【评价原理】

缺氧可能导致心血管系统、呼吸系统、神经系统、消化系统等等一系列危害身体的疾病。斑马鱼心血管系统在分子信号通路上与人和哺乳动物的同源性达到85%以上,近年来斑马鱼广泛地被用于心血管疾病研究领域。因此，斑马鱼适用于评价耐缺氧功效。亚硝酸钠中毒是临床常见的一种化学性中毒，将正常的血红蛋白氧化成为高铁血红蛋白而失去携氧能力，造成组织细胞缺氧。统计斑马鱼的死亡情况。

经过解剖显微镜观察，通过斑马鱼死亡率的差别判断耐缺氧功效。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用耐缺氧剂组。其中正常对照组未服用亚硝酸钠，模型对照组与服用耐缺氧剂组都摄入了等量的亚硝酸钠（亚硝酸钠通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用耐缺氧剂组在摄入亚硝酸钠之前摄入红景天苷之类的耐缺氧剂。

服用耐缺氧剂一段时间后，我们统计斑马鱼死亡和存活情况。

【结果展示】

图1. 斑马鱼死亡和存活数量

可以看到，服用耐缺氧剂组未出现模型对照组死亡率明显增多的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用耐缺氧剂组未出现模型对照组死亡率明显增多的情况。

2.本实验证实了红景天苷具有明显的耐缺氧功效。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。持续的高血糖水平导致糖尿病并发症发生，高血糖累及中枢和周围神经病变，出现神经炎症。感觉神经受损较为多见，出现麻木、触电、发热、蚁行感，运动神经受损则出现肌力下降。斑马鱼胰腺的形态发生和基本细胞结构、排列方式类似于哺乳动物，斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖负荷状态下表现出持续高血糖现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病的神经并发症。

用中性粒细胞荧光与运动神经荧光杂交品系斑马鱼（呈绿色），患有高血糖的斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目增多，在荧光显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖产品。

服用一段时间降糖产品后，我们用荧光显微镜观察斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目

黄色框线内绿色荧光点代表中性粒细胞

可以看到，模型对照组的周围运动神经中性粒细胞数目较正常对照组明显增多，而降糖产品组斑马鱼明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖产品组斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目与模型对照组比较明显减少。

2.本实验证实了松花蛹虫草之类的降糖产品具有神经炎症消退功效。

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【评价原理】

体力疲劳常表现为肌肉出现僵硬、肿胀和疼痛，动作慢、不协调；反应迟钝，判断错误，注意力不集中等。斑马鱼大部分器官的作用机理与人类高度相似，而且斑马鱼生长发育周期短，器官发育较快，有利于开展缓解体力疲劳功效的研究。亚硫酸钠通过化学反应消耗水中的氧气，造成水中斑马鱼缺氧，经过一段时间诱发缺氧性疲劳。斑马鱼在氧气不足的情况下，机体自发活动将会减弱，同时，肌肉贮备糖原无氧酵解生成乳酸，乳酸堆积可使局部H+浓度升高，过量H+直接作用于肌原纤维，抑制肌动蛋白和肌球蛋白的结合，导致肌肉收缩能力下降，机体运动能力减弱。疲劳斑马鱼运动距离下降、乳酸堆积、氧自由基（ROS）上升、ATP酶含量降低。

我们评价疲劳有4个指标：（1）行为分析仪检测斑马鱼总运动距离；（2）酶标仪检测乳酸含量；（3）酶标仪检测ROS水平；（4）酶标仪检测ATP含量。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗疲劳剂组。其中正常对照组未经任何处理，模型对照组和服用抗疲劳剂摄入等量的亚硫酸钠以诱发斑马鱼疲劳模型（亚硫酸钠通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用抗疲劳剂组摄入亚硫酸钠的同时摄入中华跌打丸、红牛和脉动饮料之类的抗疲劳剂。

服用一段时间抗疲劳剂后，我们检测斑马鱼的总运动距离、乳酸含量、ROS水平和ATP含量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼运动轨迹图

