模型制作方法： SD大鼠，体重165g-250g，雌雄兼用。（1）分组 根据皮层体感诱发电位（CSEP）P1-N1波幅变化随机分组。A组：空白对照；B组：脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅下降术前波幅30%(结果表明脊髓损伤不明显）；C组：脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅下降术前波幅50%；D组：脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅下降术前波幅70%.（2）动物模型制作 以5%水合氯醛（6ml/kg）腹腔内注射麻醉大鼠，动物置于25-30℃温度下，腰背部脱毛，俯卧位固定，在放大镜下以T13-L3棘突及椎板，用血管钳咬除T13-L2棘突、椎板、黄韧带等。暴露T13-L2相应部位脊髓并保持脊髓完整，将脊髓撑开器固定在T12-L2椎体横突上，纵向牵张，每10s内撑开1mm，间歇5min至实验室要求的波幅后持续10min。即B、C、D三个模型组脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅分别下降术前波幅的30%、50%、70%。 观测指标与分析：（1）皮层体感诱发电位监测；（2）神经功能检测；（3）脊髓病理学检查。实验热线：19931682702

细胞培养技术也叫细胞克隆技术,在生物学中的正规名词为细胞培养技术。细胞培养,既包括微生物细胞的培养,细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞,这是克隆技术必不可少的环节,而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来,所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。细胞的生长需要营养环境,用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。细胞培养泛指所有体外培养,其含义是指从动物活体体内取出组织,于模拟体内生理环境等特定的体内条件下,进行孵育培养,使之生存并生长。细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域,成为最重要的基础科学之一。优点1、能长期传代,保持活性,便于监控检测结构功能和生命活动。2、培养条件可以人为的控制便于研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响3、可用于各种观察和检测手段研究活细胞的变化(变异、分化)。可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达。4、研究范围和细胞来源广泛,选择性广。5、不同代次细胞可长期保存,既可开展同代次不同条件和方法研究,又可观察不同代次的动态变化。6、耗资少、经济、成本低、可大量培养,利于生物制品的生产。实验热线：19931682702（同微信）

简介:梅尼埃病(Ménières disease)是一种特发性内耳疾病,该病主要的病理改变为膜迷路积水,临床表现为反复发作的旋转性眩晕、波动性听力下降、耳鸣和耳闷胀感。已知的病因包括以下因素:各种感染因素(细菌、病毒等)、损伤(包括机械性损伤或声损伤)、耳硬化症、梅毒、遗传因素、过敏、肿瘤、白血病及自身免疫病等。豚鼠自身免疫免疫性梅尼埃病模型采用同种内耳抗原免疫豚鼠,部分动物能够对同种内耳抗原产生免疫应答,导致了单侧或双侧听力受损,并出现眼震等梅尼埃病症状。 模型制作方法:豚鼠,体重350g-400g,雌雄兼用。抗原制备 同种内耳抗原(GPCAG)取自豚鼠新鲜期骨。处死豚鼠后立即在解剖显微镜下取出迷路组织,置放与4℃0.01mol/l PH7.2的PBS中捣碎,匀浆,2500r/min离心10min,取上清液在751紫外分光光度计测定蛋白的含量,将蛋白浓度调到1200ug/ml。制成后立即免疫动物或加1/10000NaN3低温保存。豚鼠免疫方法 以同种内抗原400ug/0.05ml+CFA0.5ML,于豚鼠后足及背部皮下注射,第14天重复注射1次;第28天GPCAG 400ug/0.5ml+CFA0.5ml,于豚鼠背部多点皮下注射,第42天重复第28天注射1次。免疫后第9周检测动物模型是否成功。观测指标与分析: (1)、白细胞移动抑制试验;(2)、血清抗特异性内耳抗体;(3)循环免疫复合物;(4)、耳蜗电图测试耳蜗微音电位和AP;(5)内耳石蜡切片;(6)、内耳酶免疫组化学。如实验动物出现符合四个条件,即判断为动物模型成功。实验热线：19931682702

简介:蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。原理:Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western Blot显色的方法主要有以下几种:i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。实验热线：19931682702（同微信）

