趋化因子(chemokines)是一类由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白，具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力，通过与G蛋白偶联跨膜受体(称为趋化因子受体，选择性地表达在靶细胞表面)相互作用来发挥其生物学效应。根据结构（氨基端（N端）半胱氨酸的排列方式），趋化因子被分为四个主要亚家族：CXC（CXCL1-17）、CC（CCL1-28）、XC（XCL1、XCL2）和CX3C（CX3CL1）四个亚族。 CC趋化因子亚族又称β趋化因子亚家族，其氨基末端有2个相近的半胱氨基结构。CC趋化因子亚族包含27种类型，依次为CCL1-CCL28（其中CCL10与CCL9相同），是一类可引起免疫细胞定向迁移至炎症部位的小分子分泌性蛋白。常见的有嗜酸性粒细胞趋化因子、单核细胞趋化蛋白及其他细胞亚群的趋化因子等。其受体有10个，分别为CCR1-CCR10。CC型趋化因子可趋化淋巴细胞、单核细胞、酸性粒细胞等细胞的游走趋化，在炎症反应、清除抗原、细菌感染等方面起着重要作用。CC趋化因子亚族列表CC趋化因子具有促癌和抗癌双重特性，主要对中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、树突细胞、NK细胞、T和B淋巴细胞等具有强大的趋化活性。比较重要的有：单核细胞趋化蛋白(MCP-1/CCL2)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP/CCL3)、RANTES/CCL5等。01CCL2在肿瘤侵袭转移中的作用  CCL2在肿瘤微环境中由肿瘤细胞和基质细胞表达，在肿瘤原发部位诱导肿瘤细胞增殖，刺激肿瘤细胞向周围细胞外基质迁移和侵袭，随后CCL2促进肿瘤细胞内渗进入循环，可能是通过招募宿主骨髓细胞来促进这一过程。一旦进入血液循环，CCL2可能会引导癌细胞沿着趋化梯度向转移部位扩散。肿瘤细胞被困在小毛细血管中会引发肿瘤细胞外渗，这种外渗进一步受到CCR2+髓系细胞和CCR2+内皮细胞的支持。最后，CCL2通过募集更多的骨髓细胞和内皮细胞促进转移部位的肿瘤生长和肿瘤定植。[1]02CCL3在白血病骨髓微环境中的作用  在白血病BM微环境(蓝色阴影区域)中，CCL3可诱导支持白血病细胞优势增殖的多个过程:(1)正常龛细胞向白血病适应细胞的转化;(2)选择性抑制正常HSPCs;(3)从BM中动员正常HSPCs。缩写:BM，骨髓;HSPC，造血干/祖细胞。[2]03CCL20在癌症中的作用  CCL20-CCR6信号通路通过增强癌细胞的迁移和增殖直接促进癌症进展，通过免疫细胞控制重塑肿瘤微环境间接促进癌症进展。[3]靶向趋化因子及其受体治疗人类肿瘤、自身免疫性疾病和慢性炎症愈发受到重视。然而，到目前为止针对趋化因子和趋化因子受体的药物研发才刚刚起步。已获批的抗体药物有CCR4抗体（Mogamulizumab）和CXCL8（IL-8）抗体ABCream。为了推动靶向趋化因子的药物开发，百奥动物自主研发了一系列趋化因子人源化动物&细胞模型。B-hCCL2 mice蛋白表达分析ELISA法检测纯合B-hCCL2小鼠种属特异性CCL2表达分析。收集野生型小鼠和纯合B-hCCL2小鼠体内抗mCD3ε抗体刺激4h的血清，用种属特异性CCL2 ELISA试剂盒进行ELISA分析。小鼠CCL2仅在野生型小鼠中可检测到。人CCL2仅在纯合B-hCCL2小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中未检测到。B-hCCL3 mice蛋白表达分析ELISA法检测纯合B-hCCL3小鼠种属特异性CCL3表达分析。从野生型小鼠和纯合B-hCCL3小鼠中分离骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，体外用10 ng/mL LPS刺激，用种属特异性CCL3 ELISA试剂盒ELISA分析细胞培养上清液。在野生型小鼠中可检测到小鼠CCL3。人CCL3仅在纯合B-hCCL3小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中未检测到。B-hCCL20 mice蛋白表达分析ELISA法检测纯合B-hCCL20小鼠中种属特异性CCL20表达分析。