黑线：斑马鱼静止运动轨迹；绿线：中速运动；红线：快速运动

可以看到，服用抗疲劳剂组的斑马鱼运动情况与正常对照组比较相似，没有明显的总运动距离减少。

图2. 斑马鱼乳酸含量

与模型对照组比较，*p<0.05

可以看到，服用抗疲劳剂组的斑马鱼乳酸含量比模型对照组明显降低。

图3. 斑马鱼ROS水平

与模型对照组比较，***p<0.001

可以看到，服用抗疲劳剂组的斑马鱼ROS水平比模型对照组明显降低。

图4. 斑马鱼ATP含量

与模型对照组比较，***p<0.001

可以看到，服用抗疲劳剂组的斑马鱼ATP含量比模型对照组明显升高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用抗疲劳剂组与模型对照组比较，总运动距离明显增加、乳酸明显减少、ROS水平明显降低、ATP含量明显升高。

2.本实验证实了中华跌打丸、红牛和脉动饮料等具有明显缓解体力疲劳功效。

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【评价原理】

益生菌的使用可以维持包括鱼类在内的动物及人体肠道微生态平衡，调节免疫力，增强斑马鱼的繁殖能力。

益生菌通过特异性染色（呈红色），肠道内益生菌增殖的斑马鱼肠道会明显变红，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是模型对照组和服用调节肠道菌群产品组。其中模型对照组与服用调节肠道菌群产品组都饲喂等量的益生菌（益生菌通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用调节肠道菌群产品组在饲喂益生菌同时摄入膳乐星益生菌固体饮料。

服用一段时间调节肠道菌群产品后，我们观察斑马鱼肠道内益生菌数量的变化。

【结果展示】

图1. 肠道益生菌表型图

红色荧光颗粒为肠腔内的益生菌

可以看到，经过调节肠道菌群产品处理的斑马鱼肠道益生菌比模型对照组明显增多。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用调节肠道菌群产品组的肠道益生菌数量与模型对照组的相比明显增多。

2.本实验证实了膳乐星益生菌固体饮料具有肠道菌群调节功效。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。高血脂患者由于血液中胆固醇、油脂含量过多，就会使过多油脂沉积于血管壁上，容易使动脉管壁增厚、变硬、失去弹性，导致动脉硬化。斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖脂负荷状态下表现出持续高血糖、高血脂现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病。

用转基因绿色血管荧光斑马鱼（呈绿色），患有高糖高脂的斑马鱼眼部血管壁厚度较正常斑马鱼明显增厚，在共聚焦显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖降脂产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖降脂产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖降脂产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖降脂产品。

服用一段时间降糖降脂产品后，我们用共聚焦显微镜下观察斑马鱼眼部血管壁厚度。

【结果展示】

图1. 斑马鱼眼部血管壁厚度

白色箭头所指为血管壁

可以看到，模型对照组的眼部血管壁厚度较正常对照组明显增厚，而降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖降脂产品组斑马鱼眼部血管壁厚度与正常对照组相近，并未出现模型对照组眼部血管壁增厚的情况。

2.本实验证实了松花蛹虫草具有眼部血管壁厚度增厚改善功效。

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【评价原理】

酒精进入人体后90%进入肝脏进行代谢，长期过量饮酒诱发酒精性脂肪肝，临床表现为肝脏受脂肪浸润。由于斑马鱼拥有与人类相似的消化系统，如肝脏、肠道等，消化和营养的吸收及运输与人类高度相似，在大量摄入酒精后，肝脏也会出现脂肪变性（酒精性脂肪肝）的情况。

经过脂肪特异性染色（呈红色），患有酒精性脂肪肝的斑马鱼的肝脏会明显比正常斑马鱼的肝脏要红很多，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用解酒剂组。其中正常对照组未摄入酒精，模型对照组与服用解酒剂组都摄入了等量的酒精（酒精通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用解酒剂组在摄入酒精的同时摄入RU21、海王金樽之类的解酒剂。

服用一定时间解酒剂后，我们对斑马鱼整体做脂肪特异性染色，观察肝脏的脂肪变化，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼酒精性脂肪肝表型图

黄色虚线区域为肝脏，肝脏内红色代表脂肪

可以看到，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组比较相似，没有明显的脂肪沉积。

图2. 肝脏病理切片

黄色箭头指向脂肪颗粒

从病理切片中也能看出来，酒精性脂肪肝斑马鱼的肝脏有很多脂肪颗粒，而服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组都没有出现类似的脂肪颗粒。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组相似，并未出现模型对照组的出现大量脂肪颗粒（酒精性脂肪肝）的情况。

