七鳃鳗LIP作为铁死亡的诱导剂调控胚胎发育的分子机制丨全新研究

2022年8月17日，辽宁师范大学七鳃鳗研究中心逄越教授课题组在《Cell Communication and Signaling》（IF: 7.525）上发表了题为“Lamprey immune protein triggers the ferroptosis pathway during zebrafish embryonic development”的研究论文[1]。

该研究团队基于Tet-on系统构建了条件型过表达LIP转基因斑马鱼，过表达LIP蛋白的转基因斑马鱼出现心包和卵黄囊水肿等表型特征，心包腔出现大面积的细胞死亡，并且斑马鱼生长发育受到显著抑制。团队通过多个发育时间节点的RNA-seq技术，明确LIP介导铁死亡信号通路调控生长发育。

● 综述

2014年课题组在七鳃鳗独特的神经轴体（supraneural body）组织中分离并鉴定七鳃鳗免疫蛋白LIP，其对肿瘤细胞具有特异性的识别和高效率的杀伤作用[2]。2021年课题组证明miR-4561通过靶向lip调控七鳃鳗生长发育[3]。然而，LIP调控七鳃鳗生长发育的机制尚不清楚。

七鳃鳗作为一种变态生物，其生命周期中有几个重要发育阶段，如胚胎期、仔鳗、幼鳗、亚成体及成体期，这极大地增加了七鳃鳗的人工繁殖难度。尽管团队已经成功实现七鳃鳗人工繁育的工作，但要将其繁育到成体期仍存在着很多的技术难题。因此，建立一个合适的七鳃鳗基因过表达或敲除模型来探究LIP的生物学功能是困难的。与七鳃鳗相比，斑马鱼遗传背景稳定，基因组完整，遗传操作简单，建立转基因斑马鱼模型是研究七鳃鳗LIP基因功能的好选择。

研究团队基于Tet-on系统构建了条件型过表达LIP转基因斑马鱼，过表达LIP蛋白的转基因斑马鱼出现心包和卵黄囊水肿等表型特征，心包腔出现大面积的细胞死亡，并且斑马鱼生长发育受到显著抑制。团队通过多个发育时间节点的RNA-seq技术，明确LIP介导铁死亡信号通路调控生长发育。

● 研究结果

研究人员探究了LIP与铁死亡发生的相关性，发现LIP过表达转基因斑马鱼中的铁死亡标记分子在转录水平和蛋白水平均出现显著变化，LIP过表达转基因斑马鱼表现铁过载、脂质过氧化和谷胱甘肽耗竭等铁死亡生理代谢特征。维生素E补救实验可阻断脂质过氧化造成的铁死亡，并成功抑制LIP过表达引起的心包和卵黄囊水肿。

此外，使用柠檬酸铁铵或去铁胺对铁代谢进行调节并诱导或抑制铁死亡发生，其引发的表型特征与过表达LIP转基因斑马鱼诱导的表型特征一致，这表明LIP蛋白通过诱导斑马鱼的铁死亡进而调控生长发育。为进一步明确LIP与铁死亡的相关性，研究人员对转基因斑马鱼心脏进行电镜观察发现心肌细胞出现显著的铁死亡特征（线粒体变小，膜密度增高，嵴减少）和水肿现象，见图1。

图1.LIP过表达诱导斑马鱼铁死亡导致其水肿

A：斑马鱼胚胎发育4个时期（19、36、60 和 96hpf）的铁死亡标记分子的Western Blot检测；B-D：斑马鱼胚胎铁含量(B)、MDA含量(C)、T-GSH含量和GSH/GSSG比率(D)的代谢检测；E：斑马鱼幼鱼的代表性表型分为4组，P1为无水肿，P2为轻度水肿，P3为严重水肿，P4为极严重水肿；F：维生素E对过表达LIP斑马鱼存活率的影响；G：维生素E对96hpf斑马鱼拯救后的表型分级及代表性图片；H：柠檬酸铁铵和去铁胺对96hpf斑马鱼铁死亡调控后的表型分级；I：透射电子显微镜对斑马鱼心脏的亚显微结构检查显示异常水肿和线粒体变化，粉色为细胞核，蓝色为正常线粒体，红色为铁死亡后的线粒体。

