研究某个基因的功能最常用的手段是在宿主细胞中过量表达或者通过RNA干扰的方法knock-down该基因,常规手段有瞬时转染和筛选稳定细胞系。筛选出该基因的过表达或者RNA干扰的稳定细胞系会给您的实验带来极大的便利。有了稳定细胞系,后期的Co-IP或者Pull-Down实验会非常便利;稳定表达重组荧光蛋白的细胞系可以让您动态的观察分子在细胞中的运动。 构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用G418来代替新霉素进行选择性筛选,筛选得到可稳定表达目的蛋白,或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。筛选稳定细胞系的方法1)转染质粒后,单克隆方法筛选稳定细胞系2)慢病毒感染筛选稳定细胞系慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效,是目前主流的稳定细胞系筛选方法。慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达,因此,慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。实验专线：19931682702

脊髓损伤是一种致残率很高的疾 病, 给家庭、社会均带来沉重的负担。 随着工业、建筑业和交通 运输的飞速发展, 脊髓损伤患者数量呈逐年上升趋势。常用的造模方法有以下几种:1)脊髓撞击伤模型2)脊髓压迫伤模型3)脊髓横断损伤4)脊髓牵拉损伤模型5)脊髓缺血性损伤整体课题实验外包：19931682702（同微信）

诱发性肿瘤模型诱发性肿瘤动物模型指使用致癌因素(carcinogens)在实验条件下诱发动物发生肿瘤的动物模型,它是进行实验肿瘤学研究的常用方法.常用于验证可疑致癌因素的作用,也越来越多地应用于肿瘤发生机理的研究及防治效果的观察上,在肿瘤病因学,遗传学,生物学等方面的研究中有重要地位.由于诱发因素和条件可人为控制,诱发率远高于自然发病率,故在肿瘤实验研究中优于自发瘤.复制动物肿瘤的方法很多，如将实验动物用放射线照射或静脉、局部注射放射性同位素；使用各种化学致癌剂（烷化剂、多环芳香烃类、芳香胺类、氨基偶氮染料、亚硝胺类）；使用植物毒素（如苏铁素、Dihydrosafrole等）；使用金属（如铬、镍、砷、镉等）；使用RNA和DNA肿瘤病毒；使用多种致癌性霉菌毒素（其中致癌作用最强者为黄曲霉素）等，均可诱发成各种肿瘤。诱发性肿瘤模型其数量在诱发性动物模型中占首位。一般是利用致癌物质通过口服、注入、埋藏和涂抹等方式使动物发生肿瘤。1．肝癌　二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌：取体重250g左右的封闭群大白鼠，雌雄不拘。按性别分笼饲养。除给普通食物外，饲以致癌物，即用0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为10mg/kg，每周一次，其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用。共约4个月可诱发成肝癌。或单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌：用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2不应超过1.5～2mg/kg，4～6月就有大量的肝癌诱发成功。2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、犬、兔肝癌：给成年大鼠含0.03%2AAF标准饲料。每日每平均2～3mg2AAF（也可将2AAF混于油中灌喂），3～4月后有80～90%动物产生肝肿瘤。二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌：用剂量为每日0.3～14mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予，6～9个月后255/300大鼠发生了肝癌。亚胺基偶氮甲苯（OAAT）诱发小鼠肝癌：用1%OAAF苯溶液（约0.1ml含1mg）涂在动物的两肩胛间皮肤上，隔日一次，每次2～3滴，一般涂100次。实验后7～8周即而出现第一个肝肿瘤，7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。或用2.5mgOAAT溶于葵瓜子油中，给C3H小鼠皮下注射4次，每日间隔10天，也可诱发成肝癌。黄曲霉素诱发大鼠肝癌：每日饲料中含0.001～0.015ppm，混入饲料中喂6个月后，肝癌诱发率达80％。