一.固定、脱水、包埋取组织放入4%多聚甲醛里面固定3-4小时,时间根据标本大小适当调整。取适当大小组织放入包埋盒中,进行脱水。每个染缸液体体积约200ml,每次脱水可以装20个包埋盒。依次进入:75%酒精1.5小时、95%酒精1.5小时、95%酒精1小时、无水乙醇1.5小时、无水乙醇1小时、二甲苯一号0.5小时、二甲苯二号0.5小时。打开包埋机,分别开启冷台,冷点,石蜡槽,组织槽进行工作。然后用铁饭盒承装石蜡块并放入包埋机组织槽中加热溶解。将脱水后的组织连同包埋盒依次放入机器组织槽中,然后再放入石蜡饭盒一号进行第二遍浸蜡,然后石蜡饭盒二号,进行三次浸蜡。选大小符合的模具,先调整机器滴蜡的速度,不宜过快防止有气泡。然后在模具中滴入液体石蜡,然后从饭盒二号中拿出浸后的包埋盒,打开用镊子取出组织放入模具中。然后用包埋盒的另一半盖住模具,再滴入少许石蜡后放到冷台上冷却。按上述步骤继续包埋下一个蜡块。二.切片、制片打开切片机,固定蜡块(可提前4度冰箱预冷一下),调整刀片和蜡块的距离。然后调整切片厚度,先粗切,看到完整的蜡片并且有组织后切换厚度,调整到自己想要切的厚度。用力均匀,右手摇动切片,左手用毛笔接片。如片子打卷,可以用毛笔按着蜡片的边缘再缓慢切,这样可以得到相对平整的片子。用毛笔和镊子将片子或者带状片子托起,放入水槽中展片,水温在40度左右。然后用防脱片载玻片轻轻捞起,载玻片的边缘尽量不要触碰水槽底部,防止底部气泡上浮残留在片子上。然后标注切片编号放到烤片机上烤片30分钟。三.组织化学染色室温脱蜡、水化:二甲苯一号10分钟、二甲苯二号8分钟、二甲苯三号8分钟、无水乙醇5分钟、90%乙醇3分钟、80%乙醇3分钟、70%乙醇3分钟。蒸馏水3分钟*3次,PBS3分钟*3次。热抗原修复,换新的切片架,放入水化后的切片。配置抗原修复液(一包柠檬酸钠粉末配置2升PBS溶液),用铁饭盒或者锅加热煮沸。温度控制在96-98度。然后将切片放入热锅中15分钟,最后自然冷却室温。PBS五分钟*2次,蒸馏水3分钟*2次。免疫组化笔画圈:取出组织,甩干水分,可用吸水纸吸干水珠。用组化笔画圈围住组织,圆圈完整。灭活内源酶活性:将切片放入湿盒中,盒中加入少量蒸馏水,滴加3%过氧化氢(二抗试剂盒中A一滴或者50微升,剂量详见二抗说明书),室温孵育10分钟。PBS三分钟*3次,蒸馏水水洗三分钟。封闭非特异性位点:甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封闭液(二抗试剂盒B一滴或者50微升),放入湿盒内,室温10分钟。甩掉封闭液,滴加一抗盖住组织,然后放入湿盒内4摄氏度过夜。(一抗浓度见抗体说明书,提前稀释后分装,并在负二十度冰箱保存。每张片子一抗剂量不定,看组织面积大小,xxxxx癌组织一张20微升左右。第二天,4度冰箱取出湿盒,室温复温30分钟,PBS三分钟*三次,蒸馏水洗涤三分钟。甩干水分,吸干水珠,滴加二抗(二抗试剂盒C)一滴或者50微升,室温孵育10分钟。PBS三分钟*三次,蒸馏水水洗三分钟。每张片子滴加一滴或者50微升链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(二抗试剂盒D),室温孵育10分钟,PBS三分钟*三次,蒸馏水水洗三分钟。每张片子滴加两滴或者100微升DAB溶液,显微镜下观察3-10分钟。染色合适即可终止染色,自来水冲洗。苏木素复染,1-2分钟,细胞核变蓝色即可终止,自来水或者PBS冲洗反蓝(可用0.5%氨水反蓝)。1%盐酸酒精分化3秒,自来水冲洗三分钟。脱水:70%酒精1分钟、80%酒精1分钟、95%酒精2分钟、无水乙醇4分钟、二甲苯一号3分钟、二甲苯二号3分钟。凉干片子后滴加适量中性树胶封片,盖上盖玻片,小心气泡。晾干半天即可。显微镜/全景扫描下拍照实验热线：19931682702（同微信）

