6-OHDA损毁MFB造成的大鼠PD模型有两个明显的弊端:一是神经元急性死亡。6-OHDA注入后15分钟即可检测到DA含量的下降,在第30-60分钟时更加明显,3-5天内绝大多数神经元死亡。二是损伤严重。经APO诱发旋转7圈/分以上者,黑质内多巴胺能神经元的死亡率已经超过90%。可见这种模型对于研究多巴胺能神经元慢性进行性病变的全过程不甚理想。但由此得到启发,人们发现机械损伤MFB同样可以造成黑质内的多巴胺能神经元变性坏死,并且这种变化呈现慢性、进行性过程。已经建立的造模方法有MFB轴突切断术(medial forebrain bundle axotomy)和中脑半切术(hemitransection of midbrain)。(一)大鼠MFB切断术:1.操作步骤Wistar大鼠,雌性,体重185-210g。常规注射水合氯醛麻醉后,置于Kopf立体定位仪上固定。切开皮肤,暴露颅骨前囟。选择部位在前囟后3.8mm,中线旁开2.4mm处打孔。将Kopf公司(Kopf Instruments,Tuyunga,CA,USA)生产的可伸缩电线刀(retractable wire knife)垂直伸入孔内达颅骨平面下8mm处,固定外套管,将电线刀的刀刃由外套管中推出2.0-3.0mm。上提电线刀约2.5mm,然后下放回原处。再重复一次,以保证MFB充分切断。然后回收刀刃,退出电线刀。缝合皮肤(Lapchak PA等,1993)。2.模型检测(1)旋转行为学检测:术后4周,将大鼠腹腔内注射AMPH(5mg/kg)诱发大鼠旋转。计数90分钟内的旋转次数。(2)其它检测:病理和生化检测与6-OHDA损毁模型同。(二)中脑半切术(hemitransection of midbrain)1.操作步骤SD大鼠,雌雄不拘,体重200-250g。常规方法麻醉,立体定位仪上固定和暴露颅骨前后囟。在前囟后1mm,中线旁开0.5mm处打孔。将以特制的4mm宽的刀,沿与颅骨成68度角的方向,斜插入9mm,然后将刀退出。缝合皮肤。(Toffano G等,1984)2.模型检测(3)旋转行为学检测:术后8周,皮下注射APO(0.25mg/kg),诱发大鼠向健侧旋转。(4)其它检测:病理和生化检测与6-OHDA损毁模型相似。

酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。复性原理:在电泳过程中,SDS与样品中的MMPs结合(当然是可逆性结合),破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用,而只有当将胶置Trition中洗脱(最好是放在摇床上摇,30min/次,做2次或15min/次,4次。静置于Trition中是不妥的。)时,由于SDS被Trition结合而去除,从而使MMPs恢复了活性。

铝诱导痴呆模型是以阿尔茨海默型痴呆的铝中毒假说为基础的。铝具有神经毒性,据报道,阿尔茨海默型痴呆者脑组织内铝的含量明显比正常人高,其原因可能是病人血液中铁蛋白有缺陷,无法将血液中的铝适当的清除,多余的铝进入大脑后参与形成神经元纤维缠结和老年斑,损伤神经元,导致神经元纤维变性,大脑皮质萎缩。模型制作方法: Wistar大鼠,雄性,体重200-220g。大鼠每天灌胃,连续30天。观测指标与分析 : 海马内淀粉样前提蛋白阳性神经元数量计数:与正常组相比,模型组大鼠背海马和齿状回内前提蛋白阳性神经元明显增加。

