【评价原理】

OECD近年大力推崇的“有害结局路径”（Adverse Outcome Pathway，AOP）毒性评估策略来测试类雌激素这一大类有害物质。本方法参照粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO，2000）关于类雌激素物质最高日摄取量来评估测试物的安全性，通过转基因标记技术表达的绿色荧光蛋白含量来量化类雌激素物质含量，绿色荧光蛋白特异性地在肝脏表达，一旦供试品中含一定量的类雌激素化学物质，雌激素转基因斑马鱼暴露后肝脏部位会出现绿色荧光，可用绿色荧光量化供试品中的类雌激素物质含量，从而达到检测效果。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

摄入供试品一段时间后，我们在荧光显微镜下观察斑马鱼肝脏荧光。

【结果展示】

图1.含类雌激素物质的供试品处理后斑马鱼荧光表型图

黄色曲线部位为肝脏，绿色荧光量化类雌激素含量

可以看到，摄入供试品组肝脏部位有明显的绿色荧光。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，摄入含类雌激素物质的供试品组斑马鱼肝脏荧光明显，与正常对照组存在明显差别。

2.本实验证实了该供试品含有类雌激素物质。

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【评价原理】

近三十年来，世界癌症发病率以年均3-5%的速度递增，癌症已成为人类第一位死因。肿瘤移植模型为快速筛选抗肿瘤药物提供巨大帮助。斑马鱼在早期仅有非特异性免疫，不具备完善的特异性免疫，对人肿瘤细胞不存在排斥反应。因此，斑马鱼可直接接种人肿瘤细胞来筛选广谱抗肿瘤药物。另外，斑马鱼与人肿瘤发生、发展相关的（凋亡、VEGF、Wnt、ALK等）信号通路上相似，可用于筛选靶向抗肿瘤药物。

1.肿瘤生长、转移

将荧光标记的人肿瘤细胞（呈红色）移植到野生型斑马鱼体内，肿瘤细胞在斑马鱼体内的生长和转移情况可以被观察到。

2.肿瘤部位新生血管

将荧光标记的人肿瘤细胞（呈红色）移植到转基因血管荧光斑马鱼（呈绿色）体内，肿瘤细胞刺激斑马鱼新生血管情况可以被观察到。

3.肿瘤细胞凋亡

将人肿瘤细胞移植到野生型斑马鱼体内，通过特异性荧光染色（凋亡细胞呈绿色），细胞凋亡情况可以被观察到。

4.肿瘤部位炎症

将人肿瘤细胞移植到转基因中性粒细胞荧光斑马鱼（呈绿色）体内，肿瘤部位炎症反应可以被观察到。

5.肿瘤病理

将人肿瘤细胞移植到野生型斑马鱼体内，制作成病理切片，观察肿瘤细胞的形态变化。

6.生存期

将人肿瘤细胞移植到野生型斑马鱼体内，统计斑马鱼每日存活率、计算其生存期。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品组。正常对照组不注射人肿瘤细胞，模型对照组与服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品组都注射了等量的荧光标记的人肿瘤细胞。服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品组注射等量的荧光标记的人肿瘤细胞后，摄入抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品。

服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品数天后，我们对斑马鱼进行图像采集，观察肿瘤细胞的生长和转移情况、细胞凋亡情况、炎症反应情况以及形态变化，同时计算其生存期。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肿瘤生长表型图

红色部分为荧光标记的人肿瘤细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组的肿瘤细胞数量相比模型对照组明显减少。

图2. 斑马鱼肿瘤转移距离表型图

绿色为斑马鱼血管，红色颗粒为荧光标记的人肿瘤细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组的肿瘤转移距离相比模型对照组明显减少。

图3. 斑马鱼肿瘤部位新生血管表型图

绿色为血管，红色颗粒为人肿瘤细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组的血管结构与正常对照组比较相似，未出现模型对照组血管增多、增粗、紊乱、出芽的情况。