比格犬是最常用的实验用犬，已成为实验研究型中最标准的动物，在国外，它已被广泛用于生物化学、微生物学、病理学、病毒学、药理学以及肿瘤学(如癌的病因学和癌的治疗学等)等基础医学的研究工作中，而农药的各种安全性试验，特别是农药工业中的各种实验，使用该犬最多。性情温和，易于驯服和抓捕，亲人。遗传性能稳定，在研究工作中为了得到重复性好而稳定，Beagle 品种固定且优良，一般无遗传性神经疾患。反应的一致性，形态体质均一，由于它血液循环系统很发达，且器官功能也是一致的，表现在体温稳定，又比杂种犬体温低0.5C，因此在实验中反应一致性好，尤其在实验中对环境的适应力、抗病力较强。性成熟期早，约8~12个月，产仔数多。由于该犬性格温顺，容易调教，遗传性疾病少，实验重复性好，尤其适合药理、循环生理、眼科、毒理、外科学等的研究，被国际医学、生物学界公认为较理想的实验用犬。实验专线：19931682702（同微信）

将动物机体的各种组织从机体中取出，采用酶消化、机械法等途径使其分散成单细胞，并置于合适的培养基中培养。细胞得以存活、生长、繁殖。原代细胞相比较细胞系更能反应机体原有的特性，用于科学研究时更具有针对性和说服力。原代动物细胞分离培养包括上皮来源(表皮、乳腺上皮、子宫颈上皮、肝、胃上皮、胰腺、肾小管上皮、气管及支气管上皮、前列腺、口腔上皮、内皮等)细胞分离培养。结缔组织来源(成纤维、巨噬、脂肪组织、软骨、骨、破骨、血液等)细胞分离培养。神经组织来源及肌肉组织来源(骨骼肌、肌肉)细胞分离培养。实验热线：19931682702（同微信）

近年来为建立一种逐渐发生发展的心肌梗塞模型,较为广泛地使用了一种遇水膨胀的纤维素环(Ameriod),这种纤维素环套在预期闭塞的冠状动脉上,环外边以金属圈(如不锈钢)固定起来,手术后两周或更长的时间内可将冠状动脉逐渐闭塞。这种模型制造较易,动物生存率高。但即是使用这样的方法,仍然缺乏人类的动脉粥样硬化的病理学基础。近来有报告指出,家猪可以喂饲高脂饮食形成冠状动脉的粥样硬化,引起心肌缺血,又可以通过改变饮食或治疗使动脉粥样硬化的斑块消退。看来,这是值得注意探索的目标。国内有关心肌缺血和心肌梗塞模型的复制方法:1.电刺激法 是近年建立的一种造成动物实验性心肌缺血的较新方法。实验一般用成年雄性家兔,麻醉后用定向仪插入两支涂绝缘漆的不锈钢针,以弱、强刺激(弱刺激为0.8～1.6mA,强刺激为4～8mA)交替刺激右侧下丘脑背内侧核,每次刺激5分钟,间隔1～3分钟。2.药物法 亦为近年来采用的一种方法。最常使用的造型药物为4%异丙基肾上腺素,给大鼠皮下注射50mg/kg体重;或将药物加入500ml盐水中从家兔耳静脉匀速(4小时)滴入,每公斤体重可分别给药10、20、30mg,或直接将药物注入腹腔均可造型。也可用麻醉犬静脉给予麦角新硷0.2mg/kg 体重,造成冠状动脉痉挛。3.冠脉阻断法 结扎冠状动脉是制作心肌梗塞模型的最常用方法。一般选用成年健康犬或家兔,麻醉后开胸,多结扎其冠状动脉前降支阻断心肌供血,引起病变;也有人采用闭胸式选择性冠状动脉插管法,即在荧光屏下将心导管由麻醉犬的颈动脉切口处插入,沿主动脉壁直抵左窦底部,将其尖端送至左冠状动脉内约2cm深处,向导管内注入120mg/kg体重的汞,形成急性心肌梗塞。亦有人用冠状动脉周围套线牵拉法使其不完全阻断,以形成家兔急性缺血性濒危心肌模型。为了更接近自然状态下心肌缺血的变化,近来有的单位用清醒犬作急性缺血和梗塞模型。先将犬麻醉,然后分离冠状动脉长约10毫米,套上冠状动脉压迫环,用注水压迫阻断冠状血流,观察犬在清醒状态下的心肌缺血反应与药物效应。此外,还有用离体大鼠心脏冠脉结扎复制出超微结构的心肌缺氧损伤模型。实验热线：19931682702（同微信）