模型制作方法 Wiistar大鼠,体重230-250g,雄性。(1)肝硬化模型复制:用40%四氯化碳油溶液每个3天进行背部皮下注射,同时辅以低蛋白、低胆碱、高脂肪、高胆固醇饮食。实验第6周时形成早期肝硬化;实验第九周时进入中晚期肝硬化阶段。(2)小剂量内毒素注射诱发肝性脑病:肝硬化动物于实验第9周时进行腹腔注射一次性小剂量注射大肠杆菌内毒素,注射剂量:300微克/100g体重。注射后1h、2h、3h、4h分别测定大鼠脑电图和观察动物一般行为状态变化,以此判断有无肝性脑病的发生。另设单纯内毒素注射组(正常大鼠腹腔内注射同等剂量的内毒素)、正常组及肝硬化对照组,后两组腹腔内注射同等剂量的无菌生理盐水。所有动物均于同一时间注射,注射前禁食过夜。观测指标与分析(1)内毒素注射前后动物症状及电脑图检查;(2)血浆内毒素、血氨、血浆胰高血糖素含量测定;(3)血液与脑内谷氨酰胺含量测定。实验热线：19931682702

克隆形成试验可反映细胞群体依赖性和增殖能力。一般细胞在体外增殖六代以上,其后代形成的细胞群体称为细胞集落或克隆。每个克隆由单一细胞而来,含有50个以上细胞,大小在0.3-1mm之间。通过克隆形成可检测各种理化因素对细胞克隆形成能力的影响。平板克隆形成试验可检测贴壁细胞细胞的克隆形成能力,软琼脂集落形成试验可检测非锚着依赖生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系等。基本步骤:1、取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%流程:1) 项目方案的确定,包括目的细胞、细胞处理方式及处理时间等。2) 细胞培养3) 克隆形成实验4) 克隆形成实验图片及实验报告实验热线：19931682702（同微信）

实验流程1、基因优化:靶基因序列设计,密码子优化并合成目的基因。2、载体-宿主系统优化:根据蛋白特性构建表达载体,转化质粒到高效表达的大肠杆菌中。3、表达条件优化:对重组的大肠杆菌进行摇瓶培养,并通过SDS-PAGE电泳检测对表达条件(时间、温度、IPTG浓度)进行严格控制和优化。4、纯化蛋白:对表达的蛋白采用亲和,离子或凝胶过滤层析等方法进行纯化。首选上清,次选蛋白复性。对实验用SDS-PAGE和Western Blot验证目标蛋白纯度正确性,按照客户要求进行分装或冻干。须知1、无污染的质粒,最小量不得低于100ng2、原始质粒图谱及序列文件3、插入基因后质粒的商业测序报告4、目标蛋白质相关信息5、最终蛋白一般保存在常规的缓冲液中(Tris-HCl,PBS)

细菌16S rDNA菌种鉴定16S rDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因。 长度约为1500pb,是细菌分类学研究中最常用、最有用的"分子钟16S rRNA其大小在1,500 bp左右,所代表的信息量适中,因此是进行分类研究的理想材料。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因,并进行DNA测序,与GenBank中的已知序列进行同源性比较后,判定细菌种类,将细菌划分到属或种  要求:  1. 请提供基因组DNA、经菌种分离后带有单菌落的新鲜平板或斜面。  2. 基因组DNA的浓度≥10 ng/μl,总体积≥20 μl,且无明显降解;平板或斜面应长有分离的单菌落。  3. 由于革兰氏阳性细菌或厌氧菌、放线菌等特殊菌株,请在服务委托书中加以说明。  4. 如果测序结果出现如下套峰,视为样品不纯,本公司将收取全额实验费用。并建议克隆多个测序鉴定。基本流程:  1. 进行引物设计合成;  2. PCR扩增16S rDNA;  3. PCR产物纯化;  4. 测序,序列比对分析。实验热线：19931682702（同微信）

