【评价原理】

斑马鱼成鱼体长5 cm左右，其胚胎透明，在受精72 h后完成孵化，并在孵出后3个月内性成熟。成年斑马鱼的繁殖周期短(一般7 d左右)，若条件适宜，成年雌性斑马鱼可定期产卵(每次200～300个)。在斑马鱼的早期胚胎及幼体的发育过程中，尚无性别分化，原始性腺都是相同的且具有双向发育的潜能，易受环境(温度、光照、pH值等)因素的影响而改变其遗传性别。

对于雌性斑马鱼而言，产卵量是评价其繁殖力的常用生物指标，它与鱼类繁殖过程中的多个环节（卵子发育、雌雄交配行为、性激素刺激等）相关，并对环境化学物质具有高敏感性，能直接反应鱼类繁殖力变化。环境化学物质除了直接对亲代斑马鱼的生殖系统造成损害，还可能对其子代的正常生长发育。

卵黄蛋白原在斑马鱼雌鱼成熟过程中发挥重要作用，成熟雌鱼在体内17β-雌二醇的刺激下，由肝脏合成的VTG经过血液到达卵巢并加工成卵黄蛋白，促进性腺发育。幼鱼和雄鱼在正常情况下不合成VTG,但在受到雌激素和类雌激素刺激时能合成VTG，导致鱼体内VTG浓度升高，出现雌性体征。

鱼类的性腺发育和繁殖行为受到下丘脑-垂体-性腺轴（HPG 轴）的调控。下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），其作用于脑垂体，刺激其分泌促黄体生成素（LH）和促卵泡素（FSH），这两种激素通过血液循环与相应的受体结合后作用于性腺，刺激性腺产生睾酮（T）、17β-雌二醇（E2）和 11-酮基睾酮（11-KT） 等类固醇激素，进而促进精子和卵子的发育和成熟。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，进行21天的暴露实验，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间供试品后，观察每次的产卵量、受精率及孵化率；对受精卵进行子一代发育毒性与致畸性评价。在实验终点取斑马鱼的组织，检测卵黄蛋白原（VTG）含量及相关基因表达，并对性腺进行病理组织学检查，指标主要包括：睾丸卵母细胞、睾丸间质细胞增生、卵黄形成减少、精原细胞和滤泡增生；其他性腺损伤包括：卵母细胞闭锁、睾丸变性和分期改变。

【结果展示】

图1. 供试品对斑马鱼体内卵黄蛋白原（VTG）的影响

可以看到，供试品组VTG有下降趋势，但与正常对照组比较没有显著性差异。

图2. 斑马鱼发育毒性与致畸性表型图

可以看到，供试品组斑马鱼诱发眼睛变小，下颌异常，心血管毒性等。

图3. 斑马鱼性腺病理切片

可以看到，供试品组斑马鱼精巢精子量变少，卵巢中卵母细胞体积变小、数量减少 。

图4. 供试品对斑马鱼基因表达的影响

可以看到，供试品组FSHβ、LHβ基因相较于正常对照组显著表达。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，摄入供试品组的斑马鱼体内VTG有下降趋势，子一代斑马鱼有致畸性，性腺病理切片有不同程度的异常，与性腺发育和繁殖行为相关基因的上调。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有生殖毒性。

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【评价原理】

便秘的主要表现是排便次数减少和排便困难。斑马鱼是一种与人类同源性较高的脊椎动物，它的肠道组成与人类相似，具有内皮细胞、结缔组织、环状肌肉和外纵肌层。硫酸铝能减少肠道蠕动，诱发斑马鱼便秘。

经过喂食不被肠道吸收的特异性荧光材料，可以明显的观察到被便秘斑马鱼肠道蠕动减慢，肠道内的荧光强度明显比正常斑马鱼亮。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用通便剂组。服用通便剂组提前服用一段时间吗丁啉、派立清口服液和慈素粉之类的通便剂后，正常对照组、模型对照组与服用通便剂组都摄入了等量荧光材料。荧光材料摄入后，正常对照组不做任何处理，模型对照组和服用通便剂组都摄入了等量硫酸铝（荧光材料和硫酸铝通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间通便剂后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼肠道荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肠道荧光强度表型图

可以看到，服用通便剂组的肠道荧光强度较模型对照组明显减弱。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用通便剂组的肠道荧光强度较模型对照组明显减弱。

