【评价原理】

斑马鱼的听觉外侧系统由内耳和侧线两个关键的感觉结构组成，斑马鱼具有典型的内耳结构，内耳的毛细胞和侧线的毛细胞在结构功能及分子水平上与哺乳动物的内耳毛细胞非常相似，包括对耳毒性药物的相似反应。

经过特异性荧光染色（呈绿色），听力损伤的斑马鱼比正常斑马鱼毛细胞明显减少或缺失（荧光减弱或者消失）。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和服用/注射供试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射药物一段时间后，我们对斑马鱼整体做毛细胞特异性染色，观察毛细胞的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼毛细胞表型图

绿色荧光颗粒为毛细胞

可以看到，服用/注射供试品组斑马鱼毛细胞减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼毛细胞明显减少，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼有听毒性。

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【评价原理】

甲萘醌是一种氧化剂，通过细胞内还原酶系统（微粒体的P450还原酶和线粒体的呼吸链还原酶），产生不稳定的半醌，进入氧化还原循环，产生活性氧族。用甲萘醌可诱导斑马鱼建立氧化应激模型。

经过特异性荧光染色（呈绿色，主要定位于细胞核和线粒体），发生氧化应激反应斑马鱼全身明显比正常斑马鱼绿很多，可以用荧光显微镜下观察到斑马鱼体内的活性氧含量。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和抗氧化剂组。其中正常对照组未摄入甲萘醌，模型对照组与抗氧化剂组都摄入了等量的甲萘醌（甲萘醌通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。抗氧化剂组在摄入甲萘醌之后摄入还原型谷胱甘肽之类的抗氧化剂。

服用一定时间抗氧化剂后，我们对斑马鱼整体做活性氧染色，观察整体绿色荧光强度的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼活性氧表型图

绿色荧光为活性氧

可以看到，抗氧化剂组的荧光强度较正常对照组强，但较模型对照组明显减弱。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，抗氧化剂组的荧光强度比模型对照组弱。

2.本实验证实了还原型谷胱甘肽具有明显抗氧化功效。

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【评价原理】

Caspase家族在细胞凋亡的调控上起着重要的作用。Caspase分为三大类：凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎症介导因子。凋亡启动因子在级联反应的上游，包括（Caspase-8和Caspase-9）等，能识别和激活下游的Caspase。Caspase-9参与线粒体途径介导的细胞凋亡。凋亡执行因子在级联反应的下游，包括Caspase-3和Caspase-7等，作用于其特异性底物并导致细胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中的，最重要的凋亡执行者之一，大多数引发细胞凋亡的因素，最终均需要通过caspase-3介导的信号传递途径，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志。

我们评价斑马鱼对caspase的诱导作用有3个指标：1.对caspase 3的诱导作用；2.对caspase 8的诱导作用；3.对caspase 9的诱导作用。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是正常对照和供服用/注射试品组（供试品通过溶解到养鱼用水中或注射的方式摄入到斑马鱼体内）。

服用/注射供试品一段时间后，利用特异性试剂盒检测斑马鱼体内caspase的活性。

【结果展示】

图1. 斑马鱼caspase3活性

与正常对照组比较，*** p < 0.001

图2. 斑马鱼caspase8活性

与正常对照组比较，*** p < 0.001

图3. 斑马鱼caspase9活性

与正常对照组比较，*** p < 0.001

可以看到，服用/注射供试品组与正常对照组比较caspase活性明显上升。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用/注射供试品组的斑马鱼caspase活性明显上升，与正常对照组存在明显的差别。

2.本实验证实了该供试品对斑马鱼caspase有诱导作用。

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光毒性检测是化妆品安全性评价的重要内容之一，皮肤接触到光敏性物质后，在光照下可能产生局部或全身的毒性效应。根据斑马鱼胚胎的生长发育状况可以评价受试物的光毒性。

【评价原理】

将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的受试物溶液，采用同等剂量的光进行照射，一定时间段后记录斑马鱼胚胎的死亡率，确定50%试验鱼胚胎死亡的受试物浓度，用LC50表示。

【实验方案】

配制一定浓度系列的受试物溶液，在斑马鱼发育初期（4hpf-6hpf）分别水溶加入受试物，同时设置正常对照组。受试物组经过同等剂量的光照后，分别观察每组斑马鱼的发育状况，以卵凝结、体节异常、尾部未分离等判定胚胎死亡。记录每组斑马鱼胚胎的死亡率，绘制“浓度-死亡率”效应曲线，计算LC50值。