染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。常见问题:1.ChIP是什么?答:染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。2.ChIP有哪些应用?答:近年来由于该技术不断的发展和完善,其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用,发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用,发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。3.ChIP技术的原理?答:生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。4.做ChIP试验,必须做甲醛固定么?答:不一定,视样品及试验方案而定。做甲醛固定的为X-ChIP,而不需要固定的为N-ChIP。甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。5.为什么必须将DNA切碎至少于1000bp大小(大约3个核小体 ~400-500bp)?答:为确保ChIP实验有良好精度。若您的平均片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含您目标序列的DNA,但所要研究的蛋白会离您目标序列有700个核苷酸的距离。6.为什么使用鲑鱼精子DNA来封闭琼脂糖珠子?为什么我的样品中鲑鱼精子DNA不会发生PCR反应?答:鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。实验者不太可能对鲑鱼组织做ChIP实验,所以此DNA不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。7.引物最佳设计是什么样的?答:引物长度应为24个核苷酸,应含有50%GC碱基对,Tm值为60°C。不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。不必考虑基因组内不独一序列。8.您推荐下如何从琼脂糖(或琼脂糖凝胶)中洗脱抗体-蛋白-DNA复合物,用来做re-ChIP试验?答:在ChIP分析试剂盒内可找到洗脱缓冲液,用它洗脱复合物。对于re-ChIP,有必要添加蛋白酶抑制剂到免疫沉淀洗液和洗脱缓冲液,及第二轮实验用的稀释缓冲液。请确定所有溶液处于低温,蛋白质不会因此而在收集第一次免疫沉淀的复合物或第二次免疫沉淀时降解。9.蛋白A琼脂糖能被用于小鼠IgM?答: 蛋白质A不能与小鼠IgM结合。可以考虑用一个桥接抗体连接。10.在做ChIP之前,有办法纯化细胞核么?答: 在细胞与甲醛交联后,细胞核可通过“溶胀缓冲液”培育及剪刀细胞均质器(dounce homogenization)制备(至少10倍体积)。   溶胀缓冲液:   25M Hepes, pH 7.8   1.5mM MgCl2   10mM KCl   0.1% NP-40   1mM DTT   0.5mM PMSF   蛋白酶抑制剂混合剂   然后按照protocol在SDS裂解液中裂解11.ChIP超声波的最佳条件?答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。12.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:13.ChIP超声波的最佳条件?答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。14.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:15.什么是input DNA? Output DNA?从染色质上获得的未做过IP的已经被逆转交联的DNA. 它是检查PCR是否有效的对照。Output DNA是来自每次IP实验的DNA.其实就是genomic DNA. 在ChIP实验中, sonication 或酶解后, 样本取部分不做IP, 直接逆转交联. 它的最主要的作用就是检查PCR系统是否work. 通常情况下, 在该条道中,都可以看到条带的.如果没有,说明PCR系统不work.16.为什么ChIP试验需要用经验证的抗体?抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的,有的抗体识别的抗原表位比较小,不容易暴露,在ChIP实验中容易被DNA包裹,从而使抗体无法结合,因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的,商业化的抗体都应该是验证过的。17.什么是reChIP技术?ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为 通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。实验热线：19931682702（同微信）

实验流程1、基因优化:靶基因序列设计,密码子优化并合成目的基因。2、载体-宿主系统优化:根据蛋白特性构建表达载体,转化质粒到高效表达的大肠杆菌中。3、表达条件优化:对重组的大肠杆菌进行摇瓶培养,并通过SDS-PAGE电泳检测对表达条件(时间、温度、IPTG浓度)进行严格控制和优化。4、纯化蛋白:对表达的蛋白采用亲和,离子或凝胶过滤层析等方法进行纯化。首选上清,次选蛋白复性。对实验用SDS-PAGE和Western Blot验证目标蛋白纯度正确性,按照客户要求进行分装或冻干。须知1、无污染的质粒,最小量不得低于100ng2、原始质粒图谱及序列文件3、插入基因后质粒的商业测序报告4、目标蛋白质相关信息5、最终蛋白一般保存在常规的缓冲液中(Tris-HCl,PBS)实验热线：19931682702（同微信）