模型制作方法:

SD大鼠,7日龄,体重11-17g。新生大鼠清醒局部麻醉状态下,行右侧颈总动脉结扎术,再将动物置于恒温密闭玻璃容器中,通以8%O2+92%N2的混合气体,2h后取出,造成幼鼠窒息脑瘫模型。

观察指标与分析:

症状观察;

头部血流量测定;

脑组织水含量测定;

脑组织中NO含量测定;

脑组织中丙二醛含量测定。

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6-OHDA损毁MFB造成的大鼠PD模型有两个明显的弊端:一是神经元急性死亡。6-OHDA注入后15分钟即可检测到DA含量的下降,在第30-60分钟时更加明显,3-5天内绝大多数神经元死亡。二是损伤严重。经APO诱发旋转7圈/分以上者,黑质内多巴胺能神经元的死亡率已经超过90%。可见这种模型对于研究多巴胺能神经元慢性进行性病变的全过程不甚理想。但由此得到启发,人们发现机械损伤MFB同样可以造成黑质内的多巴胺能神经元变性坏死,并且这种变化呈现慢性、进行性过程。已经建立的造模方法有MFB轴突切断术(medial forebrain bundle axotomy)和中脑半切术(hemitransection of midbrain)。

(一)大鼠MFB切断术: 

1.操作步骤 

Wistar大鼠,雌性,体重185-210g。常规注射水合氯醛麻醉后,置于Kopf立体定位仪上固定。切开皮肤,暴露颅骨前囟。选择部位在前囟后3.8mm,中线旁开2.4mm处打孔。将Kopf公司(Kopf Instruments,Tuyunga,CA,USA)生产的可伸缩电线刀(retractable wire knife)垂直伸入孔内达颅骨平面下8mm处,固定外套管,将电线刀的刀刃由外套管中推出2.0-3.0mm。上提电线刀约2.5mm,然后下放回原处。再重复一次,以保证MFB充分切断。然后回收刀刃,退出电线刀。缝合皮肤(Lapchak PA等,1993)。

2.模型检测

(1)旋转行为学检测:术后4周,将大鼠腹腔内注射AMPH(5mg/kg)诱发大鼠旋转。计数90分钟内的旋转次数。

(2)其它检测:病理和生化检测与6-OHDA损毁模型同。

(二)中脑半切术(hemitransection of midbrain)

1.操作步骤

SD大鼠,雌雄不限,体重200-250g。常规方法麻醉,立体定位仪上固定和暴露颅骨前后囟。在前囟后1mm,中线旁开0.5mm处打孔。将以特制的4mm宽的刀,沿与颅骨成68度角的方向,斜插入9mm,然后将刀退出。缝合皮肤。(Toffano G等,1984)

2.模型检测

(3)旋转行为学检测:术后8周,皮下注射APO(0.25mg/kg),诱发大鼠向健侧旋转。

(4)其它检测:病理和生化检测与6-OHDA损毁模型相似。

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肽链的设计

多肽是复杂的大分子,每条序列在物理和化学特性上都是独特的,研究人员设计多肽时应考虑到合成,纯化以及溶解等过程中的难度,从而能够使用该多肽达到自己的实验目的。以下是设计过程中的一些建议:

如何降低肽链合成的难度

1、减少序列长度

2、减少疏水性残基数

3、减少困难残基

如何增强肽链的可溶性

1、改变N端或C端

2、缩短或加长序列

3、加入可溶性残基

4、通过置换一个或多个残基改变序列

5、通过选用不同框架来改变序列

多肽保存

1、冻干多肽可在-20度保存或室温保存  

2、溶液肽远比冻干形式不稳定,溶液应为中性PH(5-7)-20度保存。  

3、为避免样品的反复冻融,最好分成小样存放。

多肽的溶解

大多数多肽的首选溶剂是超纯抽气水,稀乙酸或氨水分别对碱性或酸性多肽的溶解也有帮助。如果这些方法用过后还不溶解的多肽,建议用DMF,脲,guanidiniam,chloride,acetonitnle来溶解。

