人类参与生物学功能的蛋白大约有30,000多种，然而可成药的靶点只占据其中很少的一部分。探索不可成药靶点作为药物研发领域一个非常有挑战性但值得尝试的课题，因此备受关注。新兴技术例如靶向蛋白降解技术，将为该领域的发展提供极大助力。蛋白靶向降解技术借助蛋白酶体和溶酶体这两大天然存在于人体内的细胞器对致病蛋白进行精准降解，目前主流的蛋白降解通路大致分为三类：基于泛素-蛋白酶体系统、基于内体-溶酶体通路和基于自噬-溶酶体通路。蛋白降解通过细胞自身的蛋白酶系统来降解靶点蛋白(POI)，从而调控蛋白水平，而非像传统药物那样通过抑制靶点蛋白的功能来发挥其药物作用。为加速蛋白降解分子发现的过程，ICE团队针对PROTAC的特性和发挥作用的环节，积极布局对应的研发能力，专注于难成药靶点的药物研发，如：蛋白水平开展蛋白表达和纯化、生物物理学评价，蛋白亲和力、三元复合物的形成等；细胞水平可优化蛋白的降解与表达水平的检测，比如传统WB、数字化WB、通量化ICW和IFA、HiBiT敲入稳转细胞系的构建等技术，也可以利用商品化试剂盒如AlphaLISA，ELISA, HTRF等方法检测总蛋白的表达水平；同时结合细胞信号转导通路的检测、细胞活力与增殖等层次，多方位确定PROTAC分子在细胞中的活性；机制研究上可以通过ADME的方法、蛋白组学、结构生物学等手段，评价PROTAC分子在细胞内发挥作用的机制，也可以通过抑制剂的手段研究蛋白降解通路的特异性等等，形成了完整的蛋白靶向降解剂筛选平台。以BTK的PROTAC为例，简要地描述ICE在PROTAC分子早期研发布局的常用分析方法。细胞水平的降解，在优化方法的早期，会利用传统Western Blot实验看趋势，再结合数字化Western Blot（主要使用ProteinSimple的JESS设备）确定降解情况，用于后续筛选。传统电泳Western Blot实验（ICE数据）相比传统电泳Western Blot实验而言，JESS则显得更为便捷，制备样本流程简单，目前ICE团队已用JESS顺利完成多项蛋白降解相关实验。数字化Western Blot-JESS实验（ICE数据）对于大量的PROTAC分子细胞活性筛选，也有适合于微孔板的方式，如可开发方法的In-cell western（ICW）和Immunofluorescence assay（IFA），ELISA、Alphalisa等技术。ICW assay（ICE数据）IFA assay（ICE数据）对于通量的筛选，也可使用HiBiT内源敲入的细胞系，快速筛选可降解BTK蛋白的PROTAC分子，同时还可以看到降解的一些动力学过程，也可一并看到PROTAC分子对细胞增殖过程的影响。HiBiT内源敲入的细胞系（ICE数据）PROTAC具有分子量较大、氢键较多、溶解性较差、透膜性较差、稳定性较差等特性，需要尽早收集ADME相关数据，比如PROTAC分子在溶液中的溶解度、LogD，LogP，在血浆、肠液、胃液、原代肝细胞、筛选细胞实验培养基中的稳定性等等，透膜性也是另一个重要的参数，比如测试Caco-2，MDCKII, MDCKII-MDR1等细胞系中的Papp，做细胞实验所需细胞系中的透膜能力等等；还有代谢稳定性，在肝微粒体和原代肝细胞中的稳定性等等。结合体外的筛选平台，也可以通过靶点结合和生物标记物分子的检测，快速评价PROTAC透过肿瘤细胞的能力及与靶点的结合能力。对于脱靶效应的检测，也是非常重要，这个也受限于PROTAC的基本原理，当分子与非靶点蛋白有较弱或中等的亲和力时，也有可能带来脱靶降解，常会用到蛋白组学的方法来分析。液质联用（LC-MS/MS）可以快速结合细胞学化合物处理的条件，简单便捷分析一些参数，比如细胞对化合物的摄取量、非特异结合的量、生物转化的量、化合物溶解性及稳定性等等，这些分析简单的构成了细胞生物利用度，可以从一定程度上解释化合物在酶学和细胞学实验体系中活性的相对差异。爱思益普目前已经可以提供此类试验分析，可及时便捷地为大家提供troubleshooting的试验数据。目前新的蛋白降解方式不断出现，如分子胶，LYTACs，AUTACs，ATTECs，RIBOTACs，等等。对于膜蛋白而言，ICE有着丰富的稳转细胞系储备，如离子通道、GPCR受体等，希望在膜蛋白的降解领域能给大家更多的支持，为中国蛋白降解领域的药物研发做一些事。