2．胃癌　甲基胆蒽诱发小鼠胃癌：取20g左右的小鼠，无菌手术下，在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC）线结。含MC的线结是用普通细线，在一端打结后，将线结置于盛 有MC小玻璃试管内，在酒精灯上微微加温，使MC液化渗入线结。MC浓度为0.05～0.1g20-甲基胆蒽内浸入10～20根线。手术埋线后4～8个月可诱发成功胃癌。用不对称亚硝胺，剂量为0.25ml/kg体重，3个月后全部动物发生前胃乳头状癌，7～8个月后有85～100%发生前胃癌。昆明种最敏感。A系次之，615系小鼠敏感性最差。此外还可用甲基亚硝基醋酸尿素给BD大鼠饮水中加2mg/kg体重，每周5次饮用，520天后全部大鼠均发生了腺胃癌。3．食管癌 MBNA诱发大鼠食管癌：取体重100g以上的Wistar大鼠，任其食用含MBNA的饮水，并将MBNA掺入饲料中使每日摄入量达0.75～1.5mg/kg体重。80～100天可诱发成食管癌。也可用Dihydrosafrole，它是一种制备啤酒的调味品，在大鼠饲料中加入百万分之二千五百至一万（2500～10000ppm）Dihydrosafrole，就能引起20～75%的食管癌。用0.2%或0.005%的MBNA水溶液，给动物经口灌喂，每天一次，大鼠灌注剂量为1mg/kg体重，至第27天即发现一例食管乳头状瘤，154天发现第一例食管癌，11个月食管癌的发生率为53%。4．肺癌　二乙基亚硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌：小白鼠每周皮下注射1%DEN水溶液一次，每次剂量56mg/kg，DEN总剂量达到868mg，观察时间为100天左右时，发癌率可达40%。而DEN总剂量达到1176mg，观察时间为半年左右时；发癌率可达94%。乌拉坦诱发肺腺癌：小鼠（A系，1～11/2月龄）较大鼠敏感，每次每只腹腔注入10%乌拉坦生理盐水液0.1～0.3ml，间隔3～5日再注，共注2～3个月，每只小鼠用量约为100mg，注后3个月肺腺癌发生率为100%，而且多数为多发性，这种诱发瘤为良性。此外还可用气管内注入苯并芘、硫酸铵气溶胶、甲基胆蒽等诱发肺癌。如猴气管内注入3，4苯并芘（苯并花为3～15mg与等量之Fe2O3混合液），每周一次，共10次，6只猴中有2只诱发肺的鳞状上皮癌。亦有人用硫酸胺气溶剂给100只大鼠吸入，13个月后所有大鼠都发生了肺腺癌。用0.2%明胶作悬浮剂将甲基胆蒽混合后给金地鼠气管内注入，每次0.1ml（含甲基胆蒽5mg）每周一次，共6次，53周后有62.5%动物发生了肺癌。5．鼻咽癌　二甲基胆蒽（MC）诱发大鼠鼻咽癌：取直径2～3mm的硬质塑米管，在酒精灯上小火拉成锥形，每段长约87.5px，管内填以结晶体MC。小管一端用火封闭，以防药物外溢，尖端用针刺数孔，使MC能从小妃溢出。取体重120g左右的大白鼠，雌雄均可，麻醉后，由前鼻孔将上述含MC的塑料小管插入鼻腔，利用前鼻孔较小管粗端为小的特点，稍加用力，迫使小管全部进入鼻腔内，其尖部可达鼻咽腔。不需另加固定，即可使小管长期留于鼻腔内。待到预定时间（半年以上），或动物自行死亡时，到其鼻咽部，10%福尔马林固定，脱钙后，石蜡包埋，进行连续切片。发癌率可达60%以上。二乙基亚硝胺滴鼻法诱发鼻咽癌：取120g左右大白鼠，雌雄均可，麻醉后，用磨平针尖的8号针头，从前鼻孔轻轻插入，针尖可达鼻咽腔。经注射器灌注用1%吐温-80新配的33.3%DEN混悬液0.02ml(含DEN6.7mg)每周1次，共15～20次，可诱发成鼻咽癌。6．宫颈癌　取雌性小白鼠，以附有0.1mgMC的棉纱线结在动物不麻醉的状态下，借助于阴道扩张器及磨纯的弯针，将线穿入宫颈。经右宫角背部穿出，使线结固定于宫颈口。线的另一端则固定于背部肌肉，缝合皮肤，挂线以后，同日开始连续注射青霉素2～3天。以防术后感染。至一定时间（半年左右）处死动物，宫颈组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片。7．结肠癌　给四周龄的雄性大白鼠，皮下注射二甲基苄肼（Dimethlhydrazine,DMH）每周一次，连续21周，每次DMH21mg/kg。最后一次给药后1～4周，处死动物。降结肠部位用Bouin液固定，脱水，石蜡包埋，切片。所用之DMH先配成每100ml含400mg的母液，并加EDTA37mg，用氢氧化纳（0.1N）液将pH调至6.5备用。慢病毒，腺病毒，RNAI，WB，RT-PCR，EMSA，蛋白表达，抗体制备，蛋白组学，质谱分析，基因芯片，micoRNA研究系列，原代培养，动物实验，鸭乙肝新药筛选，心脑血管病新药研究，新药药理学实验实验专线：19931682702（同微信）