2.本实验证实了RU21、海王金樽解酒剂具有疏肝解酒（酒精性脂肪肝防治）功效。

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【评价原理】

近三十年来，世界癌症发病率以年均3-5%的速度递增，癌症已成为人类第一位死因。肿瘤移植模型为快速筛选抗肿瘤药物提供巨大帮助。斑马鱼在早期仅有非特异性免疫，不具备完善的特异性免疫，对人肿瘤细胞不存在排斥反应。因此，斑马鱼可直接接种人肿瘤细胞来筛选广谱抗肿瘤药物。另外，斑马鱼与人肿瘤发生、发展相关的（凋亡、VEGF、Wnt、ALK等）信号通路上相似，可用于筛选靶向抗肿瘤药物。

1.肿瘤生长、转移

将荧光标记的人肿瘤细胞（呈红色）移植到野生型斑马鱼体内，肿瘤细胞在斑马鱼体内的生长和转移情况可以被观察到。

2.肿瘤部位新生血管

将荧光标记的人肿瘤细胞（呈红色）移植到转基因血管荧光斑马鱼（呈绿色）体内，肿瘤细胞刺激斑马鱼新生血管情况可以被观察到。

3.肿瘤细胞凋亡

将人肿瘤细胞移植到野生型斑马鱼体内，通过特异性荧光染色（凋亡细胞呈绿色），细胞凋亡情况可以被观察到。

4.肿瘤部位炎症

将人肿瘤细胞移植到转基因中性粒细胞荧光斑马鱼（呈绿色）体内，肿瘤部位炎症反应可以被观察到。

5.肿瘤病理

将人肿瘤细胞移植到野生型斑马鱼体内，制作成病理切片，观察肿瘤细胞的形态变化。

6.生存期

将人肿瘤细胞移植到野生型斑马鱼体内，统计斑马鱼每日存活率、计算其生存期。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品组。正常对照组不注射人肿瘤细胞，模型对照组与服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品组都注射了等量的荧光标记的人肿瘤细胞。服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品组注射等量的荧光标记的人肿瘤细胞后，摄入抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品。

服用抗肿瘤药/辅助抗肿瘤产品数天后，我们对斑马鱼进行图像采集，观察肿瘤细胞的生长和转移情况、细胞凋亡情况、炎症反应情况以及形态变化，同时计算其生存期。

【结果展示】

图1. 斑马鱼肿瘤生长表型图

红色部分为荧光标记的人肿瘤细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组的肿瘤细胞数量相比模型对照组明显减少。

图2. 斑马鱼肿瘤转移距离表型图

绿色为斑马鱼血管，红色颗粒为荧光标记的人肿瘤细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组的肿瘤转移距离相比模型对照组明显减少。

图3. 斑马鱼肿瘤部位新生血管表型图

绿色为血管，红色颗粒为人肿瘤细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组的血管结构与正常对照组比较相似，未出现模型对照组血管增多、增粗、紊乱、出芽的情况。

图4. 斑马鱼肿瘤部位细胞凋亡表型图

绿色为凋亡细胞，红色颗粒为人肿瘤细胞

可以看到，正常对照组未出现凋亡细胞，模型对照组一些凋亡细胞，服用抗肿瘤药组的出现大量的凋亡细胞。

图5. 斑马鱼肿瘤部位中性粒细胞表型图

绿色颗粒为中性粒细胞

可以看到，服用抗肿瘤药组斑马鱼肿瘤部位中性粒细胞较少，未出现模型对照组中性粒细胞募集情况。

图6. 斑马鱼肿瘤病理切片

绿色箭头指向人肿瘤细胞

可以看到，正常对照组斑马鱼腹腔内没有肿瘤细胞，模型对照组斑马鱼腹腔内可见较多的肿瘤细胞，肿瘤细胞多形性、核浆比增大、出现病理性核分裂。抗肿瘤药组斑马鱼腹腔内仅见少量肿瘤细胞，肿瘤细胞体积增大、核浆比增大。

图7. 斑马鱼生存期展示图

可以看到，服用抗肿瘤药组生存期与正常对照组斑马鱼相似，未出现模型对照组生存期明显缩短的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗肿瘤药组的肿瘤细胞数量、转移距离、新生血管数量较模型对照组明显减少；抗肿瘤药组肿瘤部位凋亡细胞较模型对照组明显增加；抗肿瘤药组肿瘤细胞形态较接近正常对照组。