GABAA受体是由五个亚基组成的跨膜受体，五个亚基围绕形成离子通道。每个亚基包含四个跨膜域，N-和C-末端都在细胞外。GABAA受体存在于神经元的细胞膜上，大部分该受体处于突触后膜上。GABA是GABAA受体的内源性配体，结合时可使受体通道开放。当GABA与受体结合时，受体在细胞膜上发生构型改变，通道孔打开，氯阴离子可顺着电势和浓度梯度通过离子通道。由于大多数神经元上的氯离子的翻转电位在细胞膜静息电位附近，或略低于静息电位，GABAA受体的激活可以使静息电位更加稳定，甚至使细胞超极化，以至于弱化了激动性神经递质的去极化效果和产生动作电位的可能。因此，该受体主要发挥抑制性作用，减少神经元的活动。在人体中，包含以下亚基：六种α亚基(GABRA1, GABRA2, GABRA3, GABRA4, GABRA5, GABRA6)三种β亚基(GABRB1, GABRB2, GABRB3)三种γ亚基(GABRG1, GABRG2, GABRG3)一种δ亚基 (GABRD)一种ε亚基(GABRE)一种π亚基(GABRP)一种θ亚基(GABRQ)爱思益普建立了表达多种亚基组合的GABAA1-A6通道，提供与麻醉，抑郁症等相关的药物筛选服务。爱思益普GABAA细胞系相关技术文章

TRP (transient receptor potential) 通道是一类在外周和中枢神经系统分布很广泛的通道蛋白.到目前为止,有超过30个TRP通道家族成员在哺乳动物中被克隆。TRP离子通道与多种感官反应包括热、冷、疼痛、压力、嗅觉和味觉等密切相关，容易被天然芳香物质调控，是很多疾病的治疗靶点。TRP离子通道家族

爱思益普在药代动力学方面有专业功底深厚、创新意识强和经验丰富的团队。ICE药代部分为客户提供从所有小分子的高质量ADMET和药代动力学服务，包括体外和体内药代动力学研究以及生物分析。体内药代动力学(PK)测试内容• 动物品系：小鼠、大鼠、犬（猴可做生物分析）• 给药途径：口服、静脉、皮下、舌下、腹腔、肌肉、气管及局部给药等• 生物基质：血浆、全血、胆汁、脑脊液、尿液、粪便及各种组织等匀浆液等• 组织取材：皮肤、骨骼肌、脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、脂肪(腹部和皮下)、卵巢、睾丸及附睾、小肠、大肠、十二指肠、膝关节、脊髓、前列腺、坐骨神经、脑脊液等• 给药方式：单次、多次或连续给药• 给药剂型：溶液、混悬液、片剂、胶囊、纳米混悬液、固体分散体、膏剂等• 实验类型：完整PK、快速PK、盒式PK、与抑制剂联合给药(ABT) PK（DDI）、快速组织分布实验（BBB）、CNS PK、Formulation PK、PK/PD等• PK模型：颈静脉插管、肝门静脉插管、股静脉插管、胆管插管• PK-PD模型：CDX模型 服务项目• 血浆动力学研究• 组织分布研究• 代谢产物定量• 排泄研究• 物料平衡• 血脑屏障• PROTAC药代动力学研究 软件应用• WinNonlin软件用于药代动力学研究数据计算处理 相关文章• 《爱求索》之成药性评价基础篇——DMPK Platform at ICE• 《爱求索》之成药性评价基础篇——药物的分布• 《爱求索》之药物代谢评价基础篇——CYP450• 《爱求索》之成药性评价基础篇——药物的分析• 《爱求索》之成药性评价基础篇——ADMET简介• 《爱求索》之成药性评价基础篇——药物的溶媒开发

急性分离或培养的神经元研究•药物对急性分离或培养的皮层，海马，延髓等神经元，脊髓背根神经节（DRG）神经元急性分离，培养，神经细胞凋亡，细胞损伤，缺氧保护实验等•电生理研究：电压门控通道（Na，Ca或K通道等）或配体门控通道（GABA，NMDA，AMPA等）以及动作电位，自发性突触后电位，镇痛药物的筛选和机制研究案例1： Primary hippocampus neuron (from 12W adult rat)Channel: BKCa channelMethod: inside-out patch clamp