收集野生型小鼠和纯合B-hCCL20小鼠胸腺研磨上清，用种属特异性CCL20 ELISA试剂盒进行ELISA分析。在野生型小鼠中可检测到小鼠CCL20。人CCL20仅在纯合B-hCCL20小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中未检测到。B-hCCL22 mice蛋白表达分析ELISA法对野生型小鼠和B-hCCL22小鼠中CCL22表达进行种属特异性分析。收集野生型小鼠和纯合B-hCCL22小鼠胸腺匀浆，用种属特异性CCL22 ELISA试剂盒进行ELISA分析。在野生型小鼠中可检测到小鼠CCL22。人CCL22 仅在纯合B-hCCL22小鼠中可检测到，但在野生型小鼠中未检测到。数值表示为平均值±SEM。ND：未检出。B-hCCR8/hCCL1 mice肿瘤微环境中CCL1的检测ELISA法检测C57BL/6和B-hCCR8/hCCL1荷瘤MC38细胞小鼠肿瘤微环境中CCL1。将小鼠结肠癌MC38细胞皮下植入C57BL/6和B-hCCR8/hCCL1小鼠（n=2或3）。当肿瘤体积约为600mm3时取肿瘤组织，并通过ELISA进行分析。在纯合B-hCCR8/hCCL1小鼠中可检测到人CCL1，含量约为150 pg/mg总蛋白。不同小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的比较不同小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞分析。B-hCCR8/hCCL1小鼠Treg细胞百分比（Th细胞%）与C57BL/6小鼠和B-hCCR8小鼠相比无显著差异。B-hCCL2 MC38蛋白表达分析ELISA法对B-hCCL2 MC38细胞中CCL2的表达进行分析。在B-hCCL2 MC38细胞的上清液中检测到人CCL2，但在野生型MC38细胞中未检测到。在野生型MC38细胞上清液中未检测到小鼠Ccl2。使用B-hCCL2 MC38细胞的2-D07克隆进行体内实验。肿瘤生长曲线和体重变化B-hCCL2 MC38细胞皮下同种移植瘤生长。将B-hCCL2 MC38细胞(5x105)和野生型MC38细胞(5x105)皮下植入C57BL/6N小鼠(雌性，7周龄，n=5)。每周测量两次肿瘤体积和体重。(A)平均肿瘤体积±SEM。(B)体重(平均值±SEM)。体积用mm3表示，公式为:V=0.5×长直径×短直径2。如A图所示，B-hCCL2 MC38细胞能够在体内建立肿瘤，并可用于疗效研究。B-Tg(hCCL1) MC38肿瘤浸润淋巴细胞分析与MC38细胞相比，荷瘤B-Tg(hCCL1)MC38细胞中CD3+ T细胞、CD4+ T细胞和Treg细胞占CD45+细胞的百分比显著增加。数据表示为平均值±SEM，采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验，与其他列进行比较(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)肿瘤生长曲线和体重变化B-Tg(hCCL1) MC38细胞皮下同种移植物肿瘤生长。B-Tg(hCCL1) MC38细胞(5x105)和野生型MC38细胞(5x105)皮下植入B-hCCR8小鼠(雌性，8周龄，n=7)。每周测量两次肿瘤体积和体重。(A)平均肿瘤体积±SEM。(B)体重(平均值±SEM)。体积用mm3表示，公式V=0.5×长径×短径2。如A图所示，B-Tg(hCCL1) MC38细胞能够在体内建立肿瘤，并可用于疗效研究。B-Tg(mCcl2) MC38肿瘤生长曲线和体重变化B-Tg(mCcl2) MC38细胞皮下同种移植肿瘤生长。将B-Tg(mCcl2) MC38细胞(5x105)和野生型MC38细胞(5x105)皮下植入C57BL/6小鼠(雌性，6周龄，n=5)。每周测量两次肿瘤体积和体重。(A)平均肿瘤体积±SEM。(B)体重(平均值±SEM)。体积用mm3表示，公式为:V=0.5×长直径×短直径2。如A图所示，B-Tg(mCcl2) MC38细胞能够在体内形成肿瘤，可用于疗效研究。肿瘤中mCcl2的表达分析实验结束时采集肿瘤细胞，ELISA检测小鼠Ccl2表达。如图所示，小鼠Ccl2在肿瘤匀浆中高表达。