图4. 斑马鱼肿瘤部位细胞凋亡表型图

绿色为凋亡细胞，红色颗粒为人肿瘤细胞

可以看到，正常对照组未出现凋亡细胞，模型对照组一些凋亡细胞，服用抗肿瘤药组的出现大量的凋亡细胞。

图5. 斑马鱼肿瘤部位中性粒细胞表型图

绿色颗粒为中性粒细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组斑马鱼肿瘤部位中性粒细胞较少，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况。

图6. 斑马鱼肿瘤病理切片

绿色箭头指向人肿瘤细胞

可以看到，正常对照组斑马鱼腹腔内没有肿瘤细胞，模型对照组斑马鱼腹腔内可见较多的肿瘤细胞，肿瘤细胞多形性、核浆比增大、出现病理性核分裂。抗肿瘤药组斑马鱼腹腔内仅见少量肿瘤细胞，肿瘤细胞体积增大、核浆比增大。

图7. 斑马鱼生存期展示图

可以看到，服用抗肿瘤药组生存期与正常对照组斑马鱼相似，未出现模型对照组生存期明显缩短的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗肿瘤药组的肿瘤细胞数量、转移距离、新生血管数量较模型对照组明显减少；抗肿瘤药组肿瘤部位凋亡细胞较模型对照组明显增加；抗肿瘤药组肿瘤细胞形态较接近正常对照组。

2.经过每组60尾斑马鱼的对比实验，抗肿瘤药组斑马鱼生存期较模型对照组明显延长。

3.本实验证实了顺铂、康莱特、沙利度胺等抗肿瘤药具有显著的抗肿瘤作用。

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【评价原理】

斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，与哺乳动物对外源化学物质的防御机制相当，包括酶的诱导和氧化应激。当生物暴露在环境污染物中，生物可能会发生氧化应激，主要表现为活性氧（ROS）产生和消耗的不平衡。在需氧生物的活细胞中，活性氧被一种由水和脂溶性低分子量自由基清除剂、特异性抗氧化酶组成的抗氧化防御机制解毒。

 应用ROS特异性荧光检测试剂，它的水解产物能被ROS氧化为高荧光物质，用多功能酶标仪检测荧光值反映氧化应激的程度。本方法已被授予国家发明专利。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是底物对照组、正常对照和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中摄入到斑马鱼体内），并加入ROS特异性荧光检测试剂。

服用供试品一段时间后，我们使用酶标仪对斑马鱼体内ROS进行荧光定量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ROS荧光值

可以看到，服用供试品组斑马鱼体内荧光值比正常对照组有明显升高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用供试品组的斑马鱼ROS水平明显高于正常对照组，与正常对照组存在显著性差异。

2.本实验证实了该供试品诱发斑马鱼氧化应激。

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【评价原理】

斑马鱼成鱼体长5 cm左右，其胚胎透明，在受精72 h后完成孵化，并在孵出后3个月内性成熟。成年斑马鱼的繁殖周期短(一般7 d左右)，若条件适宜，成年雌性斑马鱼可定期产卵(每次200～300个)。在斑马鱼的早期胚胎及幼体的发育过程中，尚无性别分化，原始性腺都是相同的且具有双向发育的潜能，易受环境(温度、光照、pH值等)因素的影响而改变其遗传性别。

对于雌性斑马鱼而言，产卵量是评价其繁殖力的常用生物指标，它与鱼类繁殖过程中的多个环节（卵子发育、雌雄交配行为、性激素刺激等）相关，并对环境化学物质具有高敏感性，能直接反应鱼类繁殖力变化。环境化学物质除了直接对亲代斑马鱼的生殖系统造成损害，还可能对其子代的正常生长发育。

卵黄蛋白原在斑马鱼雌鱼成熟过程中发挥重要作用，成熟雌鱼在体内17β-雌二醇的刺激下，由肝脏合成的VTG经过血液到达卵巢并加工成卵黄蛋白，促进性腺发育。幼鱼和雄鱼在正常情况下不合成VTG,但在受到雌激素和类雌激素刺激时能合成VTG，导致鱼体内VTG浓度升高，出现雌性体征。