γ－氨基丁酸是一种化合物，别名4－氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA），是一种氨基酸，在人体大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中起重要作用。据研究发现，GABA是在人脑能量代谢过程中起重要作用的活性氨基酸 ,是脑组织中最重要的神经递质。起作用能促进乙酰胆碱合成、降血氨、抗惊厥、降血压、促进生长激素分泌等多种生理功能。 ICE团队利用液相色谱质联用法对GABA检测进行方法学验证，检测动物模型体内的神经递质含量。对于神经递质检测，与传统的HPLC-ECD检测相比，UPLC-MS或UPLC-MS/MS具有灵敏度高，特异性强，检测时间短的优势。从而为客户提供更全面更细致有关神经递质相关的服务。北京爱思益普生物科技股份有限公司专注于从靶点发现验证、先导化合物筛选、优化到临床前候选分子阶段的创新药一体化生物学服务平台，覆盖在肿瘤，免疫，心血管，中枢神经系统等疾病领域，整合蛋白科学、酶学、细胞学、体内外药物代谢动力学、药理学等平台，支持创新药物研发项目，支持基础科研与临床转化医学业务。

癫痫是由多种病因导致的脑部神经细胞群高度同步化异常放电所致的慢性脑功能障碍综合症 [1] [2]，具有反复性、突发性和暂时性等特点[3]。由于异常放电神经元的位置及波及的范围不同，导致癫痫患者发作形式不同，严重者可表现为突然意识丧失、全身抽搐以及精神异常等[4]，往往会给患者的身体带来较大伤害，甚至危及生命，频繁的发作也会给大脑带来较大损害。流行病学资料显示，我国目前约有900万以上癫痫患者，每年新发癫痫患者65~70万，30%左右为难治性癫痫。所以，加强对癫痫疾病的防治和研究，提供抗癫痫药物研发企业完整的早期抗癫痫化合物的筛选一体化服务，针对靶点进一步提高药物研发的临床转化率有着深远意义。目前抗癫痫药物的作用靶点可分为四大类（图1）[5]：①作用于电压门控离子通道（包括钠、钙和钾通道）；②增强GABA受体介导的抑制作用；③抑制谷氨酸受体（NMDA、AMPA）介导的兴奋性；④通过释放机制成分的影响直接调节突触释放（SV2A、电压门控通道α2δ亚基）。通过这些作用机制调控神经元内在兴奋性和抑制性平衡，减少局部神经元同步放电的可能性从而降低癫痫发作的风险。                                  图1. 临床使用的抗癫痫药物作用靶点[5]癫痫发作的异质性和复杂性、既往药物的应用等，决定了抗癫痫药物的设计与发现中单一靶点成功率低，单一模型成功率低。因此，在预测性和验证性研发抗癫痫药物中，尽量设计多靶点以及不同种属，早期综合性筛选与多种动物模型并用对于判断全部可能治疗潜力是必要的。临床前研究中常使用啮齿动物癫痫模型来评估化合物的抗癫痫效应，常用于筛选药物的动物模型包括：最大电休克(MES)模型、戊四唑（PTZ）诱导的癫痫模型、6 Hz精神运动模型、杏仁核点燃模型。这些模型与人类癫痫发作的关联性如表1所示。表1 啮齿类癫痫动物模型及其涉及的抗癫痫药机制爱思益普生物科技公司建立了从靶点选择/验证/筛选、体外模型检测到体内模型评估（动物行为和脑电同步监测）的一整套完整的一体化服务平台，为药物研发企业提供高质量的抗癫痫药物筛选和药效评价服务。   我们以瑞替加滨（钾离子通道开放剂）为例展示从离子通道靶点——体外模型——体内模型药效的一体化检测结果。                                                                                                                                                                     图2. 瑞替加滨对KCNQ2/3的激活作用。A.瑞替加滨以浓度依赖性方式激活 KCNQ2/3 通道。B. 增加瑞替加滨的浓度会导致逐渐的超极化转变。C. 浓度效应曲线绘制为标准化的激活电压依赖性的变化，作为瑞替加滨浓度的函数图3. 瑞替加滨抑制无镁外液诱导的神经元兴奋性。A.原代培养细胞急性无镁条件诱导癫痫模型放电情况，瑞替加滨给药后完全抑制。B.离体脑片急性无镁条件诱导癫痫模型的胞外群峰电位记录，可以记录到典型的癫痫引起的震荡波，瑞替加滨药物处理后完全抑制。图4. 瑞替加滨抑制MES小鼠的强直痉挛和皮层癫痫样放电。A. MES小鼠的典型行为，溶剂对照组小鼠的后肢出现强直痉挛（左），瑞替加滨给药小鼠后肢未出现强直痉挛（右）。B. 统计图显示瑞替加滨抑制MES小鼠的癫痫样行为。C. 瑞替加滨抑制MES小鼠的皮层癫痫样放电。黑色线条代表正常脑电图（上），红色线条代表MES癫痫发作脑电图（中），绿色线条代表给瑞替加滨给药小鼠的脑电图（下）。D. 瑞替加滨抑制电休克诱导的癫痫样放电功率谱密度值。参考文献[1]S. Sanei, J.A. Chambers, EEG Signal Processing, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2007, 161.[2] T. Gandhi, B.K. Panigrahi, M. Bhatia, and S. Anand. Expert model for detection of epileptic activity in EEG signature, Expert Systems with Applications, 2010, 37(4):3513-3520.[3] E. Niedermeyer, da Silva F. Lopes, Electroencephalography: basic principles, clinical applications, and related fields, 5th Ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2005, 526.[4] U.K. Misra, J. Kalita, Clinical Electroencephalography, 1st Ed. Elsevier, a division of Reed Elsevier India Private Limited: Noida, 2005, 130.[5] Löscher W. Single-Target Versus Multi-Target Drugs Versus Combinations of Drugs With Multiple Targets: Preclinical and Clinical Evidence for the Treatment or Prevention of Epilepsy. Front Pharmacol. 2021 Oct 27;12:730257.