数据表示为平均值±SEM，采用T检验进行分析并与G1进行比较。(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)参考资料1、Lim, Su et al. Oncotarget. 7 (2016).2、Baba T ,  Mukaida N . Role of macrophage inflammatory protein (MIP)-1α/CCL3 in leukemogenesis[J]. Molecular & Cellular Oncology, 2014, 1(1):-.3、Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5186

肿瘤治疗药物是全球最大和增长最快的药物细分市场，近年来，疫苗开发也已经成为癌症这一重大疾病新治疗选择的一个热门研究方向。相比全球疫苗市场，全球肿瘤疫苗市场规模增长更快，2019年为46亿美元，预计到2024年将达到101亿美元，复合年增长率为17.28%。01肿瘤疫苗简介疫苗是指含有抗原、能够诱导人体产生特异性主动免疫的制剂，它可以保护机体免受感染源、毒素，以及感染源引起的抗原性物质的损伤。肿瘤疫苗作为肿瘤治疗的新方向，已成为当今肿瘤研究的热点话题。肿瘤疫苗（又称癌症疫苗）通常是含有肿瘤特异性抗原（TSA）或肿瘤相关抗原（TAA）的肿瘤细胞或碎片或片段，可分为肿瘤预防性疫苗（如HPV疫苗）和肿瘤治疗性疫苗（如新抗原mRNA疫苗），主要由肿瘤抗原、制剂、免疫佐剂和递送载体4个关键成分组成。进入人体后，癌症疫苗可激活患者自身免疫系统，诱发特异性免疫反应，克服免疫抑制状态，提高对特定肿瘤的抵抗，是一种主动免疫治疗方法。对于已经发生癌症的患者来说，治疗性疫苗或可延长他们的生存期，成为救命稻草。肿瘤疫苗作为一种新兴的治疗手段，究竟“优秀”在何处呢？肿瘤疫苗组成因素[1]首先，治疗性肿瘤疫苗可通过主动免疫方式诱导全身性的特异性抗瘤效应，与手术治疗、放射治疗相比，作用范围更广泛，特别适用于多发病灶性肿瘤、广泛转移性瘤或非实体性肿瘤(如白血病)；其次，肿瘤疫苗可调动机体自身的力量达到抗肿瘤作用，与放射治疗、化学药物治疗相比不良反应小、特异性高。尽管各种治疗性肿瘤疫苗的设计思想各不相同，诱导免疫应答的方式不同，抗瘤效应各有特点，但不论采用何种方法制备，都是围绕如何提高肿瘤抗原的免疫原性以及如何打破肿瘤免疫耐受这一最关键的核心问题展开的。一种理想的肿瘤疫苗不但能够诱导主动性免疫，刺激荷瘤宿主产生有效的免疫应答，同时还应当是安全的和无不良反应的；不仅能特异性地消除扩散的肿瘤细胞，而且更为重要的是，还能提供保护性的预防肿瘤复发的长期免疫记忆功能。02肿瘤疫苗是如何发挥作用的？肿瘤疫苗通过利用肿瘤细胞相关抗原，来唤醒人体针对癌症的免疫系统功能。目标是预防和治疗癌症，或防止癌症的复发。而肿瘤疫苗想在人体中发挥作用，离不开人类MHC（即HLA复合体）的抗原呈递过程。肿瘤疫苗的作用过程为：通过皮下/肌肉注射使抗原进入机体内，被DC细胞摄取。DC细胞通过淋巴管的归巢进入淋巴结，在淋巴结中存在有大量初始T细胞。通过与APC细胞表面的MHC I/II 类分子结合，初始T细胞被激活为CD8或CD4阳性T细胞。激活的T细胞通过血液循环进入肿瘤部位，从而实现对肿瘤细胞的杀伤。T细胞激活与肿瘤细胞杀伤机制[2]03百奥赛图可提供肿瘤疫苗相关临床前安全性及药效评价在进行临床试验之前，疫苗与治疗性药物一样，也需要进行临床前动物安全性评价。临床前动物安全性评价的主要目的是通过相关动物来考察疫苗的安全性，包括对免疫器官和其他毒性靶器官的影响、毒性的可逆性，以及与临床相关的参数，预测其在大规模人群中使用时可能出现的不良反应，降低临床试验受试者和临床使用者承担的风险，并为临床试验方案的制定提供依据。百奥赛图具有完善的临床前药效评价平台，能够从小鼠免疫，肿瘤药效，免疫原性评估提供肿瘤疫苗临床前评价一站式服务，评估抗肿瘤免疫反应。百奥赛图服务能力概览肿瘤药效稳定的肿瘤模型减小对试验设计和疫苗评价的影响，治疗给药与rechallenge实验检测疫苗有效性。 细胞免疫1. 可采用ICS、ELISA、Luminex、MSD等方法检测细胞因子。2. ELISPOT检测T细胞免疫反应Positive Control：加入工作浓度的阳性刺激物；Negative Control：细胞浓度跟实验孔保持一致，不加阳性刺激物；Background：加入不含细胞的培养基，不加阳性刺激物。