诱发性肿瘤模型诱发性肿瘤动物模型指使用致癌因素(carcinogens)在实验条件下诱发动物发生肿瘤的动物模型,它是进行实验肿瘤学研究的常用方法.常用于验证可疑致癌因素的作用,也越来越多地应用于肿瘤发生机理的研究及防治效果的观察上,在肿瘤病因学,遗传学,生物学等方面的研究中有重要地位.由于诱发因素和条件可人为控制,诱发率远高于自然发病率,故在肿瘤实验研究中优于自发瘤.复制动物肿瘤的方法很多，如将实验动物用放射线照射或静脉、局部注射放射性同位素；使用各种化学致癌剂（烷化剂、多环芳香烃类、芳香胺类、氨基偶氮染料、亚硝胺类）；使用植物毒素（如苏铁素、Dihydrosafrole等）；使用金属（如铬、镍、砷、镉等）；使用RNA和DNA肿瘤病毒；使用多种致癌性霉菌毒素（其中致癌作用最强者为黄曲霉素）等，均可诱发成各种肿瘤。诱发性肿瘤模型其数量在诱发性动物模型中占首位。一般是利用致癌物质通过口服、注入、埋藏和涂抹等方式使动物发生肿瘤。1．肝癌　二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌：取体重250g左右的封闭群大白鼠，雌雄不拘。按性别分笼饲养。除给普通食物外，饲以致癌物，即用0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为10mg/kg，每周一次，其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用。共约4个月可诱发成肝癌。或单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌：用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2不应超过1.5～2mg/kg，4～6月就有大量的肝癌诱发成功。2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、犬、兔肝癌：给成年大鼠含0.03%2AAF标准饲料。每日每平均2～3mg2AAF（也可将2AAF混于油中灌喂），3～4月后有80～90%动物产生肝肿瘤。二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌：用剂量为每日0.3～14mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予，6～9个月后255/300大鼠发生了肝癌。亚胺基偶氮甲苯（OAAT）诱发小鼠肝癌：用1%OAAF苯溶液（约0.1ml含1mg）涂在动物的两肩胛间皮肤上，隔日一次，每次2～3滴，一般涂100次。实验后7～8周即而出现第一个肝肿瘤，7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。或用2.5mgOAAT溶于葵瓜子油中，给C3H小鼠皮下注射4次，每日间隔10天，也可诱发成肝癌。黄曲霉素诱发大鼠肝癌：每日饲料中含0.001～0.015ppm，混入饲料中喂6个月后，肝癌诱发率达80％。2．胃癌　甲基胆蒽诱发小鼠胃癌：取20g左右的小鼠，无菌手术下，在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC）线结。含MC的线结是用普通细线，在一端打结后，将线结置于盛 有MC小玻璃试管内，在酒精灯上微微加温，使MC液化渗入线结。MC浓度为0.05～0.1g20-甲基胆蒽内浸入10～20根线。手术埋线后4～8个月可诱发成功胃癌。用不对称亚硝胺，剂量为0.25ml/kg体重，3个月后全部动物发生前胃乳头状癌，7～8个月后有85～100%发生前胃癌。昆明种最敏感。A系次之，615系小鼠敏感性最差。此外还可用甲基亚硝基醋酸尿素给BD大鼠饮水中加2mg/kg体重，每周5次饮用，520天后全部大鼠均发生了腺胃癌。3．食管癌 MBNA诱发大鼠食管癌：取体重100g以上的Wistar大鼠，任其食用含MBNA的饮水，并将MBNA掺入饲料中使每日摄入量达0.75～1.5mg/kg体重。80～100天可诱发成食管癌。也可用Dihydrosafrole，它是一种制备啤酒的调味品，在大鼠饲料中加入百万分之二千五百至一万（2500～10000ppm）Dihydrosafrole，就能引起20～75%的食管癌。用0.2%或0.005%的MBNA水溶液，给动物经口灌喂，每天一次，大鼠灌注剂量为1mg/kg体重，至第27天即发现一例食管乳头状瘤，154天发现第一例食管癌，11个月食管癌的发生率为53%。