图3A,B)。在ND和HFD组中，与溶剂对照相比，在0.02 μM TBPH和2 μM TBPH处理下，GSH-px活性显著降低(图3C)。在0.02 μM TBPH和2 μM TBPH处理下，ND组GSH浓度虽小但显著降低，而HFD组GSH浓度显著升高(图3D)。暴露于0.2和2 μM TBPH时，与ND组相比，HFD组的GSH浓度更高(图3D)。

图3

4. 为了揭示TBPH诱导鱼脂肪变性的机制，采用qPCR方法测定了核受体和脂质代谢的几个标记物的mRNA水平。

在ND组和HFD组中，与溶剂对照组相比，TBPH处理后PPAR家族成员(包括pparaa、pparab和pparg)的转录均显著上调(图4)。在脂质生物发生和转运相关基因方面，测定了fabp11a、acaca、fasn、lpl、hmgcra和srebf2的转录。在ND组中，暴露于0.2和2 μM TBPH时，fabp11a、acaca、lpl、hmgcra和srebf2的转录上调，而fasn的转录保持不变(图4)。同样，在HFD组中，暴露于0.02 μM和2 μM TBPH时，fabp11a、acaca、fasn、hmgcra和srebf2的转录显著上调，而lpl的转录下调(图4)。

我们还测量了脂肪酸β氧化相关基因的转录，如pgcla、cptlaa、cptlab和apoala。在ND和HFD组中，0.2和2 μM TBPH处理后，pgcla、cptlaa、cptlab和apoala转录显著上调(图4)。

图4

5. 在ND组中，0.02 μM和2 μM TBPH处理导致tetl和tet2转录显著上调。同样，在HFD组中，0.02 μM和2 μM TBPH处理导致tetl和tet2转录显著上调(图5)。根据JASPAR 2020数据，pgcla启动子上可受DNA甲基化影响的序列中有4个DNA结合位点的转录因子，包括3个芳烃受体核转运子位点和1个转录因子AP-2 α位点。

此外，在所选序列中，另一个转录因子AP-2a结合位点可受DNA甲基化模式的影响(Supporting Information)。在ND和HFD组中，与溶剂对照相比，0.02 μM TBPH和2 μM TBPH处理显著降低了pgclo启动子的DNA甲基化比率(图5)。

图5

03、编者点评

总之，TBPH暴露会导致斑马鱼脂肪肝疾病的发展，并导致氧化应激。TBPH暴露破坏了斑马鱼的肝脂代谢，并诱导了非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）。TBPH暴露还导致DNA去甲基化，并影响肝脏转录组。

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