多肽的用途

主要用于抗体的制备,多肽疫苗,多肽微注射剂对基因结构与功能关系的研究。本公司提供不同纯度的多肽,多粗提产物到98%的医药级别,客户可根据需求进行选择。

>80% :免疫学应用,多克隆抗体制备

>90%:SAR研究,生物测定

>95%:NMR,结晶化,体外生物测定

>98%:NMR,结晶化,敏感的生物测定

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我实验室自有动物实验中心，可以对候选药物进行筛选，用来提高新药研发的成功率，减少研发费用，缩短新药的研发时间。

细胞水平的药物筛选是种简单易行的检测药物在细胞中功能的方法。实验成本低、周期短、重复性好，可作为早期药物筛选的有效方法。

建立的多种药物体外筛选模型，可为药物的药效提供有效的评价，作为早期药物筛选的有效方法。

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类风湿性关节炎(RA)的病因与病理一直是医药工作者研究的热点,建立起理想的动物模型是十分必要的。近年来报道较多的是Ⅱ型胶原(CⅡ)和不完全弗氏佐剂(IFA)混合注射所致的关节炎模型(CIA)及弗氏完全佐剂诱导的佐剂动物关节炎模型。胶原关节炎模型比佐剂关节炎模型更接近人类RA的病理特征。本实验根据文献[1]的研究结果,为了更有效地观察到关节骨破坏模型,对传统的方法进行改良后得到大鼠类风湿颞下颌关节炎动物模型。

  1 材料与方法

  1.1 实验动物:Wistar大鼠48只,雌性,5周龄,体重约(120±15)g,随机分成两组,正常对照组、实验组各24只。

  1.2 主要试剂:牛源性Ⅱ型胶原蛋白(Collagen Ⅱ),弗氏不完全佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant,IFA),美国Sigma公司产品。

  1.3 方法

  1.3.1 诱导产生大鼠类风湿颞下颌关节炎模型:剃除大鼠背部周围毛,取配置好的乳剂100μl,自鼠尾部开始,在脊柱两旁皮下多点注射,每只鼠注射1.0ml,1周后加强免疫1次,注射0.5ml/只。建立胶原诱导的大鼠实验性关节炎动物模型。对照组用生理盐水同期注射。

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铝诱导痴呆模型是以阿尔茨海默型痴呆的铝中毒假说为基础的。铝具有神经毒性,据报道,阿尔茨海默型痴呆者脑组织内铝的含量明显比正常人高,其原因可能是病人血液中铁蛋白有缺陷,无法将血液中的铝适当的清除,多余的铝进入大脑后参与形成神经元纤维缠结和老年斑,损伤神经元,导致神经元纤维变性,大脑皮质萎缩。

模型制作方法: Wistar大鼠,雄性,体重200-220g。大鼠每天灌胃,连续30天。

观测指标与分析 : 海马内淀粉样前提蛋白阳性神经元数量计数:与正常组相比,模型组大鼠背海马和齿状回内前提蛋白阳性神经元明显增加。

我实验室自有动物实验中心，可以对候选药物进行筛选，用来提高新药研发的成功率，减少研发费用，缩短新药的研发时间。

细胞水平的药物筛选是种简单易行的检测药物在细胞中功能的方法。实验成本低、周期短、重复性好，可作为早期药物筛选的有效方法。

建立的多种药物体外筛选模型，可为药物的药效提供有效的评价，作为早期药物筛选的有效方法。

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研究某个基因的功能最常用的手段是在宿主细胞中过量表达或者通过RNA干扰的方法knock-down该基因,常规手段有瞬时转染和筛选稳定细胞系。

筛选出该基因的过表达或者RNA干扰的稳定细胞系会给您的实验带来极大的便利。有了稳定细胞系,后期的Co-IP或者Pull-Down实验会非常便利;稳定表达重组荧光蛋白的细胞系可以让您动态的观察分子在细胞中的运动。 构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用G418来代替新霉素进行选择性筛选,筛选得到可稳定表达目的蛋白,或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

筛选稳定细胞系的方法

1)转染质粒后,单克隆方法筛选稳定细胞系

2)慢病毒感染筛选稳定细胞系

慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效,是目前主流的稳定细胞系筛选方法。慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达,因此,慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。

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染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。

常见问题:

1.ChIP是什么?

答:染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。

2.ChIP有哪些应用?