细菌16S rDNA菌种鉴定16S rDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因。 长度约为1500pb,是细菌分类学研究中最常用、最有用的"分子钟16S rRNA其大小在1,500 bp左右,所代表的信息量适中,因此是进行分类研究的理想材料。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因,并进行DNA测序,与GenBank中的已知序列进行同源性比较后,判定细菌种类,将细菌划分到属或种服务要求:1. 请提供基因组DNA、经菌种分离后带有单菌落的新鲜平板或斜面。2. 基因组DNA的浓度≥10 ng/μl,总体积≥20 μl,且无明显降解;平板或斜面应长有分离的单菌落。3. 由于革兰氏阳性细菌或厌氧菌、放线菌等特殊菌株,请在服务委托书中加以说明。4. 如果测序结果出现如下套峰,视为样品不纯,本公司将收取全额实验费用。并建议克隆多个测序鉴定。服务基本流程:1. 进行引物设计合成;2. PCR扩增16S rDNA;3. PCR产物纯化;4. 测序,序列比对分析。服务报告内容:实验报告包括PCR产物照片、NCBI序列比对鉴定结果、测序报告、序列碱基图、以及剩余模板(可保存1个月);16S rDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因。 长度约为1500pb,是细菌分类学研究中最常用、最有用的"分子钟16S rRNA其大小在1,500 bp左右,所代表的信息量适中,因此是进行分类研究的理想材料。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因,并进行DNA测序,与GenBank中的已知序列进行同源性比较后,判定细菌种类,将细菌划分到属或种实验热线：19931682702

染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。常见问题:1.ChIP是什么?答:染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。2.ChIP有哪些应用?答:近年来由于该技术不断的发展和完善,其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用,发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用,发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。3.ChIP技术的原理?答:生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。4.做ChIP试验,必须做甲醛固定么?答:不一定,视样品及试验方案而定。做甲醛固定的为X-ChIP,而不需要固定的为N-ChIP。甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。5.为什么必须将DNA切碎至少于1000bp大小(大约3个核小体 ~400-500bp)?答:为确保ChIP实验有良好精度。若您的平均片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含您目标序列的DNA,但所要研究的蛋白会离您目标序列有700个核苷酸的距离。6.为什么使用鲑鱼精子DNA来封闭琼脂糖珠子?为什么我的样品中鲑鱼精子DNA不会发生PCR反应?答:鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。实验者不太可能对鲑鱼组织做ChIP实验,所以此DNA不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。7.引物最佳设计是什么样的?答:引物长度应为24个核苷酸,应含有50%GC碱基对,Tm值为60°C。不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。不必考虑基因组内不独一序列。8.您推荐下如何从琼脂糖(或琼脂糖凝胶)中洗脱抗体-蛋白-DNA复合物,用来做re-ChIP试验?答:在ChIP分析试剂盒内可找到洗脱缓冲液,用它洗脱复合物。对于re-ChIP,有必要添加蛋白酶抑制剂到免疫沉淀洗液和洗脱缓冲液,及第二轮实验用的稀释缓冲液。请确定所有溶液处于低温,蛋白质不会因此而在收集第一次免疫沉淀的复合物或第二次免疫沉淀时降解。9.蛋白A琼脂糖能被用于小鼠IgM?答: 蛋白质A不能与小鼠IgM结合。可以考虑用一个桥接抗体连接。10.在做ChIP之前,有办法纯化细胞核么?答: 在细胞与甲醛交联后,细胞核可通过“溶胀缓冲液”培育及剪刀细胞均质器(dounce homogenization)制备(至少10倍体积)。   溶胀缓冲液:   25M Hepes, pH 7.8   1.5mM MgCl2   10mM KCl   0.1% NP-40   1mM DTT   0.5mM PMSF   蛋白酶抑制剂混合剂   然后按照protocol在SDS裂解液中裂解11.ChIP超声波的最佳条件?答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。12.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:13.ChIP超声波的最佳条件?答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。14.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:15.什么是input DNA? Output DNA?从染色质上获得的未做过IP的已经被逆转交联的DNA. 它是检查PCR是否有效的对照。Output DNA是来自每次IP实验的DNA.其实就是genomic DNA. 在ChIP实验中, sonication 或酶解后, 样本取部分不做IP, 直接逆转交联. 它的最主要的作用就是检查PCR系统是否work. 通常情况下, 在该条道中,都可以看到条带的.如果没有,说明PCR系统不work.16.为什么ChIP试验需要用经验证的抗体?抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的,有的抗体识别的抗原表位比较小,不容易暴露,在ChIP实验中容易被DNA包裹,从而使抗体无法结合,因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的,商业化的抗体都应该是验证过的。17.什么是reChIP技术?ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为 通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作