一．模型背景肺纤维化疾病病变主要侵犯肺间质和肺泡腔，包括肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞、基底膜以及血管、淋巴管周围的组织，最终引起肺间质的纤维化，导致肺泡及毛细血管功能的丧失。间质性肺炎和肺纤维化是对同一类疾病的不同描述方式，间质性肺炎是病理学上的一个分类名称，而肺纤维化是在影像学和临床使用的疾病名称。目前特发性肺纤维化（IPF）的发病机制仍不明确，目前公认的发病机制理论假说是上皮细胞假说。上皮细胞损伤导致炎症介质的分泌，并触发血小板活化，从而增强血管通透性，以募集白细胞。这些炎症细胞释放促纤维化细胞因子，如TGF-β1，介导成纤维细胞的活化和募集，以及它们分化成肌成纤维细胞，并随后释放细胞外基质（ECM）成分以促进伤口愈合。生理条件下，纤维生成是对组织损伤的反应，并形成伤口修复过程的一部分，参与恢复稳态。伤口修复通常由上皮损伤引起，导致凝血和炎症级联反应的激活。这反过来导致成纤维细胞的激活、募集和增殖，这些细胞负责ECM成分的释放。在最后的重塑阶段，伤口区域得到了修复，恢复了正常的组织结构和结构完整性。在与IPF相关的纤维化过程中，伤口修复过程的任何阶段都可能发生失调，导致瘢痕组织的不可逆积累。一．造模方法本研究选用SD大鼠或者C57小鼠，通过博来霉素(5mg/kg)或者脂多糖(5mg/kg)气管内给药，建立特发性肺纤维化模型；检测阳性药吡非尼酮及化合物对特发性肺纤维化大鼠的影响。造模方法：1.麻醉动物，仰卧固定于实验台上；2.颈部去毛后碘伏消毒，切开皮肤，逐层暴露气管；3.将微量注射器经两气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，回抽无阻力后，注入LPS溶液或者BLM溶液；4.手术完毕后迅速将动物直立、旋转，使药液在肺内分布均匀；5.动物清醒后常规饲养，注意术后护理；6.给予阳性药吡非尼酮。检测结果：一．结果分析检测指标：检测动物血清中NO含量、检测动物血清中IL-1β含量、肺组织病理学HE染色、肺组织病理学Masson染色、肺系数、肺组织湿/干重1.肺组织病理学HE染色：在Day21和Day28时，与Sham组相比，LPS组小鼠肺泡间隙增宽，病理学评分为4，肺泡腔内纤维化渗出严重，病理学评分为4，血管周围炎性细胞浸润严重，病理学评分为4，肺泡结构严重破坏；与Sham组相比，PFD组肺泡间隙增宽，病理学评分为2，肺泡腔内出现纤维化渗出，病理学评分为2，血管周围出现炎性细胞浸润，病理学评分为2，肺泡结构部分被破坏。肺组织病理学Masson染色显现出：在Day21和Day28时，与Sham组相比，LPS组小鼠肺组织出现大量胶原沉积，肺泡结构破坏严重，肺纤维化程度极其严重；与Sham组相比，PFD组出现少数胶原沉积，肺泡部分结构被破坏，肺部出现轻微肺纤维化现象。1.小鼠血清中IL-1β的含量：与LPS组相比，Sham组与PFD组血清中IL-1β的含量明显降低，差异极其显著。2.肺系数对比结果：，与LPS组相比，Sham组明显降低，有差异；PFD组有降低。3.右肺组织湿干重比（W/D）结果：与LPS组相比，Sham组和PFD组明显降低，有差异。北京爱思益普生物科技股份有限公司专注于从靶点发现验证、先导化合物筛选、优化到临床前候选分子阶段的创新药一体化生物学服务平台，覆盖在肿瘤，免疫，心血管，中枢神经系统等疾病领域，整合蛋白科学、酶学、细胞学、体内外药物代谢动力学、药理学等平台，支持创新药物研发项目，支持基础科研与临床转化医学业务