答:近年来由于该技术不断的发展和完善,其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用,发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用,发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。

3.ChIP技术的原理?

答:生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。

4.做ChIP试验,必须做甲醛固定么?

答:不一定,视样品及试验方案而定。做甲醛固定的为X-ChIP,而不需要固定的为N-ChIP。甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

5.为什么必须将DNA切碎至少于1000bp大小(大约3个核小体 ~400-500bp)?

答:为确保ChIP实验有良好精度。若您的平均片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含您目标序列的DNA,但所要研究的蛋白会离您目标序列有700个核苷酸的距离。

6.为什么使用鲑鱼精子DNA来封闭琼脂糖珠子?为什么我的样品中鲑鱼精子DNA不会发生PCR反应?

答:鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。实验者不太可能对鲑鱼组织做ChIP实验,所以此DNA不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。

7.引物最佳设计是什么样的?

答:引物长度应为24个核苷酸,应含有50%GC碱基对,Tm值为60°C。不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。不必考虑基因组内不独一序列。

8.您推荐下如何从琼脂糖(或琼脂糖凝胶)中洗脱抗体-蛋白-DNA复合物,用来做re-ChIP试验?

答:在ChIP分析试剂盒内可找到洗脱缓冲液,用它洗脱复合物。对于re-ChIP,有必要添加蛋白酶抑制剂到免疫沉淀洗液和洗脱缓冲液,及第二轮实验用的稀释缓冲液。请确定所有溶液处于低温,蛋白质不会因此而在收集第一次免疫沉淀的复合物或第二次免疫沉淀时降解。

9.蛋白A琼脂糖能被用于小鼠IgM?

答: 蛋白质A不能与小鼠IgM结合。可以考虑用一个桥接抗体连接。

10.在做ChIP之前,有办法纯化细胞核么?

答: 在细胞与甲醛交联后,细胞核可通过“溶胀缓冲液”培育及剪刀细胞均质器(dounce homogenization)制备(至少10倍体积)。

   溶胀缓冲液:

   25M Hepes, pH 7.8

   1.5mM MgCl2

   10mM KCl

   0.1% NP-40

   1mM DTT

   0.5mM PMSF

   蛋白酶抑制剂混合剂

   然后按照protocol在SDS裂解液中裂解

11.ChIP超声波的最佳条件?

答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。

   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。

   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。

   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。

   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。

   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。

12.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?

答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:

13.ChIP超声波的最佳条件?

答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。

   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。

   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。

   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。

   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。

   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。

14.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?

答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:

15.什么是input DNA? Output DNA?

从染色质上获得的未做过IP的已经被逆转交联的DNA. 它是检查PCR是否有效的对照。Output DNA是来自每次IP实验的DNA.

其实就是genomic DNA. 在ChIP实验中, sonication 或酶解后, 样本取部分不做IP, 直接逆转交联. 它的最主要的作用就是检查PCR系统是否work. 通常情况下, 在该条道中,都可以看到条带的.如果没有,说明PCR系统不work.

16.为什么ChIP试验需要用经验证的抗体?

抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的,有的抗体识别的抗原表位比较小,不容易暴露,在ChIP实验中容易被DNA包裹,从而使抗体无法结合,因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的,商业化的抗体都应该是验证过的。

17.什么是reChIP技术?

ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为 通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作

细胞培养技术也叫细胞克隆技术,在生物学中的正规名词为细胞培养技术。细胞培养,既包括微生物细胞的培养,细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞,这是克隆技术必不可少的环节,而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来,所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。

细胞的生长需要营养环境,用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。细胞培养泛指所有体外培养,其含义是指从动物活体体内取出组织,于模拟体内生理环境等特定的体内条件下,进行孵育培养,使之生存并生长。细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域,成为最重要的基础科学之一。

优点

1、能长期传代,保持活性,便于监控检测结构功能和生命活动。

2、培养条件可以人为的控制便于研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响

3、可用于各种观察和检测手段研究活细胞的变化(变异、分化)。可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达。

4、研究范围和细胞来源广泛,选择性广。

5、不同代次细胞可长期保存,既可开展同代次不同条件和方法研究,又可观察不同代次的动态变化。

6、耗资少、经济、成本低、可大量培养,利于生物制品的生产。

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