糖尿病(diabetes mellitus ,DM)已成为严重危害人类健康的公共卫生问题。DM及其并发症不仅严重影响糖尿病患者的生活质量,同时也是致残、致死的重要原因。因此,建立合适的糖尿病动物模型,阐明DM及其并发症的发病机制就显得尤为重要。目前,DM动物模型制备方法主要有:手术切除胰腺、化学药物诱导、自发性糖尿病动物模型、转基因动物等。一、切除胰腺的DM模型常采用大鼠造模,全部或大部分切除实验动物的胰腺,但保存胰十二指肠动脉吻合弓。如果连续两天血糖值超过11.1mmol/L或者葡萄糖耐量试验120min时的血糖值仍未恢复到注射前水平则认为DM造模成功。其机制是全部或大部分切除胰腺后,β细胞缺失而产生永久性DM。二、化学药物诱发的DM模型采用链脲佐菌素腹腔注射或四氧嘧啶静脉注射可诱发DM,常用动物有小鼠、大鼠、家兔和犬。链脲佐菌素(streptozotocin STZ)的参考剂量为50～150mg/kg;四氧嘧啶(alloxan)的参考剂量为60～110mg/kg。STZ是一种含亚硝基的化合物,进入体内可通过以下机制特异性地破坏胰岛β细胞:(1)STZ直接破坏胰岛β细胞:主要见于注射大剂量STZ后。STZ注射后可引起β细胞内辅酶I(NAD)的浓度下降,NAD依赖性能量和蛋白质代谢停止,导致β细胞死亡;(2)通过诱导一氧化氮(NO)的合成,破坏胰岛β细胞;(3)STZ激活自身免疫过程,进一步导致β细胞的损害:小剂量注射STZ可破坏少量胰岛β细胞,死亡的胰岛β细胞可作为抗原被巨噬细胞吞噬,产生TH1刺激因子,使TH1细胞系占优势而产生IL-2及IFN-γ,在胰岛局部促使炎性细胞浸润,并活化释放IL-1、TNF-α、IFN-γ、NO和H2O2等物质杀伤细胞。死亡细胞又可作为自身抗原,再次递呈给抗原递呈细胞进行处理,释放细胞因子,放大细胞损伤效应,最终诱发DM。四氧嘧啶进入体内后能迅速被胰岛β细胞摄取,影响细胞膜的通透性和细胞内ATP的产生,抑制葡萄糖介导的胰岛素分泌。四氧嘧啶主要通过产生氧自由基破坏β细胞结构,导致细胞的损伤及坏死,从而阻碍胰岛素的分泌,使血清胰岛素水平降低。因为四氧嘧啶导致糖尿病的同时也造成肝、肾组织中毒性损害并且部分采用四氧嘧啶制造的DM动物模型可自发缓解,因此目前已经很少应用。三、自发性糖尿病动物模型该模型绝大多数采用有自发性DM倾向的近交系纯种动物,如BB(Biobreeding)鼠、NOD(non-obesity diabetes)小鼠、G(Goto-kakisaki)鼠和中国地鼠(chinese hamster)等动物造模。自发性DM动物模型是指动物未经过任何有意识的人工处置,在自然情况下发生DM的动物模型。已用于研究的自发性DM动物约有20种,可分为两类:一类为缺乏胰岛素,起病快、症状明显,并伴有酮症酸中毒,如BB(Biobreeding)鼠、NOD(non-obesity diabetes)小鼠和LETL大鼠,它们可以作为1型DM的动物模型使用。这些动物没有肥胖,发病之初呈现胰腺炎的症状,人类组织相关性抗原(MHC)参与发病过程,这些都与人1型DM的特征相似。利用这些模型可以对人1型DM的发病机制进行深入研究;另一类为胰岛素抵抗性高血糖症,其特点是病程长,不发生酮症酸中毒,为2型DM动物模型。实验热线：19931682702