心血管系统疾病动物模型是心血管系统药物评价的重要工具，爱思益普建立了心律失常，心肌缺血，心力衰竭等动物模型进行心血管系统药效学评价。心力衰竭模型：后负荷增加：1. 主动脉缩窄 2. 盐敏感性HF模型前负荷增加：1. 动静脉瘘法 2. 瓣膜关闭不全法 3. 腔静脉缩窄法心肌收缩力减弱型HF模型1. 冠状动脉致缺血性心肌病法   2. 快速心室起搏法药物模型：异丙肾上腺素，阿霉素、柔红霉素、雷佑生(四乙酸丙亚胺)以及戊巴比妥钠,心得安,异搏定和乙醇等,造成心肌收缩力下降而制备成HF模型。心律失常模型：1. 氯化钡模型2. 氯化钙模型3. 氯仿心律失常模型4. 强心苷心律失常模型5. 房颤模型6. 心肌缺血再灌注性心律失常评价技术：1. In Vitro/ Ex Vivo•离子通道研究 •干细胞诱导分化心肌细胞 •Isolated heart (Langendorff perfusion) •2. 血流动力学•血压和心率 (telemetry/JET) •3. 心脏收缩性•直接对Isolated heart的效应 •动物导管研究 •超声心动图非侵入型研究4. 心脏的结构和功能

在药物研发过程中，降低高损耗率是制药公司的首要目标。建立药物安全性评价筛选模型，有助于了解候选药物的安全性，减少高损耗率，同时实现药物疗效与潜在不良反应之间的平衡。据估计，大约75%的药物不良反应（ADRs）是剂量依赖性的（A型），可以根据候选化合物的药理学特征（A ADRs）进行预测。A ADRs可分为主要效应与次要效应，主要效应与化合物对其预期靶标的作用有关，而次要效应是由于与主要靶标以外的靶标的相互作用（即脱靶效应）。而脱靶效应往往会导致ADRs，因此，在药物研发早期阶段，对候选药物进行体外药理安全性分析，有利于降低临床研究中的ADRs。同时，在药物研发早期阶段识别脱靶倾向，也有助于制定策略来改进候选药物。脱靶效应可能会导致不良反应或药物研发中断，而体外药理学安全性分析可以检测药物不良反应、预测药物潜在风险和评估药物安全范围。我们根据AstraZeneca，GlaxoSmithKline，Novartis和Pfizer共同建议的检测脱靶效应的44个早期药物安全性靶点，另外增加了46个与中枢神经系统、心血管系统、代谢、免疫等与不良反应相关的重要靶点，发展成目前90个靶点的安全性评价筛选模型。SafetyMax90为临床前候选化合物（PCC）优化提供数据，识别脱靶效应，有利于筛选药物，对候选药物ADRs进行评估与改进。我们通过功能活性筛选的方法评价化合物对靶点的激动或抑制作用，从而评估化合物的安全性，为化合物的后期研究提供参考依据，使客户能够快速、准确地评估、预测和缓解药物ADRs的潜在风险，尽早识别不安全的化合物，并设计、筛选出更好的候选药物，增加上市药物的可能性。图2 爱思益普mini-safety panel安全靶点和验证（部分）北京爱思益普生物科技股份有限公司专注于从靶点发现验证、先导化合物筛选、优化到临床前候选分子阶段的创新药一体化生物学服务平台，覆盖在肿瘤，免疫，心血管，中枢神经系统等疾病领域，整合蛋白科学、酶学、细胞学、体内外药物代谢动力学、药理学等平台，支持创新药物研发项目，支持基础科研与临床转化医学业务