【结果展示】

1、斑马鱼胚胎死亡判定

图1.斑马鱼胚胎死亡表型图

2、LC50值：“浓度-死亡率”效应曲线

图2. 斑马鱼胚胎“浓度-死亡率”效应曲线

【评价结论】

经实验比对，斑马鱼胚胎随着受试物浓度的增加逐渐出现死亡特征，LC50

值为31.5μg/ml。

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【评价原理】

机体供能主要分为有氧供能与无氧供能，在两种供能条件下ATP均源源不断的合成以维持机体活动的需求。通过ATP含量的测定，可以分析能量调节剂对斑马鱼能量代谢快慢的影响。如持续的促进能量代谢、增加机体能量消耗是行之有效的减肥措施，促进脂肪分解类减肥产品可明显增加斑马鱼体内ATP含量。

【实验方案】

将受测试斑马鱼分成2组，分别是正常对照组、能量调节剂组。服用一段时间能量调节剂后，我们利用ATP试剂盒检测斑马鱼体内ATP含量。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体内ATP含量

与正常对照组比较，***p<0.001

可以看到，服用能量调节剂的斑马鱼体内ATP含量明显比正常对照组高。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用能量调节剂的斑马鱼体内ATP含量与正常对照组相比明显升高，说明本次实验中选用的能量调节剂可促进ATP生成，促进能量代谢。

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【评价原理】

益生菌的使用可以维持包括鱼类在内的动物及人体肠道微生态平衡，调节免疫力，增强斑马鱼的繁殖能力。

益生菌通过特异性染色（呈红色），肠道内益生菌增殖的斑马鱼肠道会明显变红，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成两组，分别是模型对照组和服用调节肠道菌群产品组。其中模型对照组与服用调节肠道菌群产品组都饲喂等量的益生菌（益生菌通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用调节肠道菌群产品组在饲喂益生菌同时摄入膳乐星益生菌固体饮料。

服用一段时间调节肠道菌群产品后，我们观察斑马鱼肠道内益生菌数量的变化。

【结果展示】

图1. 肠道益生菌表型图

红色荧光颗粒为肠腔内的益生菌

可以看到，经过调节肠道菌群产品处理的斑马鱼肠道益生菌比模型对照组明显增多。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用调节肠道菌群产品组的肠道益生菌数量与模型对照组的相比明显增多。

2.本实验证实了膳乐星益生菌固体饮料具有肠道菌群调节功效。

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【评价原理】

酒精进入人体后90%进入肝脏进行代谢，长期过量饮酒诱发酒精性脂肪肝，临床表现为肝脏受脂肪浸润。由于斑马鱼拥有与人类相似的消化系统，如肝脏、肠道等，消化和营养的吸收及运输与人类高度相似，在大量摄入酒精后，肝脏也会出现脂肪变性（酒精性脂肪肝）的情况。

经过脂肪特异性染色（呈红色），患有酒精性脂肪肝的斑马鱼的肝脏会明显比正常斑马鱼的肝脏要红很多，由于斑马鱼通体透明的特点，可以明显被观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用解酒剂组。其中正常对照组未摄入酒精，模型对照组与服用解酒剂组都摄入了等量的酒精（酒精通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用解酒剂组在摄入酒精的同时摄入RU21、海王金樽之类的解酒剂。

服用一定时间解酒剂后，我们对斑马鱼整体做脂肪特异性染色，观察肝脏的脂肪变化，同时制作成病理切片观察肝脏的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼酒精性脂肪肝表型图

黄色虚线区域为肝脏，肝脏内红色代表脂肪

可以看到，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组比较相似，没有明显的脂肪沉积。

图2. 肝脏病理切片

黄色箭头指向脂肪颗粒

从病理切片中也能看出来，酒精性脂肪肝斑马鱼的肝脏有很多脂肪颗粒，而服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组都没有出现类似的脂肪颗粒。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用解酒剂组的肝脏情况与未摄入酒精的正常对照组相似，并未出现模型对照组的出现大量脂肪颗粒（酒精性脂肪肝）的情况。

2.本实验证实了RU21、海王金樽解酒剂具有疏肝解酒（酒精性脂肪肝防治）功效。

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化妆品中的功效活性成分是通过经皮吸收到达皮肤各层而发挥作用的，许多在体外试验中表现良好的活性物质在消费者实际使用过程中并未达到理想的功效结果，这与活性物的经皮吸收性能密切相关。