3. 可用FACS方法检测T/B/NK细胞以及各T细胞亚群比例小鼠肿瘤模型TILS检测与细胞分型生物标记物免疫细胞及小鼠体内标记物4. 此外，我们还能提供体外T细胞杀伤、四聚体检测等服务。体液免疫百奥赛图能够定制化进行肿瘤特异性抗体检测的ELISA方法开发和方法学验证。04百奥赛图上市多款HLA人源化小鼠我们使用HLA人源化小鼠细胞能呈递和识别与人类呈递的表位相似或相同的肽表位。百奥赛图已上市多款HLA人源化小鼠，可助力疫苗领域的研发。下面以B-HLA-A2.1 mice的数据为例：IFN-γ ELISA实验检测B-HLA-A2.1小鼠疫苗诱导的免疫应答。将9-10周龄雌性 B-HLA-A2.1小鼠分为 PBS 组，Group2和Group 3 (n=2)共三组 ，在小鼠双腿内侧肌肉接种 PBS 或疫苗。最后一次免疫三周后处死小鼠。取小鼠脾细胞，用单肽或与靶标无关的多肽作为阴性对照(NC)或anti-mCD3作为阳性对照刺激，然后测定 IFN-γ 的分泌量。各组间体重无显著差异(数据未显示)。(A) 显示用阴性对照、肽疫苗或阳性对照刺激后的免疫小鼠脾细胞。(B) IFN-γ分泌量。结果表明，B-HLA-2.1小鼠为疫苗的体内评价提供了一个强有力的临床前模型。其他相关品系详细信息，可访问百奥动物官网查询或咨询BD。参考资料：[1] Hu Z, Ott PA, Wu CJ. Towards personalized, tumour-specific, therapeutic vaccines for cancer. Nat Rev Immunol. 2018 Mar;18(3):168-182.[2] Hollingsworth RE, Jansen K. Turning the corner on therapeutic cancer vaccines. NPJ Vaccines. 2019 Feb 8;4:7.

免疫系统人源化小鼠是研究人造血和免疫功能的有力工具。在B-NDG小鼠或B-NDG hIL15小鼠中移植人CD34+ HSCs后，可以很好地重建人淋系细胞包括T细胞、B细胞和NK细胞，用于各类淋系细胞的作用机制研究及药效评价。但在这些人源化小鼠模型中，人髓系细胞包括单核/巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞和红细胞等重建不足，主要原因是促进各类髓系细胞重建的细胞因子在人和鼠之间的交叉反应不足。已有的数据表明：人细胞因子IL3、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 和人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF) 在小鼠中的表达可以促进树突状细胞、单核/巨噬细胞的发育与分化；人血小板生成素(THPO)能促进功能性人造血干细胞维持其多向分化潜能并促进其在小鼠骨髓中的长期植入。‍成熟血细胞的寿命是有限的，需要不断更新。造血从骨髓中一小部分多能造血干细胞的增殖和分化开始。造血程序异常会破坏体内平衡，并促使骨髓、血液或外周淋巴器官中中间祖细胞或成熟细胞的积累，从而导致各种恶性肿瘤。图1.造血作用机制[1]IL31981年Ihle等发现ConA刺激小鼠脾细胞的培养上清中含有一种因子，能提高裸鼠脾脏淋巴细胞成熟标志物20-α-羟固醇氢酸阳性率。这个因子被称为白细胞介素3 (IL-3)；因其功能可刺激多功能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化，又称为多重集落刺激因子（multi-CSF）。IL-3可刺激皮肤上皮细胞、CD4-CD8-TCRαβ细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞增殖，并阻止肥大细胞发生程序性细胞死亡等。GM-CSFGM-CSF，又称CSF-2，是一种分泌型细胞因子。GM-CSF有广泛的生理功能，主要参与髓细胞的生成和分化成熟、促进M1型巨噬细胞极化、激活中性粒细胞、参与血管形成、肿瘤进展、炎症发生等。GM-CSF的异常表达会导致过度的炎症、疼痛和组织损伤，并促进其他炎症细胞因子的产生。