Antioxidants丨利用斑马鱼研究姜黄叶提取物的抗氧化作用

编者按

姜黄为姜科植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎，姜黄叶提取物是从传统中药姜黄中提取的主要天然成分，研究表明其具有抗炎、抗衰老、抗动脉粥样硬化、维护心血管健康等多种作用。近年来，其抗氧化作用备受研究者关注。

过量产生活性氧（ROS）引起的氧化应激会导致细胞损伤。因此，具有抗氧化特性的功能材料对维持氧化还原平衡至关重要。已有多项研究表明姜黄叶具有抗氧化特性，姜黄叶的抗氧化作用来源于不同的生物活性化合物，如姜黄素、总酚类化合物和黄酮类化合物等。

今天，我们分享2021年1月由韩国食品研究院、高丽大学研究团队发表的一项研究成果，该研究利用体外Vero细胞与斑马鱼模型评估了姜黄叶提取物（TLE）对ROS生成、细胞凋亡的影响，并对姜黄叶提取物（TLE）中功能化合物的组成进行鉴定，发现姜黄叶提取物具有较强的抗氧化作用，其作用机制是通过抑制H2O2诱导的体外和体内活性氧的产生发挥作用，因此，姜黄叶提取物可能用以抗氧化剂的食物来源，适合用于功能性食品或作为氧化应激诱导的细胞损伤的替代治疗。

文章题目

Antioxidant Effects of Turmeric Leaf Extract against HydrogenPeroxide-Induced Oxidative Stress In Vitro in Vero Cells and InVivo in Zebrafish

杂志：Antioxidants（IF=6.3）

发表时间：2021年1月14日

作者：Kim M, Kang M C, et al．

单位：韩国食品研究院、高丽大学（Korea University）等

01、研究背景

活性氧（ROS），即在细胞代谢过程中产生的多种不同的含氧活性分子，可导致氧化应激，损伤包括蛋白质、DNA和脂质在内的必需大分子，从而改变生物活性。一般来说，ROS的产生是由ROS的产生和清除之间的平衡决定的，这被称为氧化还原平衡或氧化还原自稳态。然而，病理状态下，在外界刺激暴露后，氧化-抗氧化平衡可能会被破坏，随着ROS的累积产生氧化应激，触发炎症、细胞凋亡和自噬等多种病理过程，甚至导致癌症、心血管疾病、神经紊乱和糖尿病等各种疾病的发生。因此，需要补充抗氧化剂来维持氧化还原平衡，并防止由ROS失衡引起的氧化应激引起的疾病。

姜黄（Curcuma longa L.，姜科）是一种常见的草本植物，在印度、中国等许多亚洲国家都有种植。自古以来，姜黄一直被作为药用植物，其具有多种生物活性，如增强免疫力、抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌和伤口愈合等。这些功能特性源于姜黄的主要成分——姜黄素类化合物，包括姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲基姜黄素等。

姜黄素作为众所周知的黄色色素，其清除自由基的活性较强，是一种潜在的能缓解氧化应激引起的细胞损伤的活性物质。同样，姜黄叶作为姜黄的副产品，被认为也具有抗氧化特性，并在东南亚的各种菜肴中被用作食材。然而，除了收获后的动物饲料外，姜黄叶大多被浪费为副产品。然而，除了被用作动物饲料外，姜黄叶大多作为副产品。已有研究表明，姜黄叶也含有生物活性化合物，如姜黄素、多种酚类化合物和黄酮类化合物，这些化合物因其能够有效地清除自由基活性而被认为具有抗氧化作用。然而，姜黄叶对ROS诱导的氧化应激的影响尚不清楚。

本研究通过对姜黄叶提取物（TLE）中功能化合物的组成进行鉴定，并采用Vero细胞、斑马鱼模型分别在体外和体内水平研究其对ROS生成和细胞凋亡的影响，旨在评估姜黄叶提取物（TLE）对过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激的影响。

02、研究结果

1. 对姜黄叶提取物中黄酮类物质进行鉴定

采用高效液相-质谱联用(HPLC-MS)对姜黄叶提取物（TLE）中的黄酮类化合物进行分析，鉴定出10种黄酮类化合物，分别为：香叶木素diosmetin （525.40±0.23 ng/mg）、槲皮苷quercitrin （304.94±7.95 ng/mg）、芦丁rutin （118.33±6.72 ng/mg）、miquelianin （111.38±6.57 ng/mg）、花旗松素taxifolin （92.14±5.06 ng/mg）、myrictrin （63.73±2.31 ng/mg）、葛根素puerarin （55.30±4.56 ng/mg）、芸香柚皮苷narirutin （25.81±1.44 ng/mg）、柚皮苷naringin（25.81±1.44 ng/mg）、槲皮苷quercetin（23.31±0.44 ng/mg）（图1）。