在明确LIP诱导铁死亡导致水肿并抑制机体发育后，研究人员探究了LIP诱导铁死亡的调节机制，通过siRNA技术对转录组数据筛选到的2个重要的铁死亡标记分子（tfr1a和acsl4a）进行RNA干扰，发现干扰acsl4a的表达降低LIP介导铁死亡导致的水肿表型，同时干扰tfr1a和acsl4a的表达将显著抑制LIP过表达引起斑马鱼水肿的表型，见图2。此外，罗格列酮（acsl4a的小分子抑制剂）和二氢青蒿素（tfr1a的小分子抑制剂）也可显著抑制LIP引起的水肿表型。

图2.LIP过表达通过tfr1a和acsl4a诱导铁死亡的发生

A-D：siRNA技术干扰斑马鱼tfr1a基因表达的代表性表型(A)、效率(B)、存活率(C)和表型分级(D)。E-H：siRNA技术干扰斑马鱼acsl4a基因表达的代表性表型(E)、效率(F)、存活率(G)和表型分级(H)。I-L：siRNA共沉默斑马鱼tfr1a和acsl4a基因的代表性表型（I）、效率（J）、存活率（K）和表型分级（L）。

综上所述，该研究发现了LIP蛋白可作为一种铁死亡的诱导剂，导致组织水肿并抑制个体生长发育。该研究表明LIP是调控铁代谢和脂质氧化的重要分子，并加深了人们对七鳃鳗独有的免疫分子LIP功能的认知，见图3。

图3.LIP介导铁死亡的分子机制

● 讨论

在过去几年里，诱导癌细胞发生铁死亡被认为是一种安全有效且前景广阔的癌症治疗新策略。团队在之前的研究中发现LIP蛋白具有选择性识别并杀死癌细胞的能力[4]，且肿瘤细胞的死亡形态与铁死亡相似，提示LIP可能是通过诱导铁死亡发挥肿瘤杀伤活性。这项全新研究结果表明，七鳃鳗LIP蛋白对铁代谢、脂代谢和生长发育具有重要的调控作用。

在漫长的进化历程中，绝大多数与七鳃鳗同时期的物种都已灭绝，而现存的七鳃鳗作为“活化石”记载着脊椎动物起源的整个过程，从溯源研究人类和高等哺乳动物的遗传、进化、发育及生理特征等方面，七鳃鳗有着不可替代的作用。七鳃鳗作为地球上古老和神秘的生物之一，值得更多的学者去探索其奥秘。同时也期待与国内外的同行携手深入开展七鳃鳗的全方位研究，更好地造福于人类的生命健康事业。

辽宁师范大学为第一作者和通讯作者单位，该研究得到国家自然科学基金、辽宁省“兴辽英才计划”科技创新人才及辽宁省教育厅重点研究等项目的资助。环特生物为本项目研究提供了定制的斑马鱼品系。

参考文献：

[1] Du Z, Zhang D, Li J, Li Q, Pang Y. Lamprey immune protein triggers the ferroptosis pathway during zebrafish embryonic development. Cell Commun Signal. 2022;20(1):124. doi: 10.1186/s12964-022-00933-0.

[2] Pang Y, Li C, Wang S, Ba W, Yu T, Pei G, Bi D, Liang H, Pan X, Zhu T, Gou M, Han Y, Li Q. A novel protein derived from lamprey supraneural body tissue with efficient cytocidal actions against tumor cells. Cell Commun Signal. 2017;15(1):42.doi: 10.1186/s12964-017-0198-6.

[3] Ma L, Gou M, Du Z, Zhu T, Li J, Li QW, Pang Y. MicroRNA expression profile in Lampetra morii upon Vibrio anguillarum infection and miR-4561 characterization targeting lip. Commun Biol. 2021;4(1):995. doi: 10.1038/s42003-021-02525-z.

[4] Pang Y, Gou M, Yang K, Lu J, Han Y, Teng H, Li C, Wang H, Liu C, Zhang K, Yang Y, Li Q. Crystal structure of a cytocidal protein from lamprey and its mechanism of action in the selective killing of cancer cells. Cell Commun Signal. 2019;17(1):54. doi: 10.1186/s12964-019-0358-y.