2.本实验证实了吗丁啉、派立清口服液和慈素粉等具有明显通便功效。

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【评价原理】

肿瘤治疗中一个普遍存在的问题就是多药耐药。在化疗引起的肿瘤耐药机制中，肿瘤细胞的P-糖蛋白（P-gp）表达水平升高是主要机制之一。P-gp是一种细胞外转运子，P-gp表达水平升高会导致进入肿瘤细胞会很快被转运到细胞外，导致肿瘤细胞内的化疗药浓度达不到杀死肿瘤细胞的浓度，进而产生耐药性。

让正常斑马鱼摄入荧光底物（呈红色），由于P-gp的存在，正常斑马鱼将荧光底物泵出体外，残留在体内的荧光底物很少；而用P-gp抑制剂环孢菌素A处理后，P-gp的活性受到抑制，P-gp荧光底物不能被排出，残留在斑马鱼体内的荧光底物增多。若某种药物能够增加荧光底物在斑马鱼体内的存留，则其可能是潜在的P-gp抑制剂。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用P-gp抑制剂组。斑马鱼提前P-gp抑制剂数小时，而正常斑马鱼和服用P-gp抑制剂组都摄入了等量的荧光底物（荧光底物通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。一定时间后，观察斑马鱼卵黄囊荧光底物的残留情况（卵黄囊荧光强度）来体现P-gp抑制剂逆转多药耐药作用。

【结果展示】

图1. 斑马鱼多药耐药表型图

可以看到，服用P-gp抑制剂组的斑马鱼卵黄囊明显比正常对照组的亮，说明其对P-gp有显著的抑制作用。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用P-gp抑制剂组的斑马鱼卵黄囊明显比正常对照组的亮，说明其对P-gp有显著的抑制作用。

2.本实验证实了环孢菌素A、维拉帕米具有逆转多药耐药作用。

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【评价原理】

多发性硬化症（multiple sclerosis, MS）是一种慢性、炎症性中枢神经系统失调疾病，其临床症状主要表现为病灶性脱髓鞘、轴突损伤和髓鞘再生受限。斑马鱼的髓鞘结构特征和少突胶质细胞的分化过程与哺乳动物高度一致，同时作为整体动物能从宏观上反映在外来化合物作用下，神经系统功能失调引起的变化。用乙醇可以诱导斑马鱼轴索损伤，模拟人类的多发性硬化症。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用促进轴索再生药物组。其中正常对照组未摄入乙醇，模型对照组与促进轴索再生药物组都摄入了等量的乙醇。服用促进轴索再生药物组在加入乙醇的同时摄入L-甲状腺素钠之类的促进轴索再生药物。服用药物一段时间后在荧光显微镜下分析斑马鱼轴索荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼轴索表型图

可以看到，服用促进轴索再生药物组与模型对照组比较，斑马鱼轴索较完整、延伸较长。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用促进轴索再生药物组与模型对照组比较，斑马鱼轴索较完整、延伸较长。

2.本实验证实了L-甲状腺素钠之类的药物具有显著的促进轴索再生的作用。

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【评价原理】

神经毒性通常指某些药物影响机体的神经传导，导致神经传导中断或减弱，从而影响机体的正常功能。斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，神经系统形成过程和发育机制与人类高度相似，在6 hpf（受精后6小时）神经系统开始发育，受精6天后所有神经系统发育完成。斑马鱼在短时间内形成整个神经系统，为神经毒性的评价带来了有利的条件。而且斑马鱼对药物神经毒性的预测准确性高，同时兼具快速、高效、经济的优点。

我们评价斑马鱼神经毒性有3个指标：1.行为学；2.中枢神经凋亡细胞荧光信号强度；3. 外周运动神经长度。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们观察斑马鱼的运动行为，通过荧光染色观察中枢神经凋亡细胞，也可以利用转基因运动神经绿色荧光NBT品系斑马鱼观察外周运动神经长度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼神经毒性运动轨迹图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼运动明显减少。

图2. 斑马鱼光暗刺激下每分钟运动速度表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼对光暗刺激不敏感。

图3. 斑马鱼中枢神经凋亡细胞表型图

黄色虚线框内为中枢神经分析区域，绿色荧光小点为凋亡细胞

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼中枢神经细胞凋亡明显增加。

图4. 斑马鱼外周运动神经表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼外周运动神经明显缩短。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼运动明显减少且对光暗刺激不敏感，中枢神经细胞凋亡增加且外周运动神经缩短，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有神经毒性。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。持续的高血糖水平导致糖尿病并发症发生，高血糖累及中枢和周围神经病变，出现神经炎症。感觉神经受损较为多见，出现麻木、触电、发热、蚁行感，运动神经受损则出现肌力下降。斑马鱼胰腺的形态发生和基本细胞结构、排列方式类似于哺乳动物，斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖负荷状态下表现出持续高血糖现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病的神经并发症。