图1.（a）黄酮类化合物的提取离子色谱图（EIC）和（b）4 mg/mL提取物中三种主要黄酮类化合物的化学结构

2. TLE对细胞活力的影响

采用MTT法测定姜黄叶提取物（TLE）对H2O2处理的Vero细胞活力的影响。如图2所示，未处理细胞的细胞活力为100%，H2O2处理组的细胞活力降至78.4%，而TLE处理组的细胞活力均高于H2O2处理组，而且，与未处理组相比，细胞活力为86.3%。这表明，姜黄叶提取物（TLE）对H2O2诱导的Vero细胞无细胞毒性，并抑制了H2O2诱导的细胞死亡。

图2. H2O2处理的Vero细胞存活率

3. TLE对Vero细胞内ROS生成的影响

采用DCFH-DA法测定H2O2处理的Vero细胞内ROS的清除能力。与未处理组相比，600μM的H2O2处理组ROS生成量增加了约7.4倍（图3），而除10μg/mL处理外，TLE处理组的各浓度均显著降低Vero细胞内ROS生成量，且呈剂量依赖效应。特别是相比于H2O2处理组（100%），最高浓度的TLE（100μg/mL）表现出最强的ROS清除活性，其清除率达到52.6%，这表明TLE具有显著的自由基清除活性，能有效抑制H2O2处理的Vero细胞内的ROS的产生。

图3. H2O2处理的Vero细胞内活性氧（ROS）的生成

4. TLE对Vero细胞Sub-G1期细胞群的影响

为确认DNA片段化的程度，研究人员采用碘化丙啶（PI）DNA染色法对Sub-G1期细胞群进行流式细胞术细胞周期分析，发现未处理组的Sub-G1期细胞群为0.4%，而H2O2处理后的sub-G1期细胞比例高达24.7%。与对照组的Sub-G1期细胞群相比，不同浓度的TLE处理组显著降低，分别为19.7%、10.6%、9.3%和6.3%，且呈剂量依赖性效应（图4）。这些结果表明，TLE具有抗氧化作用，能够有效地抑制DNA破碎和凋亡。

图4. H2O2处理的Vero细胞Sub-G1期细胞的比例

5. TLE处理对H2O2诱导的Vero细胞凋亡的影响

通过Hoechst 33342和PI的核染色，评估TLE处理对H2O2诱导的Vero细胞凋亡及DNA片段的影响。如图5所示，未处理组的细胞核未出现损伤，而H2O2处理的细胞与核浓缩增加，其Hoechst 33342染色呈蓝色荧光；PI呈红色荧光，出现细胞死亡；而10µg/mL和100µg/mL的TLE处理组显著降低了H2O2诱导的细胞核浓缩和细胞死亡。这些结果表明，TLE处理能够抑制H2O2诱导的氧化应激造成的Vero细胞凋亡。

图5. 双染色的Vero细胞荧光显微镜图像

6. TLE对H2O2诱导的斑马鱼细胞死亡、ROS生成和脂质过氧化的抑制作用

为了验证TLE对H2O2诱导的氧化应激的影响，研究人员采用斑马鱼损伤模型对斑马鱼细胞死亡、ROS生成和脂质过氧化进行评价，并通过吖啶橙荧光染色检测法评估了TLE对H2O2诱导的斑马鱼细胞死亡的保护作用。将H2O2处理的斑马鱼细胞死亡率看作100%，100μg/mL、200μg/mL的TLE处理显著降低了H2O2诱导的斑马鱼细胞死亡率，分别为40.0%和16.7%（图6a）。

采用DCFH-DA法测定TLE对H2O2处理的斑马鱼胚胎中ROS的生成，将H2O2处理的斑马鱼ROS生成看作100%，100μg/mL、200μg/mL的TLE处理显著降低了H2O2处理的斑马鱼体内ROS的生成，分别为51.0%和72.6%（图6b）。

采用测量DPPP荧光强度研究TLE对H2O2处理的斑马鱼体内脂质过氧化程度，发现100μg/mL、200μg/mL的TLE处理显著降低了H2O2处理的斑马鱼体内脂质过氧化，分别为20.9%和6.7%，且呈浓度依赖性（图6c）。这些结果表明，TLE对H2O2诱导的斑马鱼氧化应激具有保护作用。

图6. 斑马鱼细胞死亡、ROS生成和脂质过氧化

03、编者点评

综上所述，该研究表明，姜黄叶提取物具有很强的抗氧化作用，其作用机制是通过抑制H2O2诱导的体外Vero细胞与斑马鱼ROS的产生发挥作用。因此，姜黄叶可能是一种抗氧化剂的食物来源，适合用于功能性食品或作为氧化应激诱导的细胞损伤的替代疗法。

作为健康美丽产业CRO服务开拓者与引领者、斑马鱼生物技术的全球领导者，环特生物搭建了“斑马鱼、类器官、哺乳动物、人体”多维生物技术服务体系，开展健康美丽CRO服务、科研服务、智慧实验室搭建三大业务。目前，环特已建立200多种斑马鱼模型，胃癌、脑类器官、心脏类器官及各种肿瘤类器官培养平台，欢迎有需要的读者垂询！