鱼类的性腺发育和繁殖行为受到下丘脑-垂体-性腺轴（HPG 轴）的调控。下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），其作用于脑垂体，刺激其分泌促黄体生成素（LH）和促卵泡素（FSH），这两种激素通过血液循环与相应的受体结合后作用于性腺，刺激性腺产生睾酮（T）、17β-雌二醇（E2）和 11-酮基睾酮（11-KT） 等类固醇激素，进而促进精子和卵子的发育和成熟。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，进行21天的暴露实验，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间供试品后，观察每次的产卵量、受精率及孵化率；对受精卵进行子一代发育毒性与致畸性评价。在实验终点取斑马鱼的组织，检测卵黄蛋白原（VTG）含量及相关基因表达，并对性腺进行病理组织学检查，指标主要包括：睾丸卵母细胞、睾丸间质细胞增生、卵黄形成减少、精原细胞和滤泡增生；其他性腺损伤包括：卵母细胞闭锁、睾丸变性和分期改变。

【结果展示】

图1. 供试品对斑马鱼体内卵黄蛋白原（VTG）的影响

可以看到，供试品组VTG有下降趋势，但与正常对照组比较没有显著性差异。

图2. 斑马鱼发育毒性与致畸性表型图

可以看到，供试品组斑马鱼诱发眼睛变小，下颌异常，心血管毒性等。

图3. 斑马鱼性腺病理切片

可以看到，供试品组斑马鱼精巢精子量变少，卵巢中卵母细胞体积变小、数量减少 。

图4. 供试品对斑马鱼基因表达的影响

可以看到，供试品组FSHβ、LHβ基因相较于正常对照组显著表达。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，摄入供试品组的斑马鱼体内VTG有下降趋势，子一代斑马鱼有致畸性，性腺病理切片有不同程度的异常，与性腺发育和繁殖行为相关基因的上调。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有生殖毒性。

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【评价原理】

斑马鱼成鱼体长5 cm左右，其胚胎透明，在受精72 h后完成孵化，并在孵出后3个月内性成熟。成年斑马鱼的繁殖周期短(一般7 d左右)，若条件适宜，成年雌性斑马鱼可定期产卵(每次200～300个)。在斑马鱼的早期胚胎及幼体的发育过程中，尚无性别分化，原始性腺都是相同的且具有双向发育的潜能，易受环境(温度、光照、pH值等)因素的影响而改变其遗传性别。

对于雌性斑马鱼而言，产卵量是评价其繁殖力的常用生物指标，它与鱼类繁殖过程中的多个环节（卵子发育、雌雄交配行为、性激素刺激等）相关，并对环境化学物质具有高敏感性，能直接反应鱼类繁殖力变化。环境化学物质除了直接对亲代斑马鱼的生殖系统造成损害，还可能对其子代的正常生长发育。

卵黄蛋白原在斑马鱼雌鱼成熟过程中发挥重要作用，成熟雌鱼在体内17β-雌二醇的刺激下，由肝脏合成的VTG经过血液到达卵巢并加工成卵黄蛋白，促进性腺发育。幼鱼和雄鱼在正常情况下不合成VTG,但在受到雌激素和类雌激素刺激时能合成VTG，导致鱼体内VTG浓度升高，出现雌性体征。

鱼类的性腺发育和繁殖行为受到下丘脑-垂体-性腺轴（HPG 轴）的调控。下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），其作用于脑垂体，刺激其分泌促黄体生成素（LH）和促卵泡素（FSH），这两种激素通过血液循环与相应的受体结合后作用于性腺，刺激性腺产生睾酮（T）、17β-雌二醇（E2）和 11-酮基睾酮（11-KT） 等类固醇激素，进而促进精子和卵子的发育和成熟。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，进行21天的暴露实验，分别是正常对照组和服用供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或灌胃的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用一段时间供试品后，观察每次的产卵量、受精率及孵化率；对受精卵进行子一代发育毒性与致畸性评价。在实验终点取斑马鱼的组织，检测卵黄蛋白原（VTG）含量及相关基因表达，并对性腺进行病理组织学检查，指标主要包括：睾丸卵母细胞、睾丸间质细胞增生、卵黄形成减少、精原细胞和滤泡增生；其他性腺损伤包括：卵母细胞闭锁、睾丸变性和分期改变。