6-OHDA损毁MFB造成的大鼠PD模型有两个明显的弊端:一是神经元急性死亡。6-OHDA注入后15分钟即可检测到DA含量的下降,在第30-60分钟时更加明显,3-5天内绝大多数神经元死亡。二是损伤严重。经APO诱发旋转7圈/分以上者,黑质内多巴胺能神经元的死亡率已经超过90%。可见这种模型对于研究多巴胺能神经元慢性进行性病变的全过程不甚理想。但由此得到启发,人们发现机械损伤MFB同样可以造成黑质内的多巴胺能神经元变性坏死,并且这种变化呈现慢性、进行性过程。已经建立的造模方法有MFB轴突切断术(medial forebrain bundle axotomy)和中脑半切术(hemitransection of midbrain)。(一)大鼠MFB切断术:1.操作步骤Wistar大鼠,雌性,体重185-210g。常规注射水合氯醛麻醉后,置于Kopf立体定位仪上固定。切开皮肤,暴露颅骨前囟。选择部位在前囟后3.8mm,中线旁开2.4mm处打孔。将Kopf公司(Kopf Instruments,Tuyunga,CA,USA)生产的可伸缩电线刀(retractable wire knife)垂直伸入孔内达颅骨平面下8mm处,固定外套管,将电线刀的刀刃由外套管中推出2.0-3.0mm。上提电线刀约2.5mm,然后下放回原处。再重复一次,以保证MFB充分切断。然后回收刀刃,退出电线刀。缝合皮肤(Lapchak PA等,1993)。2.模型检测(1)旋转行为学检测:术后4周,将大鼠腹腔内注射AMPH(5mg/kg)诱发大鼠旋转。计数90分钟内的旋转次数。(2)其它检测:病理和生化检测与6-OHDA损毁模型同。(二)中脑半切术(hemitransection of midbrain)1.操作步骤SD大鼠,雌雄不拘,体重200-250g。常规方法麻醉,立体定位仪上固定和暴露颅骨前后囟。在前囟后1mm,中线旁开0.5mm处打孔。将以特制的4mm宽的刀,沿与颅骨成68度角的方向,斜插入9mm,然后将刀退出。缝合皮肤。(Toffano G等,1984)2.模型检测(3)旋转行为学检测:术后8周,皮下注射APO(0.25mg/kg),诱发大鼠向健侧旋转。(4)其它检测:病理和生化检测与6-OHDA损毁模型相似。

实验流程1、基因优化:靶基因序列设计,密码子优化并合成目的基因。2、载体-宿主系统优化:根据蛋白特性构建表达载体,转化质粒到高效表达的大肠杆菌中。3、表达条件优化:对重组的大肠杆菌进行摇瓶培养,并通过SDS-PAGE电泳检测对表达条件(时间、温度、IPTG浓度)进行严格控制和优化。4、纯化蛋白:对表达的蛋白采用亲和,离子或凝胶过滤层析等方法进行纯化。首选上清,次选蛋白复性。对实验用SDS-PAGE和Western Blot验证目标蛋白纯度正确性,按照客户要求进行分装或冻干。须知1、无污染的质粒,最小量不得低于100ng2、原始质粒图谱及序列文件3、插入基因后质粒的商业测序报告4、目标蛋白质相关信息5、最终蛋白一般保存在常规的缓冲液中(Tris-HCl,PBS)

酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。复性原理:在电泳过程中,SDS与样品中的MMPs结合(当然是可逆性结合),破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用,而只有当将胶置Trition中洗脱(最好是放在摇床上摇,30min/次,做2次或15min/次,4次。静置于Trition中是不妥的。)时,由于SDS被Trition结合而去除,从而使MMPs恢复了活性。

克隆形成试验可反映细胞群体依赖性和增殖能力。一般细胞在体外增殖六代以上,其后代形成的细胞群体称为细胞集落或克隆。每个克隆由单一细胞而来,含有50个以上细胞,大小在0.3-1mm之间。通过克隆形成可检测各种理化因素对细胞克隆形成能力的影响。平板克隆形成试验可检测贴壁细胞细胞的克隆形成能力,软琼脂集落形成试验可检测非锚着依赖生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系等。基本步骤:1、取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%流程:1) 项目方案的确定,包括目的细胞、细胞处理方式及处理时间等。2) 细胞培养3) 克隆形成实验4) 克隆形成实验图片及实验报告实验热线：19931682702（同微信）