用转基因运动神经荧光斑马鱼（呈绿色），患有高血糖的斑马鱼运动神经细胞损伤、荧光强度减弱，在荧光显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用降糖产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内。降糖产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖产品。

服用一段时间降糖产品后，我们用荧光显微镜观察斑马鱼周围运动神经荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼周围运动神经荧光强度

白色箭头代表运动神经

可以看到，模型对照组周围运动神经荧光强度较正常对照组明显减弱，而降糖产品组斑马鱼周围运动神经荧光强度明显增强。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖产品组斑马鱼周围运动神经荧光强度与模型对照组比较明显增强。

2.本实验证实了松花蛹虫草之类的产品具有神经保护作用。

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【评价原理】

斑马鱼的鳔从器官进化、组织结构以及生物学等多个层面都类似于哺乳动物的肺泡。我们与浙江大学公共卫生学院从事慢阻肺研究的团队合作，进行鱼鳔损伤模型与肺损伤相关性研究。我们发现细微颗粒、细菌、肿瘤细胞以及肺炎患者的灌洗液都会引起斑马鱼鳔损伤，产生严重的炎症反应，甚至导致斑马鱼鳔破裂。通过我们所做的机制方面的研究及实验证明，斑马鱼模型可以作为急性肺损伤研究的新模型，进而可以用于肺损伤治疗或者预防的有关药物的筛选。

（1）细菌性肺炎：注射给予LPS建立斑马鱼肺炎模型。LPS是脂质和多糖的复合物，来源于革兰氏阴性菌细胞壁的外膜，是内毒素的主要成分。接触一定量的LPS会引起机体支气管炎、肺炎、肝炎及脂多糖血症。

（2）病毒性肺炎：注射给予聚肌胞——poly（i:c）建立斑马鱼肺炎模型。poly（i:c）的双链RNA结构非常类似于病毒或病毒复制过程中形成的双链RNA，所以poly（i:c）类似某些病毒，具有很强的干扰素诱生作用。

通过使用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，在荧光显微镜下可以直接观察斑马鱼中性粒细胞，使用实时荧光定量PCR仪可获得基因表达水平，通过制作组织病理切片观察斑马鱼鱼鳔部位的病理结构变化。

【实验方案】

（1）我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和抗肺炎药物组。其中，模型对照组与抗肺炎药物都注射了等量的LPS建立肺炎模型。抗肺炎药物在注射了LPS的同时摄入吲哚美辛之类的抗肺炎药物。

（2）我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和抗肺炎药物组。其中，模型对照组与抗肺炎药物都注射了等量的聚肌胞——poly（i:c）建立肺炎模型。抗肺炎药物在注射了poly（i:c）的同时摄入吲哚美辛之类的抗肺炎药物。

服用一段时间抗肺炎药物后，我们在荧光显微镜下拍摄斑马鱼中性粒细胞，用实时荧光定量PCR仪检测TNF-α、IL-1β值，同时制作成病理切片观察鱼鳔部位的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼中性粒表型图

黄色虚线区域为鱼鳔，绿色荧光颗粒为中性粒细胞

可以看到，服用抗肺炎药物组斑马鱼鱼鳔位置处的中性粒细胞与正常对照组相似，未出现模型对照组中性粒细胞明显增多的情况。

图2. TNF-α、IL-1β基因表达水平

与模型对照组比较，***p < 0.001

可以看到，服用抗肺炎药物组斑马鱼的炎症基因表达水平与正常对照组较为接近，未出现模型对照组炎症基因的表达水平明显升高的情况。

图3. 鱼鳔部位病理切片

从病理切片中也能看出来，服用抗肺炎药物组斑马鱼鱼鳔病理结构与正常对照组相似，未出现模型对照组渗入的中性粒细胞数的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗肺炎药物在中性粒细胞、炎症基因表达和病理结构均与正常对照组相似，未出现模型对照组的中性粒细胞数显著增加炎症基因表达水平明显升高和病理出现中性粒细胞渗出的情况。