新冠病毒感染通常会引起淋巴细胞减少和炎症性细胞因子的释放，炎症风暴被认为是患者死亡的重要原因之一，一些医院正在尝试通过IL-6单抗应对新冠病毒引发的炎症风暴。但中科院魏海明教授等人的发现，GM-CSF在新冠病毒感染重症患者中或许更重要。M-CSF巨噬细胞集落刺激因子为M-CSF，又称为集落刺激因子-1(CSF-1)。最初发现于血清、尿或其它体液中，能刺激骨髓造血细胞巨噬细胞集落的形成。M-CSF对破骨细胞的分化与调节，单核细胞的增殖，分化及维持活性有重要作用。THPO促血小板生成素（THPO）能够促进巨核细胞形成和分化，并向外周血释放成熟的血小板，而肿瘤细胞分泌的一种细胞因子白细胞介素-6（IL-6）能够刺激肝脏分泌更多的THPO，因而提高癌症病患血浆血小板浓度。图2.肿瘤细胞利用血小板促进自身的侵袭和迁移[2]百奥动物将重度免疫缺陷小鼠B-NDG mice的IL3、GM-CSF、M-CSF、THPO基因的全长序列分别替换为相应人基因的全长编码序列，并通过二次基因编辑及相互交配的方式获得4种细胞因子人源化的的重度免疫缺陷小鼠，即B-NDG MGMT3 mice。移植人CD34+HSCs后，与B-NDG小鼠相比，B-NDG MGMT3 mice中各类人髓系细胞的重建明显增强，包括单核/巨噬细胞、树突状细胞；人淋系细胞包括CD4+ T细胞、Tregs和NK细胞的重建水平也有增加。B-NDG MGMT3 mice可用于研究造血系统的发育与分化机制、研究肿瘤、自免、感染与代谢等免疫相关疾病的致病机制与药效评价。B-NDG MGMT3 mice蛋白表达分析ELISA法检测野生型B-NDG小鼠和纯合B-NDG MGMT3小鼠中种属特异性GM-CSF、CSF1和THPO的表达。采集LPS刺激小鼠血清，进行ELISA分析(n=3)。小鼠GM-CSF、CSF1和THPO仅在B-NDG小鼠(+/+)中检测到，而在B-NDG MGMT3小鼠(H/H)中检测不到。人GM-CSF、CSF1和THPO仅在B-NDG MGMT3小鼠中检测到。由于IL3主要在活化的T细胞中表达，而B-NDG背景小鼠中没有成熟的T细胞，因此在两种小鼠中均未检测到小鼠或人IL3。利用B-NDG MGMT3 mice移植人CD34+HSCs重建人淋系和髓系细胞将人CD34+HSC(3E4)分别经面部颞静脉植入出生24-72小时的B-NDG小鼠和B-NDG MGMT3小鼠(雌雄均有，n=15)。B-NDG小鼠提前经1.0 gy辐照预处理；B-NDG MGMT3小鼠不做辐照预处理。结果显示：与B-NDG小鼠相比，B-NDG MGMT3小鼠未辐照，移植人HSCs 24周后，其生存率从移植18周开始降低，24周结实验时达到42.85%；但小鼠体重明显较大，重建过程中稳定增长。B-NDG MGMT3小鼠中重建的所有淋系及髓系人免疫细胞数量从重建12周开始显著高于在B-NDG小鼠中的重建水平。B-NDG®miceB-NDG小鼠是百奥赛图自主研发，通过在NOD scid背景上敲除IL2rg基因构建而成的重度免疫缺陷小鼠。该小鼠缺乏成熟的T、B和功能性的NK细胞，并表现出细胞因子信号转导功能缺失，其重度免疫缺陷表型使得该小鼠能够被用来进行包括人免疫细胞在内的异种细胞移植实验。该模型广泛应用于肿瘤学、肿瘤免疫学、传染病和干细胞生物学等领域的研究和药物发现。免疫缺陷系列大小鼠列表参考文献[1] Springuel L, Renauld JC, Knoops L. JAK kinase targeting in hematologic malignancies: a sinuous pathway from identification of genetic alterations towards clinical indications. Haematologica. 2015 Oct;100(10):1240-53. doi: 10.3324/haematol.2015.132142. PMID: 26432382; PMCID: PMC4591756.[2] Monika Haemmerle,Rebecca L. Stone,David G. Menter. The Platelet Lifeline to Cancer: Challenges and Opportunities. Cancer cell. VOLUME 33, ISSUE 6, P965-983, JUNE 11, 201