2.经过每组60尾斑马鱼的对比实验，抗肿瘤药组斑马鱼生存期较模型对照组明显延长。

3.本实验证实了顺铂、康莱特、沙利度胺等抗肿瘤药具有显著的抗肿瘤作用。

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【评价原理】

药物主要通过影响血管生长因子的表达、阻滞血管生成因子受体的活性、抑制内皮细胞增殖、抑制基底膜降解和阻断内皮细胞特异性整合素等机制发挥抗血管生成作用。

利用特有的转基因血管内皮发荧光斑马鱼（呈绿色），摄入血管形成抑制剂的斑马鱼肠下血管面积会明显较正常斑马鱼的肠下血管面积变小，节间血管会断裂而失去完整性。由于转基因斑马鱼的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照组和服用/注射血管形成抑制剂组（血管形成抑制剂索拉非尼通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内，血管形成抑制剂恩度通过静脉注射吸收到斑马鱼体内）。

服用或注射一段时间血管形成抑制剂后，我们对斑马鱼进行荧光拍照，观察斑马鱼肠下血管和节间血管的变化。

【结果展示】

图1. 肠下血管表型图

黄色虚线区域为斑马鱼肠下血管

可以看到，服用血管抑制剂组的肠下血管面积明显小于正常对照组。

图2. 供试品对节间血管形成的抑制作用表型图

白色箭头指向断裂的血管

可以看到，注射血管形成抑制剂组的节间血管出现断裂。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，给予血管抑制组的肠下血管较正常对照组变小，节间血管较正常对照组失去完整性。

2.本实验证实了索拉非尼和恩度具有抑制血管形成作用。

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【评价原理】

癫痫发作是指大脑神经元广泛同步放电所致的大脑功能紊乱。若反复发作则称为癫痫或癫痫综合征。GABA是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质。戊四唑（PTZ）是γ-氨基丁酸（简称GABA）抑制剂，大剂量PTZ可诱导癫痫发作，是哺乳动物癫痫模型中的常用诱导剂。斑马鱼已被建议作为一种替代动物模型用于研究癫痫的机制和筛选抗癫痫药。用戊四唑诱导斑马鱼后，中枢神经系统受影响，斑马鱼幼鱼表现出运动行为异常(类似人类癫痫的痉挛)和c-fos基因表达的上调。

用行为分析仪记录斑马鱼的运动（快速运动类似于癫痫发作的线呈现红色），癫痫斑马鱼快速运动距离较正常斑马鱼明显增多。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和药物组。其中正常对照组未摄入PTZ，模型对照组与服用抗癫痫药物组都摄入了等量的PTZ（PTZ通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。抗癫痫药物组在摄入PTZ之前摄入苯妥英钠、丙戊酸钠之类的抗癫痫药物。

服用一段时间抗癫痫药物后，我们利用行为分析仪追踪记录斑马鱼的运动，同时检测与癫痫相关的c-fos和gabra1（GABA A受体α1）基因。

【结果展示】

图1. 斑马鱼癫痫表型图

红线代表快速运动距离（>20mm/s抽搐）

可以看到，模型对照组的快速运动距离较正常对照组明显增多，而抗癫痫药物组快速运动距离明显减少。

图2. c-fos和gabra1基因图

从基因图中也能看出来，模型对照组c-fos基因上调，gabra1下调，而抗癫痫药物组c-fos基因下调，gabra1上调。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗癫痫药物组斑马鱼运动与模型对照组比较，快速运动距离明显减少。

2.本实验证实了苯妥英钠、丙戊酸钠具有抗癫痫作用。

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【评价原理】

目前国际上公认的药物毒性与安全性评估实验方法分为体外与体内实验2种。斑马鱼实验为整体动物研究，能反映化合物吸收、分布、代谢与排泄的过程。而且，斑马鱼与人类基因组的相似度高达87%，有与人类近似的毒性特征和信号传导通路，斑马鱼的各种器官和组织在解剖学、生理学和分子水平上类似于哺乳动物，因此是一种可比性较强的模式生物，可以用于各种类型供试品的急性毒性评价。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体进行观察评价，观察斑马鱼心脏、脑部、耳、下颌、眼、肝脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、鳍、体长、身体着色、循环系统、身体水肿和出血等毒性反应情况，统计毒性发生率。

【结果展示】

图1. 斑马鱼胚胎毒性表型图

可以看到，服用/注射供试品组的眼变小、心包水肿、肝脏变性、卵黄囊吸收延迟、肾性水肿、胃肠道发育延迟。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的组织器官产生明显的急性毒性表型，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有急性毒性。

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