【结果展示】

图1. 供试品对斑马鱼体内卵黄蛋白原（VTG）的影响

可以看到，供试品组VTG有下降趋势，但与正常对照组比较没有显著性差异。

图2. 斑马鱼发育毒性与致畸性表型图

可以看到，供试品组斑马鱼诱发眼睛变小，下颌异常，心血管毒性等。

图3. 斑马鱼性腺病理切片

可以看到，供试品组斑马鱼精巢精子量变少，卵巢中卵母细胞体积变小、数量减少 。

图4. 供试品对斑马鱼基因表达的影响

可以看到，供试品组FSHβ、LHβ基因相较于正常对照组显著表达。

【评价结论】

1.经过各组斑马鱼的对比实验，摄入供试品组的斑马鱼体内VTG有下降趋势，子一代斑马鱼有致畸性，性腺病理切片有不同程度的异常，与性腺发育和繁殖行为相关基因的上调。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有生殖毒性。

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【评价原理】

酒精进入人体后90%进入肝脏进行代谢，长期过量饮酒诱发酒精性脂肪肝，临床表现为肝脏受脂肪浸润。由于斑马鱼拥有与人类相似的消化系统，如肝脏、肠道等，消化和营养的吸收及运输与人类高度相似，在大量摄入酒精后，肝脏也会出现脂肪变性（酒精性脂肪肝）的情况。

经过脂肪特异性染色（呈红色），患有酒精性脂肪肝的斑马鱼的肝脏会明显比正常斑马鱼的肝脏要红很多，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用解酒剂组。其中正常对照组未摄入酒精，模型对照组与服用解酒剂组都摄入了等量的酒精（酒精通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用解酒剂组在摄入酒精的同时摄入RU21、海王金樽之类的解酒剂。

服用一定时间解酒剂后，我们对斑马鱼整体做脂肪特异性染色，观察肝脏的脂肪变化，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼酒精性脂肪肝表型图

黄色虚线区域为肝脏，肝脏内红色代表脂肪

可以看到，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组比较相似，没有明显的脂肪沉积。

图2. 肝脏病理切片

黄色箭头指向脂肪颗粒

从病理切片中也能看出来，酒精性脂肪肝斑马鱼的肝脏有很多脂肪颗粒，而服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组都没有出现类似的脂肪颗粒。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组相似，并未出现模型对照组的出现大量脂肪颗粒（酒精性脂肪肝）的情况。

2.本实验证实了RU21、海王金樽解酒剂具有疏肝解酒（酒精性脂肪肝防治）功效。

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【评价原理】

神经毒性通常指某些药物影响机体的神经传导，导致神经传导中断或减弱，从而影响机体的正常功能。斑马鱼的基因与人类基因的相似度达到87％，神经系统形成过程和发育机制与人类高度相似，在6 hpf（受精后6小时）神经系统开始发育，受精6天后所有神经系统发育完成。斑马鱼在短时间内形成整个神经系统，为神经毒性的评价带来了有利的条件。而且斑马鱼对药物神经毒性的预测准确性高，同时兼具快速、高效、经济的优点。

我们评价斑马鱼神经毒性有3个指标：1.行为学；2.中枢神经凋亡细胞荧光信号强度；3. 外周运动神经长度。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们观察斑马鱼的运动行为，通过荧光染色观察中枢神经凋亡细胞，也可以利用转基因运动神经绿色荧光NBT品系斑马鱼观察外周运动神经长度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼神经毒性运动轨迹图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼运动明显减少。

图2. 斑马鱼光暗刺激下每分钟运动速度表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼对光暗刺激不敏感。

图3. 斑马鱼中枢神经凋亡细胞表型图

黄色虚线框内为中枢神经分析区域，绿色荧光小点为凋亡细胞

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼中枢神经细胞凋亡明显增加。

图4. 斑马鱼外周运动神经表型图

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼外周运动神经明显缩短。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼运动明显减少且对光暗刺激不敏感，中枢神经细胞凋亡增加且外周运动神经缩短，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有神经毒性。