斑马鱼的皮肤结构与人体高度相似，因此活性成分在活体斑马鱼上的经皮吸收结果可以反映在人体皮肤上的吸收状况。

【评价原理】

    通过高效液相色谱法定量检测养鱼用水在孵育斑马鱼一段时间后的活性成分含量变化反映活性成分经斑马鱼的皮肤吸收状况，含量的减少量即为斑马鱼的经皮吸收量。

【实验方案】

我们将受试的斑马鱼分为三组，分别为正常对照组（不含活性物）、活性物对照组（不含鱼）和受试物组。在相同的温、湿度条件下孵育一段时间，在孵育前后分别检测各组中活性成分的含量。

【结果展示】

图1. 活性成分在不同组别中的色谱图

可以看到，受试物组的斑马鱼养鱼用水中的活性成分，在孵育后发生减少，减少量即为经皮吸收量。

【评价结论】

1、正常对照组的鱼水中未检测到活性成分，说明该方法不存在基体干扰；

2、活性物对照组孵育前后活性物含量无明显变化，说明在没有斑马鱼存在的孵育条件下活性物含量不发生变化；

3、受试物组，孵育后活性物含量明显低于孵育前，说明活性成分被经皮吸收至斑马鱼体内，经皮吸收量即为鱼水中的减少量。

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【评价原理】

糖尿病是一种由遗传基因决定的与感染、肥胖等环境因素促发有关的疾病，其基本病理生理为绝对或相对性胰岛素分泌不足引起的代谢紊乱。持续的高血糖水平导致糖尿病并发症发生，高血糖累及中枢和周围神经病变，出现神经炎症。感觉神经受损较为多见，出现麻木、触电、发热、蚁行感，运动神经受损则出现肌力下降。斑马鱼胰腺的形态发生和基本细胞结构、排列方式类似于哺乳动物，斑马鱼食欲调节（如血清素）和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统（包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌）的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖负荷状态下表现出持续高血糖现象，用高糖高脂饲料可以诱发斑马鱼高血糖，模拟人的二型糖尿病的神经并发症。

用中性粒细胞荧光与运动神经荧光杂交品系斑马鱼（呈绿色），患有高血糖的斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目增多，在荧光显微镜下可以观察到。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和降糖产品组。其中正常对照组未摄入高糖高脂饲料，模型对照组与服用降糖产品组都摄入了等量的高糖高脂饲料（高糖高脂饲料通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。降糖产品组在摄入高糖高脂饲料的同时摄入松花蛹虫草之类的降糖产品。

服用一段时间降糖产品后，我们用荧光显微镜观察斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目。

【结果展示】

图1. 斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目

黄色框线内绿色荧光点代表中性粒细胞

可以看到，模型对照组的周围运动神经中性粒细胞数目较正常对照组明显增多，而降糖产品组斑马鱼明显减少。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，降糖产品组斑马鱼周围运动神经中性粒细胞数目与模型对照组比较明显减少。

2.本实验证实了松花蛹虫草之类的降糖产品具有神经炎症消退功效。

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【评价原理】

Wnt是一种分泌的糖蛋白，发育调控的的wnt基因编码分泌的糖基化蛋白质，作用于细胞表面，大多数的wnt基因在机体伤口修复和再生需要组成受伤组织的各种细胞类型之间做协调。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分为体轴发育和断尾再生两种模型。

体轴发育评价分成两组，分别是正常对照组和服用Wnt信号通路抑制剂组（Wnt信号通路抑制剂LGK974通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用一段时间Wnt信号通路抑制剂后，对斑马鱼体轴长度进行测量，观察体轴长度的变化。

断尾再生评价分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和服用Wnt信号通路抑制剂组（Wnt信号通路抑制剂LGK974通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用一段时间Wnt信号通路抑制剂后，对斑马鱼尾鳍面积进行测量，观察尾鳍再生的变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼体轴发育表型图

黑色箭头所指为缺失的尾鳍

可以看到，服用Wnt信号通路抑制剂组的体轴长度较正常对照组明显变短。 

图2. 斑马鱼尾鳍再生表型图

红色区域为向尾鳍再生部位

可以看到，服用Wnt信号通路抑制剂组的斑马鱼尾鳍再生面积相比模型对照组明显变小。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验，服用Wnt信号通路抑制剂的体轴长度和尾鳍再生面积均小于正常对照组。

2.本实验证实了LGK974具有体轴发育和组织再生抑制作用，作用机制与抑制wnt信号通路相关。

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