2.本实验证实了吲哚美辛具有显著的防治肺炎作用。

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【评价原理】

关节软骨受到急性外伤和慢性磨损，出现不同程度的损伤，导致关节疼痛、活动受限，甚至功能丧失。关节软骨的修复主要靠软骨细胞的增殖分化，生产足够的细胞外基质修复软骨缺损。人软骨细胞通常是静止的，血管化程度低，营养主要来源于关节液和软骨下骨，修复再生则显得十分有限，需要外源性的手段来辅助修复。地塞米松破坏软骨细胞的代谢平衡，引起软骨细胞的死亡或凋亡，从而引起软骨损伤。斑马鱼的骨骼发育与其他脊椎动物骨骼发育过程极其相似，因此，可用于软骨修复功效评价。

斑马鱼的软骨主要分布于头部，包括七对咽颅软骨弓（下颌弓、舌弓及五对鳃弓）和脑颅软骨。基于转基因软骨荧光斑马鱼特性，患有软骨损伤的斑马鱼的软骨荧光强度会明显比正常斑马鱼的软骨荧光强度要暗很多，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试软骨荧光斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和软骨修复产品组。其中正常对照组未摄入地塞米松，模型对照组与服用软骨修复产品组都摄入了等量的地塞米松（地塞米松通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用软骨修复产品组在摄入地塞米松的同时摄入硫酸软骨素之类的软骨修复产品。

服用一段时间软骨修复产品后，我们观察软骨荧光的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼软骨表型图

绿色荧光为斑马鱼头部软骨

可以看到，服用软骨修复产品组的软骨情况与未摄入地塞米松的正常对照组比较相似，没有明显的软骨损伤。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用软骨修复产品组的软骨情况与未摄入地塞米松的正常对照组相似，并未出现模型对照组的软骨损伤的情况。

2.本实验证实了硫酸软骨素具有明显软骨修复功效。

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【评价原理】

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。用手术刀截断斑马鱼尾鳍，诱发急性损伤，促使斑马鱼中性粒细胞发生免疫应答。

采用转基因中性粒细胞荧光鱼（呈绿色），可在荧光显微镜在观察到尾鳍截断的斑马鱼创面中性粒细胞数量比正常斑马鱼明显增加。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗炎药组。其中正常对照组未截断尾鳍，模型对照组和服用抗炎药组均截断尾鳍。服用抗炎药组在切断尾鳍后摄入吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸之类的抗炎药。

服用一段时间抗炎药后，我们观察斑马鱼尾鳍中性粒细胞数量，并通过Q-PCR检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

【结果展示】

图1. 斑马鱼尾鳍炎症中性粒细胞表型图

黄色虚线区域为尾鳍，绿色颗粒为中性粒细胞

可以看到，服用/注射抗炎药组尾鳍中性粒细胞与正常对照组相似，未出现创面中性粒细胞募集情况。

以TNF-α、COX-2基因为例，提供柱状图。

图2. 斑马鱼TNF-α基因相对表达量

与模型对照组比较，**p < 0.01

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，TNF-α基因表达明显下调。

图3. 斑马鱼COX-2基因相对表达量

与模型对照组比较，***p < 0.001

可以看到，服用/注射抗炎药组斑马鱼与模型对照组比较，COX-2基因表达明显下调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射抗炎药组尾鳍中性粒细胞数量与正常对照组相似，未出现创面中性粒细胞募集情况，且TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症因子明显下调。

2.本实验证实了吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸具有显著的抗炎作用，且抑制TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-10炎症相关因子的表达。

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【评价原理】

斑马鱼消化道的解剖结构、组织细胞形态与人类消化道相似，具有内皮、结缔组织、环状肌肉和外纵肌层。斑马鱼发育至5 dpf时，其消化道即出现了自发有节奏的肌肉收缩活动。经过喂食不被吸收的特异性荧光材料尼罗红，可以明显的观察到被鱼吃进去的荧光染料，以胃肠道尼罗红的量（荧光强度）为指标，若供试品有胃肠动力抑制作用，则胃肠道内尼罗红无法排出，堆积的尼罗红的量增加，胃肠道荧光强度明显变亮。

【实验方案】

我们先给斑马鱼喂饲特异性荧光材料尼罗红，然后将受测试斑马鱼分成2组，分别是正常对照组、胃肠动力抑制剂组。服用一段时间胃肠动力抑制剂后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼胃肠道荧光强度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胃肠道荧光强度表型图

可以看到，服用胃肠动力抑制剂斑马鱼的胃肠道荧光强度明显比正常对照组亮。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用胃肠动力抑制剂斑马鱼的胃肠道荧光强度明显比正常对照组亮。

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