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【评价原理】

机体供能主要分为有氧供能与无氧供能，在两种供能条件下ATP均源源不断的合成以维持机体活动的需求。通过ATP含量的测定，可以分析能量调节剂对斑马鱼能量代谢快慢的影响。如持续的促进能量代谢、增加机体能量消耗是行之有效的减肥措施，促进脂肪分解类减肥产品可明显增加斑马鱼体内ATP含量。

【实验方案】

将受测试斑马鱼分成2组，分别是正常对照组、能量调节剂组。服用一段时间能量调节剂后，我们利用ATP试剂盒检测斑马鱼体内ATP含量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ATP含量

与正常对照组比较，***p<0.001

可以看到，服用能量调节剂的斑马鱼体内ATP含量明显比正常对照组高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用能量调节剂的斑马鱼体内ATP含量与正常对照组相比明显升高，说明本次实验中选用的能量调节剂可促进ATP生成，促进能量代谢。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。持续的高血糖水平导致糖尿病并发症发生，高血糖累及中枢和周围神经病变，出现神经炎症。感觉神经受损较为多见，出现麻木、触电、发热、蚁行感，运动神经受损则出现肌力下降。斑马鱼胰腺的形态发生和基本细胞结构、排列方式类似于哺乳动物，斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖负荷状态下表现出持续高血糖现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病的神经并发症。

用中性粒细胞荧光与运动神经荧光杂交品系斑马鱼（呈绿色），患有高血糖的斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目增多，在荧光显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖产品。

服用一段时间降糖产品后，我们用荧光显微镜观察斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目

黄色框线内绿色荧光点代表中性粒细胞

可以看到，模型对照组的周围运动神经中性粒细胞数目较正常对照组明显增多，而降糖产品组斑马鱼明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖产品组斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目与模型对照组比较明显减少。

2.本实验证实了松花蛹虫草之类的降糖产品具有神经炎症消退功效。

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【评价原理】

对乙酰氨基酚是临床上常用于解热镇痛，但对肝脏有严重的副作用，其中间代谢产物激发细胞内氧化应激反应，加快了细胞脂质过氧化水平，引起线粒体膜电位消失和膜流动性降低，腺嘌呤核苷三磷酸合成障碍，最终导致肝细胞坏死。斑马鱼的肝脏组织、细胞组成和功能几乎与哺乳动物相同。疾病表征如胆汁淤积、脂肪肝（脂肪变性）和肿瘤的组织病理学也与哺乳动物具有可比性。斑马鱼对外来生物化学物质如酶诱导和氧化应激的一般防御机制与哺乳动物相同，斑马鱼药物代谢相关的细胞色素P450也与哺乳动物具有相似性。因此，斑马鱼适合用于评价产品对对乙酰氨基酚等药物引起肝损伤的保肝功效。

患有肝损伤的斑马鱼的肝脏较正常斑马鱼明显缩小，肝脏变性发黑，卵黄囊吸收延迟（卵黄囊是脂肪，吸收与肝脏功能相关）。由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用肝保护剂组。其中正常对照组未对乙酰氨基酚，模型对照组与服用肝保护剂组都摄入了等量的对乙酰氨基酚（对乙酰氨基酚通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用肝保护剂组在摄入对乙酰氨基酚的同时摄入N-乙酰半胱氨酸之类的肝保护剂。

服用一段时间肝保护剂后，我们观察肝脏的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼酒精性脂肪肝表型图

黄色虚线区域为肝脏，红色虚线区域为卵黄囊

可以看到，服用肝保护组的肝脏情况与未摄入对乙酰氨基酚的正常对照组比较相似，相比模型对照组的肝缩小和肝变性发黑都有明显改善。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用肝保护剂组的肝脏情况与未摄入肝保护的正常对照组相似，相比模型对照组的肝损伤明显改善。

2.本实验证实了N-乙酰半胱氨酸具有保护肝脏功效。

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