4．肺癌　二乙基亚硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌：小白鼠每周皮下注射1%DEN水溶液一次，每次剂量56mg/kg，DEN总剂量达到868mg，观察时间为100天左右时，发癌率可达40%。而DEN总剂量达到1176mg，观察时间为半年左右时；发癌率可达94%。乌拉坦诱发肺腺癌：小鼠（A系，1～11/2月龄）较大鼠敏感，每次每只腹腔注入10%乌拉坦生理盐水液0.1～0.3ml，间隔3～5日再注，共注2～3个月，每只小鼠用量约为100mg，注后3个月肺腺癌发生率为100%，而且多数为多发性，这种诱发瘤为良性。此外还可用气管内注入苯并芘、硫酸铵气溶胶、甲基胆蒽等诱发肺癌。如猴气管内注入3，4苯并芘（苯并花为3～15mg与等量之Fe2O3混合液），每周一次，共10次，6只猴中有2只诱发肺的鳞状上皮癌。亦有人用硫酸胺气溶剂给100只大鼠吸入，13个月后所有大鼠都发生了肺腺癌。用0.2%明胶作悬浮剂将甲基胆蒽混合后给金地鼠气管内注入，每次0.1ml（含甲基胆蒽5mg）每周一次，共6次，53周后有62.5%动物发生了肺癌。5．鼻咽癌　二甲基胆蒽（MC）诱发大鼠鼻咽癌：取直径2～3mm的硬质塑米管，在酒精灯上小火拉成锥形，每段长约87.5px，管内填以结晶体MC。小管一端用火封闭，以防药物外溢，尖端用针刺数孔，使MC能从小妃溢出。取体重120g左右的大白鼠，雌雄均可，麻醉后，由前鼻孔将上述含MC的塑料小管插入鼻腔，利用前鼻孔较小管粗端为小的特点，稍加用力，迫使小管全部进入鼻腔内，其尖部可达鼻咽腔。不需另加固定，即可使小管长期留于鼻腔内。待到预定时间（半年以上），或动物自行死亡时，到其鼻咽部，10%福尔马林固定，脱钙后，石蜡包埋，进行连续切片。发癌率可达60%以上。二乙基亚硝胺滴鼻法诱发鼻咽癌：取120g左右大白鼠，雌雄均可，麻醉后，用磨平针尖的8号针头，从前鼻孔轻轻插入，针尖可达鼻咽腔。经注射器灌注用1%吐温-80新配的33.3%DEN混悬液0.02ml(含DEN6.7mg)每周1次，共15～20次，可诱发成鼻咽癌。6．宫颈癌　取雌性小白鼠，以附有0.1mgMC的棉纱线结在动物不麻醉的状态下，借助于阴道扩张器及磨纯的弯针，将线穿入宫颈。经右宫角背部穿出，使线结固定于宫颈口。线的另一端则固定于背部肌肉，缝合皮肤，挂线以后，同日开始连续注射青霉素2～3天。以防术后感染。至一定时间（半年左右）处死动物，宫颈组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片。7．结肠癌　给四周龄的雄性大白鼠，皮下注射二甲基苄肼（Dimethlhydrazine,DMH）每周一次，连续21周，每次DMH21mg/kg。最后一次给药后1～4周，处死动物。降结肠部位用Bouin液固定，脱水，石蜡包埋，切片。所用之DMH先配成每100ml含400mg的母液，并加EDTA37mg，用氢氧化纳（0.1N）液将pH调至6.5备用。慢病毒，腺病毒，RNAI，WB，RT-PCR，EMSA，蛋白表达，抗体制备，蛋白组学，质谱分析，基因芯片，micoRNA研究系列，原代培养，动物实验，鸭乙肝新药筛选，心脑血管病新药研究，新药药理学实验实验专线：19931682702（同微信）

脊髓损伤是一种致残率很高的疾 病, 给家庭、社会均带来沉重的负担。 随着工业、建筑业和交通 运输的飞速发展, 脊髓损伤患者数量呈逐年上升趋势。常用的造模方法有以下几种:1)脊髓撞击伤模型2)脊髓压迫伤模型3)脊髓横断损伤4)脊髓牵拉损伤模型5)脊髓缺血性损伤实验专线：19931682702（同微信）

实验介绍细胞迁移与侵袭实验将 Transwell 小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤一、材料准备可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)二、步骤和流程2.1基质胶铺板用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。② 24孔板下室一般加入600μl含20S的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。2.4结果统计直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。实验专线：19931682702（同微信）